N+離子注入選育高轉(zhuǎn)化15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮雷斯青霉菌株的研究

離子注入技術(shù)作為一種特殊的物理化學(xué)復(fù)合誘變?cè)?，?986年余增亮等將其應(yīng)用于生物學(xué)以來(lái)，在生物批種改良領(lǐng)域已取得了豐碩成果[1]。作為一種新的誘變?cè)?，低能離子注入和常規(guī)的輻射誘變及化學(xué)誘變有著明顯的差異，常規(guī)的輻射誘變僅僅是利用能量交換，化學(xué)誘變考慮的也只是分子基團(tuán)的交換，而低能離子注入生物體時(shí)同時(shí)存在能量交換、能量沉積、質(zhì)量沉積及電荷交換四大效應(yīng)。由于注入離子的電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合不同，可以提供眾多的誘變條件，使離子注入誘變具有突變譜寬、突變率高的特點(diǎn)，從而可以篩選到符合生產(chǎn)要求、能夠提高產(chǎn)量的突變體[2,3]。

15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮是合成孕二烯酮(Gestodene)的重要中間體[4]，其核心技術(shù)是在左旋乙基甾烯雙酮的C15位上連接一個(gè)α-羥基[5]，而雷斯青霉是對(duì)左旋乙基甾烯雙酮進(jìn)行C15α位羥化的常用菌株[6,7]。

作者采用N+離子注入技術(shù)對(duì)雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC 10490進(jìn)行誘變處理，以期得到適于工業(yè)生產(chǎn)的高轉(zhuǎn)化率突變株，并考察該技術(shù)在霉菌選育方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC 10490，美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g·L-1)：麥芽提取物 20，葡萄糖 20，蛋白胨 1，瓊脂粉 20，pH值自然。

液體培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖 30，玉米漿 10，NaNO32，KH2PO41，K2HPO40.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.02，KCl 0.5，pH值自然。

1.3 雷斯青霉孢子懸液的制備

在無(wú)菌條件下，挑取雷斯青霉菌種沙土孢子適量，均勻接種在斜面培養(yǎng)基表面。置于28℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。取新鮮的雷斯青霉孢子斜面一支，加入10 mL無(wú)菌生理鹽水，洗脫孢子，移入裝有滅菌玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，振蕩30 min，雙層紗布過(guò)濾，得到無(wú)菌絲體的孢子懸液。調(diào)整孢子濃度為1×107個(gè)·mL-1，取上述單孢子懸浮液0.1 mL，均勻涂布于90 mm的滅菌培養(yǎng)皿中間區(qū)域，無(wú)菌風(fēng)吹干。

1.4 低能離子注入

將含有雷斯青霉孢子的培養(yǎng)皿放入低能加速器(離子注入機(jī))靶室，打開培養(yǎng)皿蓋，靶室抽真空。用能量為30 keV的不同劑量的N+離子束進(jìn)行注入。用1 mL無(wú)菌生理鹽水洗脫，適當(dāng)稀釋后涂布在平板培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)2 d，用于單菌落的挑選和存活率的計(jì)算。

1.5 左旋乙基甾烯雙酮15α-羥化實(shí)驗(yàn)

孢子斜面用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，濃度為1.5×107個(gè)·mL-1，按3%接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于28℃、180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)42 h后，按3‰的投料量加入左旋乙基甾烯雙酮和6%的甲醇，繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)120 h。

1.6 分析檢測(cè)

不同時(shí)間取500 μL發(fā)酵液于離心管中，加入等體積乙酸乙酯萃取30 min，12 000 r·min-1離心5 min,取上清液100 μL，揮干乙酸乙酯，加入1000 μL甲醇溶解，用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。高效液相色譜條件：C18柱(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為甲醇∶水(80∶20)，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子注入誘變對(duì)雷斯青霉存活率和突變率的影響(圖1、圖2)

由圖1可知，設(shè)定靶室抽真空時(shí)菌株的存活率為100%，隨著N+注入劑量增加，存活率呈現(xiàn)較明顯的先降后升再降的“馬鞍型”變化趨勢(shì)，這種特有的變化被認(rèn)為是能量、動(dòng)量作用下的損傷效應(yīng)和質(zhì)量、電荷作用下的保護(hù)和刺激綜合作用的結(jié)果。

由圖2可知，N+注入劑量為50×1014ions·cm-2時(shí)正突變率最高，達(dá)14.5%，恰好在“馬鞍型”區(qū)域內(nèi)。超過(guò)50× 1014ions·cm-2后，菌株突變率繼續(xù)增加，而正突變率明顯下降，這可能是因?yàn)?，隨著N+注入劑量的增大，DNA和生物膜等損傷嚴(yán)重導(dǎo)致。

圖1 N+輻照的存活效應(yīng)

圖2 N+離子注入對(duì)菌株突變率及正突變率的影響

2.2 離子注入誘變對(duì)雷斯青霉菌落形態(tài)的影響

考察了N+注入劑量為50×1014ions·cm-2時(shí)菌株的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 離子注入誘變后雷斯青霉的菌落形態(tài)

由圖3可知，在50×1014ions·cm-2N+劑量下出現(xiàn)了5種不同菌落形態(tài)。搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，3株突變株(突變株1、3、4)的轉(zhuǎn)化率高于出發(fā)菌株。其中突變株1轉(zhuǎn)化率最高，其單菌落形態(tài)較大，菌絲體呈白色，且生長(zhǎng)旺盛，孢子呈深綠色且量大，菌落平整，無(wú)褶皺，邊緣整齊，明顯不同于其它突變株。由此可見(jiàn)，可以通過(guò)菌落形態(tài)的差異初步判斷轉(zhuǎn)化率可能較高的菌株，為雷斯青霉提供了良好的初篩方法。

在液體培養(yǎng)基中，突變株1的孢子發(fā)芽時(shí)間要比出發(fā)菌株短，搖瓶培養(yǎng)12 h時(shí)，可以觀察到孢子發(fā)芽后菌絲較出發(fā)菌株更長(zhǎng)，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)至24 h時(shí)，突變株1的菌絲球量明顯高于出發(fā)菌株，說(shuō)明其對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的利用更迅速，生長(zhǎng)速度快于出發(fā)菌株，見(jiàn)圖4。

圖4 出發(fā)菌株與突變株1的菌絲照片

出發(fā)菌株和突變株1的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5。

圖5 出發(fā)菌株與突變株1的生長(zhǎng)曲線

由圖5可知，突變株1的對(duì)數(shù)期較短，孢子接種后42 h菌體量達(dá)到最大值，較出發(fā)菌株提前5 h達(dá)到穩(wěn)定期。

2.3 高轉(zhuǎn)化率菌株的分離

將突變株1進(jìn)行平板分離純化，挑選10株進(jìn)行搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 突變株1分離純化菌株轉(zhuǎn)化性能

由表1可知，其轉(zhuǎn)化率均高于55%，其中突變株50A-8的轉(zhuǎn)化率達(dá)到62.7%。

2.4 突變株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)轉(zhuǎn)化性能最好的突變菌株50A-8連續(xù)傳代，考察其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，該菌株的遺傳性能比較穩(wěn)定。傳代至第8代時(shí)，轉(zhuǎn)化率為61.4%，第9代為61.2%。

3 結(jié)論

雷斯青霉孢子經(jīng)N+離子注入技術(shù)誘變后，其存活率呈典型的“馬鞍型”曲線，最適N+注入劑量為50×1014ions·cm-2，在該劑量下呈現(xiàn)出不同的菌落形態(tài)，從其中菌絲生長(zhǎng)旺盛、孢子量較大的菌落中篩選到一高轉(zhuǎn)化率突變株50A-8，該突變株對(duì)左旋乙基甾烯雙酮的轉(zhuǎn)化率可達(dá)62.7%，為出發(fā)菌株的1.16倍，且遺傳穩(wěn)定性良好。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余增亮．離子束與生命科學(xué)一個(gè)新的研究領(lǐng)域[J]．物理，1997，26(6)：333-338．

[2] 袁成凌，余增亮．低能離子束在生物技術(shù)中的應(yīng)用研究[J]．中國(guó)生物工程雜志，2003，23(4):57-61.

[3] 陳宇，林梓鑫，張峰，等．離子注入微生物的生物效應(yīng)研究[J]．中國(guó)抗生素雜志，1998，23(6)：415-419．

[4] Schlosser D，Irrgang S,Schmauder H P.Steroid hydroxylation with free and immobilized cells ofPenicilliumraistrickiiin the presence ofβ-cyclodextrin[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,1993，39(1):16-20．

[5] Irrgang Sylke，Schlosser Dietmar,Fritsche Wolfgang．Involvement of cytochrome P-450 in the 15α-hydroxylation of 13-ethyl-gon-4-ene-3，17-dione byPenicilliumraistrickii[J]．Steroid Biochem Mol Biol,1997，60(5):339-346．

[6] Irrgang S，Schlosser D,Schmauder H P．The steroid 15α-hydroxylase ofPenicilliumraistrickiiI 477 is inducible[J]．Biotechnology Letters，1992，14(1):33-38．

[7] Schlosser D，Irrgang S，Schmauder H P．Morphological characterization of microenc apsulatedPenicilliumraistrickii477[J]．Acta Biotechnologica，1993，13(2):123-129．