替考拉寧產(chǎn)生菌的抗性篩選及發(fā)酵條件研究

胡海艷，趙培靜，梁淑娃，秦鵬，劉燕珠，夏楓耿

(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

替考拉寧產(chǎn)生菌的抗性篩選及發(fā)酵條件研究

胡海艷，趙培靜，梁淑娃，秦鵬，劉燕珠，夏楓耿*

(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

［目的］通過(guò)對(duì)替考拉寧產(chǎn)生菌的菌種選育及發(fā)酵工藝的研究，提高其對(duì)自身代謝產(chǎn)物的耐受性，進(jìn)而提高替考拉寧的產(chǎn)量。［方法］以替考拉寧產(chǎn)品本身為篩選劑，利用紫外誘變，對(duì)替考拉寧產(chǎn)生菌進(jìn)行耐自身抗性的篩選。將篩選得出的高產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵研究，在發(fā)酵起始將不同型號(hào)的大孔樹脂加入培養(yǎng)基中以吸附發(fā)酵過(guò)程中釋放的替考拉寧，發(fā)酵結(jié)束后用濃度80%甲醇洗滌樹脂，用微生物管碟法測(cè)其洗脫液效價(jià)。［結(jié)果］通過(guò)抗性篩選的方法，獲得比親株發(fā)酵水平提高18%的菌株。在發(fā)酵液培養(yǎng)基中添加7%(w/V)的吸附樹脂Diaion HP－20能有效消除替考拉寧對(duì)自身菌體的抑制作用，使得替考拉寧產(chǎn)量提高3.52倍。［結(jié)論］通過(guò)對(duì)替考拉寧的抗性篩選及向發(fā)酵液中加入吸附樹脂能有效提高菌體對(duì)自身的耐受性，為進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

替考拉寧;游動(dòng)放線菌;抗性變株;吸附樹脂

替考拉寧(Teicoplanin)又稱肽可霉素(Teicomycin A2)，是Parenti等于1978年發(fā)現(xiàn)的一種新的糖肽類抗生素，由游動(dòng)放線菌(Actinoplanesteichomyceticus)產(chǎn)生［1］。它是繼萬(wàn)古霉素之后的又一目前臨床治療多重耐藥菌感染的重要抗生素。大量研究表明，替考拉寧對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌尤其對(duì)多重耐藥(MDR)的金黃色葡萄球菌(MRSA)和腸球菌具有強(qiáng)大的抗菌活性［2－3］。萬(wàn)古霉素和替考拉寧是目前僅有的能有效作用于MRSA的有效藥物。MRAS的世界性問(wèn)題導(dǎo)致萬(wàn)古霉素和替考拉寧的需求量增加［4］。與萬(wàn)古霉素相比，替考拉寧因其毒副作用更低，在體內(nèi)半衰期更長(zhǎng)而更具有優(yōu)勢(shì)［5］。

為了提高替考拉寧的產(chǎn)量，學(xué)者們致力于對(duì)其進(jìn)行菌種篩選和發(fā)酵工藝的改良。金志華等［6］以纈氨酸氧肟酸為篩選劑，篩選出一株每升發(fā)酵液能產(chǎn)生1.8 g替考拉寧的突變株，其產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了50%。Lee［7］通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基，使得替考拉寧產(chǎn)量提高到1.5 g/L。Jung［8］等通過(guò)紫外誘變篩選優(yōu)勢(shì)菌和優(yōu)化上罐發(fā)酵條件，使得替考拉寧產(chǎn)量最終達(dá)到2.8 g/L。進(jìn)一步的研究表明，替考拉寧對(duì)自身菌體具有一定的反饋抑制作用［4，9］。Lee 等［10］在接種時(shí)向培養(yǎng)基中加入0～200 mg/L替考拉寧以考察其對(duì)A.teicomyceticusATCC 31121菌株發(fā)酵的影響。研究表明，當(dāng)添加的替考拉寧濃度為10 mg/L時(shí)，替考拉寧的形成幾乎被完全抑制。筆者通過(guò)對(duì)替考拉寧的抗性篩選及向發(fā)酵液中加入吸附樹脂以吸附一部分產(chǎn)物替考拉寧，從菌體和發(fā)酵條件2個(gè)方面提高菌體對(duì)自身產(chǎn)物的耐受性，進(jìn)而提高替考拉寧產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種。替考游動(dòng)放線菌由廣州市微生物研究所中心實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖1.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，KCl 6.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04 g/L，pH 7.0。種子培養(yǎng)基組成為:糊精4.0 g/L，可溶性淀粉 24 g/L，酵母粉 6.0 g/L，蛋白胨 2.0 g/L，CaCO32.0 g/L，pH 7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:糊精 12 g/L，可溶性淀粉20 g/L，黃豆粉24 g/L，玉米漿16 g/L，Ca-CO32.0 g/L，pH 6.8。供試替考拉寧由廣州市微生物研究所提取純化，經(jīng)HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)其純度和組分符合藥典規(guī)定。

1.2 替考拉寧對(duì)自身菌體的抑制作用考察 將替考拉寧成品配制成一定濃度的溶液，過(guò)濾除菌后涂布到固體培養(yǎng)基上，將未處理的替考拉寧孢子懸液涂布于含有不同濃度的替考拉寧產(chǎn)品的平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察孢子生長(zhǎng)情況。同時(shí)，將不同濃度的替考拉寧產(chǎn)品經(jīng)過(guò)濾除菌后加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種種子液(接種量10%)，28℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后，取樣，測(cè)定其效價(jià)，考察替考拉寧對(duì)發(fā)酵的影響。

1.3 抗性菌株選育 將紫外誘變后的孢子涂布于含特定濃度替考拉寧產(chǎn)品的平板培養(yǎng)基上，篩選抗性突變株。

1.4 發(fā)酵液中吸附樹脂的加入

1.4.1 樹脂的預(yù)處理。選取HZ 801(上海華震科技有限公司生產(chǎn))，Diaion HP-20(日本三菱公司生產(chǎn))。XAD-16、FPA53、PLC 90、PLC 98(美國(guó)Rohm and Haas公司生產(chǎn))為添加至發(fā)酵液中的吸附樹脂。樹脂在使用前，先用濃度100%甲醇浸泡12 h，以除去其中的雜質(zhì)，用純化水洗至中性后，將樹脂放入超聲波清洗器中超聲脫氣，將處理后樹脂加入未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃，30 min滅菌。

1.4.2 發(fā)酵液中加入樹脂的培養(yǎng)條件。從斜面上挖取成熟孢子接入500 ml裝有種子培養(yǎng)基50 ml錐形瓶中，28℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，移取10 ml種子液接入500 ml裝有100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中。發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣，測(cè)定其效價(jià)。

1.5 組分及效價(jià)測(cè)定 組分測(cè)定采用HPLC法［11］;效價(jià)測(cè)定采用微生物管碟法［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 替考拉寧對(duì)自身菌體的抑制作用 配制一定濃度的替考拉寧成品溶液，微膜過(guò)濾除菌，吸取150μl涂布在倒有固體培養(yǎng)基的平皿上，將未經(jīng)處理的替考拉寧孢子懸液涂布其上，培養(yǎng)并觀察菌落的生長(zhǎng)。

從表1可以看出，隨著涂布在平板表面的替考拉寧濃度的增加，孢子開始生長(zhǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度緩慢，當(dāng)涂布有0.012 g替考拉寧時(shí)其自身孢子幾乎不生長(zhǎng)。

表1 替考拉寧產(chǎn)品對(duì)自身菌體生長(zhǎng)的影響

為了進(jìn)一步考察替考拉寧產(chǎn)生菌在發(fā)酵過(guò)程中是否受自身代謝產(chǎn)物的抑制，接種時(shí)向發(fā)酵液中加入0～30 mg/L替考拉寧成品，發(fā)酵培養(yǎng)8 d后測(cè)其效價(jià)。從圖1可以看出，不加替考拉寧的效價(jià)為521.32 U/ml;當(dāng)替考拉寧的添加濃度為5～15 mg/L時(shí)，替考拉寧的效價(jià)呈緩慢增加趨勢(shì);當(dāng)替考拉寧的添加濃度為20 mg/L時(shí)，最終替考拉寧的效價(jià)為306.70 U/ml，下降了41%;當(dāng)替考拉寧的添加濃度為 30 mg/L時(shí)，最終效價(jià)僅有116.62 U/ml，其形成受到嚴(yán)重的抑制作用。

圖1 接種時(shí)發(fā)酵液中加入替考拉寧對(duì)終產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔?/p>

2.2 抗性菌種的選育 以替考拉寧放線菌 (Actinoplanes teichomyceticus)為出發(fā)菌株，制成一定濃度的菌懸液，紫外照射120 s，暗培養(yǎng)2 h，稀釋涂布含有0.012 g替考拉寧的平板上，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑選一定數(shù)量的菌落劃線斜面，比較其發(fā)酵水平。通過(guò)一定數(shù)量的篩選，獲得一株比出發(fā)菌株生產(chǎn)能力高18%的菌株，菌株編號(hào)為GWT-12-043。群體傳代顯示，該菌連傳10代，其效價(jià)水平波動(dòng)較小。

2.3 發(fā)酵液中加入吸附樹脂的發(fā)酵培養(yǎng) 取HZ 801、Diaion HP-20、XAD-16、FPA 53、FPL 90、FPL 98 6 種經(jīng)預(yù)處理的樹脂，加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入樹脂量為5%(W/V)。121℃，30 min滅菌，向其中接入種子液，28℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)8 d后，4 000 r/min，10 min離心，取上清液，測(cè)定效價(jià)，其沉淀用等體積80%甲醇靜態(tài)解析30 min后，測(cè)定解析液效價(jià)。

由表2可知，樹脂HZ 801、樹脂Diaion HP-20和XAD-16均能明顯地提高發(fā)酵液中替考拉寧的效價(jià)，分別是不添加樹脂發(fā)酵液的1.66、3.28 和2.07 倍;FPA 53、FPL 90 和 FPL 98的效果較差。吸附效果最好的樹脂Diaion HP-20，其發(fā)酵液上清液的效價(jià)為66.30 U/ml，吸附率達(dá)到96.45%。

表2 不同樹脂解析液和發(fā)酵液中替考拉寧的效價(jià) U/ml

為了探索加入發(fā)酵液中吸附樹脂的最適比例，分別選取價(jià)格最低廉的樹脂HZ 801、吸附能力最好的樹脂Diaion HP-20，按不同比例加入發(fā)酵液中，接種培養(yǎng)8 d后測(cè)定其效價(jià)。由表3可知，添加7%樹脂HZ 801時(shí)吸附效果最好，替考拉寧的效價(jià)最高;當(dāng)添加7%樹脂Diaion HP-20時(shí)，其樹脂洗脫液效價(jià)達(dá)到2 173.20 U/ml，吸附率達(dá)到97.88%，已經(jīng)逼近Jung 等［8］所報(bào)道的 2.8 g/L。

表3 培養(yǎng)基中加入不同濃度樹脂HZ 801和Diaion HP-20的效果U/ml

雖然樹脂Diaion HP-20對(duì)產(chǎn)替考拉寧的吸附量最大，但價(jià)格較昂貴，工業(yè)用價(jià)格約為200元/L，而國(guó)產(chǎn)樹脂HZ801價(jià)格僅在10元/L左右。采用哪種型號(hào)的樹脂，還需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行具體分析。

3 討論

抗生素產(chǎn)生菌對(duì)其自身所產(chǎn)抗生素的耐受能力不同，高產(chǎn)菌株的耐受能力大于低產(chǎn)菌株［13］。該研究通過(guò)用自身抗生素替考拉寧結(jié)合紫外誘變來(lái)篩選高產(chǎn)菌株，替考拉寧效價(jià)提高18%。在發(fā)酵過(guò)程中，替考拉寧的積累會(huì)抑制自身菌體的生長(zhǎng)［4］。為了減弱發(fā)酵液中替考拉寧對(duì)自身菌體生長(zhǎng)的抑制作用，在接種前向培養(yǎng)基中加入吸附樹脂與菌體一起發(fā)酵培養(yǎng)。研究表明，離子交換樹脂Diaion HP-20的吸附作用最好，其吸附率達(dá)到96%以上，只有不到4%的替考拉寧分布于發(fā)酵液中，大大降低了發(fā)酵液中替考拉寧的濃度，從而減輕了對(duì)自身菌體的抑制作用，進(jìn)一步提高替考拉寧的產(chǎn)量。

徐波等［14］利用放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的基因重排育種技術(shù)，篩選出一株使替考拉寧產(chǎn)量提高65.3%的融合菌株。在下一步的工作中，將繼續(xù)進(jìn)行菌種的篩選工作，并且嘗試新的選育方法，以提高菌體對(duì)替考拉寧的耐受性，甚至實(shí)現(xiàn)不需要通過(guò)向發(fā)酵液中加入樹脂即可以達(dá)到高產(chǎn)量的目的。

［1］PARENTIF，BERETTA G，BERTIM，et al.Teichomycins，new antibiotics fromActinoplanes teichomyceticusNov.Sp.I.Description of the producer strain，fermentation studies and biological properties［J］.The Journal of Antibiotics，1978，31(4):276 －283.

［2］BARDONEM R，PATERNOSTER M，CORONELLIC.Teichomycins，new antibiotics fromActinoplanes teicomyceticusnov.sp［J］.Antibiot，1978，31:170－177.

［3］BROGDENRN，PETERSDH.Teicoplanin.A reappraisal of itsantimicrobial activity，pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy［J］.Drugs，1994，47:823 －854.

［4］HEYDORN A，TRINE S J，NIELSEN J.Growth and production kinetics of a teicoplanin producing strain ofActinoplanes teicomyceticus［J］.JAntibiot，1999，52:40 －44.

［5］WOOD M J.The comparative efficacy and safety of teicoplanin and vancomycin［J］.Antimicrob Chemother，1996，37:209 －222.

［6］JIN Z H，WANGM R，CEN P L.Production of teicoplanin by valine analogue-resistantmutant strains ofActinoplanes teichomyceticus［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2002，58:63 －66.

［7］LEE JC，MIN JW，PARK D J，et al.Large-scale fermentation for the production of teicoplanin from a mutant ofActinoplanes teichomyceticus［J］.Microbiol Biotechnol，2005，15:787 －791.

［8］JUNGH M，KIM SY，PRABHU P，etal.Optimization of culture conditions and scale-up to plant scales for teicoplanin production byActinoplanes Teichomyceticus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，80:21 －27.

［9］FAZELIM R，COVE JH，BAUMBERG S.Physiological factors affecting streptomycin production byStreptomycesgriceusATCC 12475 in batch and continuous culture［J］.FEMSMicrobiology Letters，1995，126:55 －62.

［10］LEE JC，PARK H R，PARK D J，etal.Improved production of teicoplanin using adsorbent resin in fermentations［J］.Letters in Applied Microbiology，2003，37(3):196 －200.

［11］蔣沁，倪會(huì)敏，石磊，等.HPLC法快速檢測(cè)發(fā)酵液中替考拉寧含量［J］.天津藥學(xué)，2006，18(2):21 －23.

［12］CHEN Y，WANG SY，HUG Y.Determination of teicoplanin in injection by bioassay［J］.Chinese Pharmaceutical Journal，2002，37(4):302 －304.

［13］白芳靜，左良成，尤春靜，等.替考拉寧產(chǎn)生菌耐自身抗性變株的選育［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2011，32(7):98 －99.

［14］徐波，王明蓉，夏永楊，等.應(yīng)用基因組重排育種新方法篩選替考拉寧高產(chǎn)菌［J］.中國(guó)抗生素雜志，2006，31(4):237 －242.

Resistance Screening of Teicoplanin-Producing Strains and Fermented Condition

HU Hai-yan，XIA Feng-geng et al (Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou，Guangdong 510663)

［Objective］Strain selection and fermentation technology research were studied to limit self repression，so as to increase teicoplanin production.［Method］Taking teicoplanin itself as the selective agent，resistance screeningwasmade on the teicoplanin-producing strainActinoplanesteichomyceticusthrough ultravioletmutagenesis.Fermented condition was studied by adding various adsorbent resins to the culture broth for teicoplanin adsorption.The adsorbed teicoplanin was extracted from the resins via 80%methanol after fermentation.Antibiotic activity was quantified by the cylinder platemethod.［Result］ The fermentation level of the obtained strain was 18%higher than that of parent strain.Diaion HP-20 was themost effective adsorbent resin when added at the concentration of 7%(w/V)in the inoculation stage，with a 3.52-fold increase in the quantities of teicoplanin.［Conclusion］It is feasible to limit self repression by using resistance screening and adding adsorbent resin into fermentation broth.The results of this study can provide theoretical basis for the industrial production of teicoplanin.

Teicoplanin;Actinoplanesteicomyceticus;Resistantmutant;Adsorbent resin;Diaion HP-20

S188+.8

A

0517－6611(2014)15－04561－02

胡海艷(1985－)，女，湖南醴陵人，工程師，碩士，從事微生物發(fā)酵、酶方面的研究。*通訊作者，高級(jí)工程師，從事微生物發(fā)酵、食品添加劑、藥物開發(fā)方面的研究。

2014-04-29