響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳多糖與三價鉻螯合工藝

尹紅力， 王振宇,2*， 梁薇薇， 李婷婷， 劉 冉， 張乃珣

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090)

響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳多糖與三價鉻螯合工藝

尹紅力1， 王振宇1,2*， 梁薇薇1， 李婷婷1， 劉 冉1， 張乃珣1

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090)

[目的]優(yōu)化黑木耳多糖和三價鉻螯合工藝。[方法]采用分光光度法考察黑木耳多糖與三價鉻的質(zhì)量比、螯合時間、三價鉻的初始濃度3個因素對其螯合率的影響，并通過Box-Behnken試驗設(shè)計對試驗數(shù)據(jù)進行二次響應(yīng)面分析，優(yōu)化黑木耳多糖與三價鉻的螯合工藝。[結(jié)果]試驗表明，木耳多糖與三價鉻的最佳螯合工藝條件為：木耳多糖與三價鉻的質(zhì)量比為2.2∶1，螯合時間6.18 h，三價鉻的初始濃度為5.96 mg/ml，在該條件下螯合率為41.56%。[結(jié)論]應(yīng)用響應(yīng)面法所得到的黑木耳多糖-鉻(Ⅲ)螯合物的合成工藝參數(shù)是可行的，可為黑木耳多糖與三價鉻螯合物的進一步開發(fā)利用提供參考。

黑木耳多糖；三價鉻；螯合；響應(yīng)面法

多糖(polysaccharide，簡稱PS)是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，目前已有300多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離[1]。研究表明，黑木耳多糖具有許多重要的生理功能，如：降血糖[2-3]、降血脂[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗衰老[8]、提高機體免疫等功能。鉻是目前研究較多且結(jié)論較為一致的一種重要的微量元素[9]，人體缺鉻會導(dǎo)致一系列的代謝失常及病變[10-11]。大量研究表明，微量元素鉻在糖尿病診斷、治療及預(yù)防中有重要的作用[12-13]。

隨著人們生活水平的提高，糖尿病成為危害人類健康的一大疾病，且發(fā)病率逐年上升，引起人們的廣泛關(guān)注[14]。研究表明，多糖與金屬離子的螯合物具有某些特殊的生理生化功能[15-16]，多糖螯合物不僅能夠發(fā)揮黑木耳多糖的強大生理功能，同時能夠作為一種金屬補充劑，有降血糖[17]、補血、補鋅等功效。目前已經(jīng)報道了黑木耳多糖與Fe(Ⅱ)、Ze、Ag等螯合物的制備工藝[18-20]。鉻在可食用領(lǐng)域的研究多數(shù)以蛋白質(zhì)、多肽與鉻螯合為主，少有多糖與鉻進行螯合的相關(guān)報道[21]，筆者以東北地道黑木耳作為原料提取黑木耳多糖，充分發(fā)揮資源優(yōu)勢，并且與鉻螯合，通過考察影響其螯合率的主要因素，并應(yīng)用響應(yīng)面法獲得最佳提取工藝，為其在食品、醫(yī)藥、保健品等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 黑木耳，黑龍江省海林市北味黑木耳。主要試劑：無水乙醇、氯化鉻、硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉，均為分析純。主要儀器：恒溫水浴鍋， 上海普渡生化科技有限公司；精密pH計，廣州三贏儀器公司；DHG-9240鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；UT-1810PC紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；JA2003電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；PC20E-G電磁爐，上海奔騰企業(yè)有限公司；721分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BCD-202GNS(E) 三星電冰箱，三星電器有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TDL-40B-W臺式低速大容量離心機，河南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取方法。原料預(yù)處理→熱水浴浸提(料液比1∶50 g/ml、提取溫度為80 ℃、提取時間4 h)→離心(4 000 r/min，10 min)→上清液抽濾→濃縮→脫色→Sevage法除蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1；Savage試劑∶多糖溶液=1∶4)→醇沉過夜→離心→透析→凍干→多糖粗品。

1.2.2 三價鉻溶液的配制。氯化鉻溶液，分別稱取2.562、3.074、3.587 g氯化鉻分別溶于少量水中，移入100 ml容量瓶，加蒸餾水定容至100 ml，搖勻，分別配成5、6、7 mg/ml的三價鉻溶液，儲存于棕色瓶放置在冰箱中待用。磷酸溶液的配制：磷酸與水體積比是1∶3。

1.2.3 黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成與螯合率的測定。準(zhǔn)確稱取一定量的黑木耳多糖，加入待螯合的Cr(Ⅲ)溶液，置于振蕩培養(yǎng)箱中，25 ℃，150 r/min，醇沉取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋出乙醇，移取旋完后的上清液10 ml于25 ml錐形瓶中，加入5 ml磷酸，蒸餾水定容，分光光度計測量OD值，計算Cr(Ⅲ)的質(zhì)量濃度。試驗中的pH用稀硫酸或稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)[22]。

螯合率的計算公式：A(%)=(m0-m)/m0×100%

式中：A表示螯合率，m0表示螯合前溶液中Cr(Ⅲ)的質(zhì)量(g)，m表示螯合后溶液中Cr(Ⅲ)的質(zhì)量(g)。

1.3 三價鉻標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.500 g氯化鉻，用蒸餾水溶解并定容至100 ml容量瓶中。配成1.95 mg/ml的三價鉻溶液，分別按表1進行配置操作加樣后，定容至25 ml。充分混勻后以管1為空白對照，600 nm波長下測各管的吸光度，繪制吸光度—三價鉻含量曲線。

表1 鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 ml

從圖1中可得,Cr(Ⅲ)的質(zhì)量與吸光度值之間的線性關(guān)系為：y=0.011x-0.001，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.999，符合要求。表明Cr(Ⅲ)在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于對Cr(Ⅲ)的定量測定。

圖1 三價鉻標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 黑木耳多糖與三價鉻螯合條件的單因素試驗 設(shè)定pH為3，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，固定其他條件，分別考察多糖與三價鉻的質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、螯合時間(1、2、3、4、5、6 h)、三價鉻初始濃度(1、2、3、4、5、6、7 mg/ml)對其螯合率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化螯合工藝 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以質(zhì)量比、螯合時間、初始濃度3個因素為自變量，螯合率為響應(yīng)值，進行3因素3水平響應(yīng)面試驗，使用MINITABL16軟件，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，對黑木耳多糖與三價鉻的最佳螯合工藝進行優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 螯合時間對螯合率的影響。在150 r/min的條件下，Cr(Ⅲ)初始濃度為5 mg/ml，pH為3，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質(zhì)量比為5∶1，常溫下分別在1、2、3、4、5、6 h反應(yīng)后取溶液，醇沉后，取上清液進行Cr(Ⅲ)含量的測定，計算螯合率，以此確定最佳螯合時間。

表2 響應(yīng)面分析因素水平編碼

由圖2可知，螯合時間在1～5 h范圍內(nèi)，隨著時間的增加，螯合反應(yīng)就越加充分，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的螯合作用也越徹底，螯合率逐漸增加。在時間達到5 h時得到最大值，螯合率為32.3%。故此單因素的最優(yōu)螯合時間為5 h。

圖2 螯合時間對螯合率的影響

2.1.2 Cr(Ⅲ)濃度對螯合率的影響。在150 r/min的條件下，Cr(Ⅲ)初始濃度分別為1、2、3、4、5、6、7 g/L，pH為3，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質(zhì)量比為5∶1，常溫下螯合2 h后取溶液，醇沉后，取上清液進行Cr(Ⅲ)含量的測定，計算螯合率，以此確定最佳螯合比例。

由圖3可知，隨著Cr(Ⅲ)濃度的增加，螯合率上升，當(dāng)濃度為6 mg/ml時，螯合率達到最大，為38.45%。由此得出，Cr(Ⅲ)初始濃度為6 mg/ml時為最佳濃度。

圖3 Cr(Ⅲ)濃度對螯合率的影響

2.1.3 黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質(zhì)量比對螯合率的影響。在150 r/min的條件下，Cr(Ⅲ)初始濃度為5 mg/ml，pH為3，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，常溫下螯合2 h后取溶液，醇沉后，取上清液進行Cr(Ⅲ)含量的測定，計算螯合率，以此確定最佳螯合比值。

由圖4可知，在黑木耳多糖與三價鉻的質(zhì)量比為2∶1范圍內(nèi)時，隨著比值的增加，螯合率有所上升，在質(zhì)量比為2∶1時螯合率達到最大值，為35.50%。此后，隨著黑木耳多糖質(zhì)量的增加，螯合率降低。由此得出，質(zhì)量比為2∶1時為最佳。

圖4 黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質(zhì)量比對螯合率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化螯合條件結(jié)果 利用Box-Behnken試驗設(shè)計，確定3因素3水平，共15個試驗，見表3。其中12個析因點，3個零點。中心點重復(fù)試驗用來估計試驗誤差， 以螯合物的螯合率為響應(yīng)值做響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

將試驗結(jié)果使用Design-Expert 7.0數(shù)理統(tǒng)計軟件進行回歸擬合，可得到響應(yīng)值Y和各個因子(X1，X2，X3)之間的二次多元回歸方程模型為：Y=2.061 3X1+2.931 2X2-0.140 0X3+1.110 00X1X2+1.027 50X1X3-0.407 500X2X3-8.833 33X12-1.218 33X22-6.160 83X32-254.809。

對表4回歸分析數(shù)據(jù)進行方差分析可得：F回歸=294.90,P回歸=0.000;F線性=177.61,P線性=0.000;F平方=690.15,P平方=0.000;F交互=16.95,P交互=0.005;F失擬=3.57,P失擬=0.227。由此可知，黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的螯合率回歸方程的失擬項P值大于0.05，且響應(yīng)面模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.998 1，說明模型的擬合度很好。因此，可用此回歸模型代替真實的試驗點進行分析，預(yù)測該螯合物的螯合率。由F檢驗值可以得出3個影響因素對螯合物螯合率的影響程度大小依次為：螯合時間>質(zhì)量比>Cr(Ⅲ)初始濃度。關(guān)于3個影響因素的相互作用，由方差分析可知，RSM模型的一次項X1(P=0.000 0)、X2(P=0.000 0)和二次項X12(P=0.000 0)、X22(P=0.000 0)、X32(P=0.000 0)以及交互項X1X2(P=0.004)、X1X3(P=0.005)系數(shù)達到了極顯著的水平，交互項X1X3(P=0.032 1)的系數(shù)顯著，而X1X2(P=0.123)，X3(P=0.409)項系數(shù)不顯著。

表4 響應(yīng)面分析優(yōu)化后模型的系數(shù)檢驗

注：R2=0.998 1。

根據(jù)回歸分析做出各影響因素之間相互作用的響應(yīng)面圖(圖5～7)，以確認(rèn)黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質(zhì)量比(X1)、螯合時間(X2)和Cr(Ⅲ)的初始濃度(X3)3個因素對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合率(Y)的影響?？芍?，黑木耳多糖與三價鉻的質(zhì)量比與螯合時間對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)的螯合效果影響最大，Cr(Ⅲ)的初始濃度對螯合效果影響較小。依據(jù)回歸模型的數(shù)學(xué)分析并綜合響應(yīng)圖確定螯合的最佳工藝參數(shù)為：木耳多糖與三價鉻的質(zhì)量比為2.2∶1，螯合時間6.18 h，三價鉻的初始濃度為5.96 mg/ml。

圖5 質(zhì)量比和Cr(Ⅲ)初始濃度交互作用對螯合率影響的等高線與響應(yīng)面

圖6 時間和Cr(Ⅲ)初始濃度交互作用對螯合率影響的等高線與響應(yīng)面

圖7 時間和質(zhì)量比交互作用對螯合率影響的等高線與響應(yīng)面

2.3 驗證試驗 回歸模型預(yù)測的得率理論值為41.61%。為了驗證模型的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成。在此條件下試驗重復(fù)3次，3次平行試驗的螯合率分別為41.33%、41.77%和41.59%，平均為41.56%，與理論預(yù)測值相比相對誤差為0.01%，預(yù)測值與實際值接近。因此，通過響應(yīng)面優(yōu)化法得到的黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成工藝可以用來指導(dǎo)實際生產(chǎn)。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面法對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成反應(yīng)條件進行優(yōu)化，以分光光度法測定黑木耳多糖與三價鉻螯合的螯合率作為評價指標(biāo)，對各因素水平進行分析，得出黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物合成的優(yōu)化條件為：黑木耳多糖與三價鉻的質(zhì)量比為2.2∶1，螯合時間為6.18 h，三價鉻的初始濃度為5.96 mg/ml，在該條件下螯合率為41.56%。工藝驗證試驗表明，最優(yōu)工藝條件可靠。目前國內(nèi)外對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)的螯合物的研究尚沒有明確的報道，因此該研究對于黑木耳多糖拓寬應(yīng)用領(lǐng)域，及在食品、醫(yī)藥、保健品等方面的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

[1] 馬寶瑕,陳新,鄧軍娥.中藥多糖研究進展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(6):360-362.

[2] 宗燦華,于國萍.黑木耳多糖對糖尿病小鼠降血糖作用[J].食用菌雜志,2007(4):60-61.

[3] 韓春然,馬永強,唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006,25(5):111-114.

[4] 王獻友,陳培云,吳廣臣，等.黑木耳多糖提取及其藥理活性的研究進展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012,43(5):683-687.

[5] 孫暢,姜明,段旭彤，等.黑木耳的保健和藥用價值以及開發(fā)前景分析[J].科技視界，2012，5(1):17-18.

[6] MISAKI A,KAKUTA M.Studies on interrelation of structure and anti tumor effeets of polysaccharides: antitumor action of periodatemodifled branched(1-3)-β-D-glucan of Auricularia Auricula-judae,and polysaccharides confaining(l-3)glyeosidielinkages[J].Carbohydrate Researeh,1981,92:115-120.

[7] 黃濱南,張秀娟. 黑木耳多糖對人紅白血病 K562 細(xì)胞周期和凋亡的影響[J].中成藥，2010,32(5):727-730.

[8] 朱磊,王振宇.黑木耳多糖對小鼠抗疲勞作用的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報,2008,30(4):430-432.

[9]朱定祥.保健食品中鉻及其化合物的應(yīng)用研究[J].廣東微量元素科學(xué),2009,16(3):11-15.

[10] 吳憲瑞,孔令員.黑木耳多糖的醫(yī)療保健價值[J].林業(yè)科技,1996,21(3):322-323.

[11] BUFFIE J C,ROBERTG U,JOHN B V.A comparison of the insulin sensitive transport of chromiumin healthy and model diabetic rats[J].Journal of Inorganic Biochemistry, 2004,98:522-533.

[12] CEFALU W T, HU F B. Role of chromium in human health and in diabetes[J].Diabetes Care,2004,27(11):2741-2751.

[13] 張瑞敬,陶成玉,羅云虎，等.血清中微量元素三價鉻的含量與糖尿病的關(guān)系分析[J].微量元素與健康研究,2011,28(4):9-10.

[14] WILD S,TOGLIC G,GREEN A,et al.GIobal prevalence of diabetes;estimates for the year 2000 and projections for 2030[J].Diabetes Care,2004,27(5):1047-1053.

[15] 馬利華,秦衛(wèi)東,陳學(xué)紅，等.金針菇多糖-Fe(Ⅱ)螯合物的制備及抗氧化活性[J].食品科學(xué),2010,31(20):202-207.

[16] 趙兵,徐海清.枸杞多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及理化性質(zhì)的初步研究[J].中成藥,2008,30(8):1245-1246.

[17] 鄧毅,尹龍萍,趙愛華，等.黃芪多糖鉻絡(luò)合物的合成及其降血糖活性的初步研究[J].食品科學(xué),2007,28(6):317-320.

[18] 趙鑫,周芳,王振宇.黑木耳多糖-銀離子螯合物的制備工藝研究[J].中國林副特產(chǎn),2011(2):7-9.

[19] 李公斌,王振宇.黑木耳多糖與Fe(Ⅱ)螯合物的制備工藝及紅外光譜研究[J].食品工業(yè)科技,2006(5):136-138.

[20] 李公斌,王振宇,朱磊.黑木耳多糖與Zn(Ⅱ)鰲合物的制備工藝及紅外光譜分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,34(3):66-89.

[21] YANG X, PALANICHAY K, ONTKO A C, et al. A newly synthetic chromium complex-chromium(phenylalanine) 3 improves insulin responsiveness and reduces whole body glucose tolerance[J].FEBS Letters,2005,579(6):1458-1464.

[22] 石德芝,李碩凡.分光光度法測定電鍍液中的三價鉻[J].廣州化工，2009(6):98-101.

Study on the Optimization of ChelatingAuriculariaauricularPolysaccharides and Chromium(Ⅲ) by Response Surface Methodology

YIN Hong-li, WANG Zhen-yu et al

(Department of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; Department of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150090)

[Objective] Optimization ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ) chelate technology. [Method] The effects of three independent variables (the quality ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ), chelating time and chromium(Ⅲ) concentration of initial) with spectrophotometric method. And the chelation process were further optimized by response surface methodology (RSM) based on a Box-Behnken design. [Result] The results showed that the optimum extraction conditions were as follows: the quality ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ) is 2.2∶1, chelating time is 6.18 h. Chromium(Ⅲ) concentration of initial is 5.96 mg/ml. Under the optimized conditions, chelating rate is 41.56%. [Conclusion] It is feasible to optimize the chelation processing ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ). Given that, it could provide several references for further research on detection of it.

Auriculariaauricularpolysaccharides; Chromium(Ⅲ); Chelating; Response surface methodology

尹紅力(1990- )，女，山東陵縣人，碩士研究生，研究方向：功能性食品的研究與開發(fā)。*通訊作者，教授，博士，從事天然產(chǎn)物分離、功能性食品及生物活性材料研究。

2014-04-28

S 646.6

A

0517-6611(2014)15-04830-04