胎衣不下奶牛胎兒胎盤(pán)中IL-2含量的測(cè)定

馬清河,劉榮欣,陳 斌,王士哲,李海燕,姜國(guó)均*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州 073000;2.河北省定州市農(nóng)牧局,河北定州 073000)

胎衣不下奶牛胎兒胎盤(pán)中IL-2含量的測(cè)定

馬清河1,劉榮欣1,陳 斌1,王士哲2,李海燕2,姜國(guó)均1*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州 073000;2.河北省定州市農(nóng)牧局,河北定州 073000)

通過(guò)對(duì)胎盤(pán)組織中IL-2的含量檢測(cè),探討奶牛發(fā)生胎衣不下的免疫學(xué)機(jī)制。將20頭奶牛分為健康對(duì)照組和胎衣不下組,采集健康奶牛和胎衣不下奶牛的胎兒胎盤(pán),制備胎盤(pán)組織勻漿液,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)其中的IL-2的含量。結(jié)果表明,胎衣不下組奶牛胎盤(pán)組織中IL-2的含量極顯著高于健康組(P＜0.01),說(shuō)明胎盤(pán)組織中IL-2含量與奶牛發(fā)生胎衣不下有密切關(guān)系。

胎衣不下;胎盤(pán);IL-2;奶牛

胎衣不下(Placenta retention)又稱(chēng)胎衣滯留、息胞。母牛分娩后,經(jīng)過(guò)12 h胎衣還未全部排出,即為胎衣不下。胎衣不下是奶牛常見(jiàn)的產(chǎn)科疾病之一,發(fā)病率高達(dá)10%～25%[1]。據(jù)河北、北京等有關(guān)單位統(tǒng)計(jì),在炎熱季節(jié)部分奶牛場(chǎng)奶牛胎衣不下發(fā)病率在70%以上,其中88%繼發(fā)感染子宮內(nèi)膜炎,繼而發(fā)生不孕和產(chǎn)奶量下降,并容易出現(xiàn)乳房炎,嚴(yán)重影響奶牛的生產(chǎn)性能[2]。

白細(xì)胞介素2(IL-2)主要由 T細(xì)胞及胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生,具有促進(jìn)妊娠和破壞妊娠雙重作用。研究表明[3],IL-2主要參與子宮黏膜免疫排斥反應(yīng),不利于妊娠的維持。流產(chǎn)模型母鼠懷孕時(shí)母胎界面表達(dá) IL-2 mRNA,并產(chǎn)生 IL-2、IFN-γ和 TNF-α,而正常鼠無(wú)此現(xiàn)象。給正常懷孕小鼠注射IL-2后可引起附植障礙,并導(dǎo)致流產(chǎn)或流產(chǎn)率提高。但是,適量的IL-2是胚胎發(fā)育所必需的。懷孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞能表達(dá)IL-2 mRNA,而IL-2一方面能刺激蛻膜T細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GMCSF),促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,另一方面能激活γ-δ T 細(xì)胞,從而分泌 TGF-β1,維持妊娠期的免疫抑制作用。另有研究表明,褪黑激素(MLT)可能刺激T H-2型細(xì)胞釋放IL-2,刺激樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell,DC)釋放IL-12,從而保持依賴TH-1型細(xì)胞因子的細(xì)胞免疫功能。

胎盤(pán)是尿膜絨毛膜及子宮黏膜發(fā)生聯(lián)系所形成的結(jié)構(gòu)。胎盤(pán)雖然是一個(gè)暫時(shí)性器官,但在妊娠過(guò)程中起著重要作用,它可通過(guò)屏障作用有效的執(zhí)行物質(zhì)交換、新陳代謝及內(nèi)分泌和免疫等重要功能。胎盤(pán)組織中大量免疫細(xì)胞因子,它們直接或間接的參與胎盤(pán)的代謝,在胎盤(pán)的發(fā)育和排出過(guò)程中具有重要作用。研究表明,胎衣不下與血液流變學(xué)、血液中激素水平等都有密切的關(guān)系[4-5],但與胎盤(pán)組織局部免疫細(xì)胞因子水平相關(guān)性的研究少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)胎衣不下奶牛和正常奶牛胎盤(pán)組織IL-2含量的差異,探索胎衣不下發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)用奶牛由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬奶牛場(chǎng)提供,胎次在1胎～4胎,供試牛均在正常飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑和儀器 IL-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒,美國(guó)ADL公司生產(chǎn);680型酶標(biāo)儀由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn);MIKRO 22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)由德國(guó)Hettich公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 按年齡、胎次、體質(zhì)狀況和分娩期接近的原則,選用胎衣不下奶牛和產(chǎn)后健康奶牛各10頭,設(shè)為胎衣不下組和健康組。

健康奶牛標(biāo)準(zhǔn)為:營(yíng)養(yǎng)中等以上,產(chǎn)程順利,自然分娩,產(chǎn)后胎衣在12 h內(nèi)排出,產(chǎn)前產(chǎn)后均無(wú)合并癥、并發(fā)癥,犢牛健康。

奶牛胎衣不下標(biāo)準(zhǔn):自然分娩,胎衣在產(chǎn)后12 h內(nèi)不能排出或不能完全排出。

1.2.2 樣品的采集和處理

1.2.2.1 健康組奶牛 選取胎兒胎盤(pán)上的子葉作為試驗(yàn)材料。在自然狀態(tài)下,胎衣完全從奶牛子宮脫離時(shí),迅速采集最后脫離子宮的新鮮干凈子葉,用標(biāo)準(zhǔn)封口袋密封,編號(hào)后置-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.2.2 胎衣不下組奶牛 在確診奶牛發(fā)生胎衣不下后,實(shí)施外科手術(shù)剝離滯留在子宮內(nèi)的胎衣。選取剝離的新鮮子葉用標(biāo)準(zhǔn)封口袋密封,編號(hào)后置-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.3 檢測(cè)項(xiàng)目

1.2.3.1 對(duì)奶牛主要臨床指標(biāo)的觀察 觀察奶牛胎衣不下的發(fā)生率和子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率,記錄胎衣排出時(shí)間、惡露排盡時(shí)間、首次發(fā)情時(shí)間、受孕時(shí)間和產(chǎn)奶量等。

1.2.3.2 胎盤(pán)組織中IL-2的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。將冷凍保存的子葉放入液氮中,1 h后取出,在研缽中充分研磨成勻漿。取5 mL勻漿在低溫冷凍離心機(jī)中以10 000 r/min離心3 min,取上清液按照IL-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程,計(jì)算各樣品中IL-2的含量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2000軟件,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 奶牛主要臨床指標(biāo)的觀察結(jié)果

健康對(duì)照組10頭奶牛分娩后惡露排出形狀和時(shí)間正常,均在產(chǎn)后90 d(3個(gè)發(fā)情期)內(nèi)受孕,受孕率100%;胎衣不下組有3頭奶牛在產(chǎn)后90 d內(nèi)受孕,其余7頭中有6頭發(fā)生明顯子宮炎,后雖用抗生素進(jìn)行治療,但在產(chǎn)后90 d內(nèi)未受孕,另有一頭沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯子宮炎癥,但在產(chǎn)后90 d內(nèi)也未受孕,疑似隱形生殖系統(tǒng)炎癥。胎衣不下組的總受孕率為30%,極顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 奶牛產(chǎn)后主要臨床指標(biāo)觀察結(jié)果Table 1 The observation results of clinical manifestation in post partum cows

2.2 胎盤(pán)組織中IL-2的含量變化

胎衣不下組奶牛胎盤(pán)組織中IL-2的含量高于于健康對(duì)照組,差異極顯著(P＜0.01)。試驗(yàn)表明,胎盤(pán)組織中IL-2含量的降低與奶牛胎衣不下的發(fā)生關(guān)系密切(表2)。

表2 奶牛胎盤(pán)組織中IL-2的含量變化Table 2 The change of level of IL-2 in the placenta of cows pg/mL

3 討論

胎衣不下的發(fā)生,從生理學(xué)上來(lái)說(shuō)是母體胎盤(pán)和胎兒胎盤(pán)吻合部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)及粘連。從免疫學(xué)上來(lái)說(shuō),Th1型細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫及局部炎癥反應(yīng),特別是導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)[6],非常不利于胎衣排出,所以Th1型細(xì)胞因子作為促炎因子對(duì)胎盤(pán)間發(fā)生炎癥反應(yīng)及黏連癥狀起著很關(guān)鍵的作用。

胎兒胎盤(pán)除了滋養(yǎng)胎兒的作用外,同時(shí)也是一種功能復(fù)雜的免疫器官。其中含有豐富免疫職能細(xì)胞,主要有自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞,它們分泌多種細(xì)胞因子,各種細(xì)胞因子間相互作用,構(gòu)成母胎界面免疫微環(huán)境的復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)[7]。根據(jù)輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th)分泌細(xì)胞因子的不同優(yōu)勢(shì)效應(yīng),將其分為T(mén)h1和 Th2型,Th1型以分泌白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α等細(xì)胞因子為主,Th2型細(xì)胞以分泌IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子為主。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞能分泌上述多種細(xì)胞因子[8]。在正常情況下,需要母體生殖系統(tǒng)中Th1/Th2細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)才能順利的發(fā)動(dòng)分娩、將胎兒娩出及胎衣排出。整個(gè)產(chǎn)程就是胎盤(pán)絨毛膜的滋養(yǎng)層細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞凋亡萎縮的過(guò)程[9],當(dāng)這兩類(lèi)細(xì)胞因子失去平衡時(shí),就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡速度的增加或減緩,使產(chǎn)程出現(xiàn)問(wèn)題,發(fā)生胎衣不下。

IL-2主要由T細(xì)胞及胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生,具有促進(jìn)妊娠和破壞妊娠雙重作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[3],IL-2主要參與子宮黏膜免疫排斥反應(yīng),不利于妊娠的維持。啟動(dòng)分娩時(shí),IL-2含量會(huì)增加,但I(xiàn)L-2過(guò)度增高或當(dāng)胎兒娩出后IL-2含量高于正常水平的話,則容易發(fā)生母子胎盤(pán)界面間炎性反應(yīng),導(dǎo)致胎衣不下。另外,子宮中IL-2含量過(guò)高會(huì)引起早產(chǎn)或流產(chǎn),此類(lèi)母牛更容易發(fā)生胎衣不下,這也說(shuō)明IL-2含量過(guò)高是導(dǎo)致胎衣不下的主要細(xì)胞因子。本次試驗(yàn)中胎衣不下組 IL-2含量極顯著高于健康對(duì)照組,說(shuō)明IL-2是引發(fā)胎衣不下的主要細(xì)胞因子。

營(yíng)養(yǎng)缺乏、感染、應(yīng)激或遺傳因素均可導(dǎo)致Th1型細(xì)胞因子分泌增加,引起胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率增高,導(dǎo)致胎盤(pán)組織激素合成能力降低[8]。由于雌激素相當(dāng)一部分是胎盤(pán)組織分泌的,所以雌激素的合成分泌必然降低。大量試驗(yàn)表明,胎衣不下的奶牛血液中雌激素含量顯著低于正常奶牛,這可以證明上述推論成立[10]。又有研究表明雌激素能夠有效抑制胎盤(pán)組織Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。也就是說(shuō)Th1型細(xì)胞因子分泌增加導(dǎo)致胎盤(pán)組織中雌激素合成分泌降低,而雌激素合成分泌降低又減少了對(duì)Th1型細(xì)胞因子分泌的抑制,最終通過(guò)這種反饋效應(yīng)促使胎盤(pán)組織炎性反應(yīng)加重,進(jìn)而阻礙胎衣正常排出。

IL-2、TNF-α和IFN-γ在體內(nèi)還可促進(jìn)局部血管內(nèi)凝血的發(fā)生,凝血后可造成局部血液循環(huán)障礙,內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)缺血、缺氧性損傷,血管壁通透性增加,在體內(nèi)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[12]。當(dāng)過(guò)量產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子就會(huì)引發(fā)和加重母體胎盤(pán)和胎兒胎盤(pán)吻合部的炎性反應(yīng)和黏連癥狀,阻礙胎兒絨毛與母體胎盤(pán)的隱窩樣凹陷分離。此次試驗(yàn)表明,胎衣不下組IL-2含量極顯著高于健康組(P＜0.01),胎衣不下組IL-2平均濃度(16.68pg/mL±1.36 pg/mL)達(dá)到健康對(duì)照組(8.08 pg/mL±0.39 pg/mL)的兩倍,其比值為2.06∶1,可見(jiàn)胎盤(pán)組織中IL-2含量劇烈升高是導(dǎo)致發(fā)生胎衣不下的主要影響因素。

胎衣不下的發(fā)生,從生理學(xué)上來(lái)說(shuō)是母體胎盤(pán)和胎兒胎盤(pán)吻合部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)及粘連;從免疫學(xué)上來(lái)看,Th1細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫及局部炎癥反應(yīng),特別是導(dǎo)致局部炎性反應(yīng),非常不利于胎衣排出,Th1型細(xì)胞因子作為促炎因子對(duì)胎盤(pán)間發(fā)生炎癥反應(yīng)及粘連癥狀起著很關(guān)鍵的作用。本次試驗(yàn)表明,胎盤(pán)組織中IL-2的含量升高是引發(fā)胎衣不下的重要機(jī)理之一。

[1]田建洲,田仕江,李時(shí)良,等.耕牛的胎衣不下病因分析及防治措施[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué),2007,33(2):87,91.

[2]王曉麗,夏興霞,諸玉梅,等.奶牛胎衣不下的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2007,20(4):41-46.

[3]羅麗蘭.生殖免疫學(xué)[M].湖北武漢:科學(xué)技術(shù)出版社,1998:134-136.

[4]周幫會(huì),王鳳霞.奶牛胎衣不下發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008(6):83-86.

[5]周幫會(huì),陳 斌,姜國(guó)均,等.胎衣不下奶牛胎盤(pán)中孕酮和雌激素含量變化的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(8):1968-1970.

[6]王愛(ài)華,閆 華.自然流產(chǎn)時(shí)蛻膜、絨毛組織中T NF-α和IL-10的水平研究[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,19:189-191.

[7]Dudley D J,Trautman M S,Mitchell M D.Inflammatory mediators regulate interleukin-production by culture gestation at tissues:evidence for a cy tokine network at the choriodecidual interface[J].J Clin Endocrionl Metab,1993,76:404.

[8]Szekeres-Bartho J,Wegman T G.A progesterone dependent immunomodulatory protein alters the TH1/T H2 blance[J].J Reprod Immunol,1996,13:81.

[9]唐亞梅,陳志衡,唐愛(ài)國(guó).T h1/T h2型細(xì)胞因子失衡與自身免疫性甲狀腺疾病的關(guān)系研究[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2005,7(7):876-878.

[10]劉智喜,李權(quán)武,武 浩,等.奶牛分娩前后血漿類(lèi)固醇激素水平變化與胎衣不下的關(guān)系[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),1994,8(3):172-176.

[11]Laird S M,T uckeman E M,Li T C,et al.The production of TNFαby human endometrial cells in cluture[J].Placenta,1995,16:A39.

[12]田 牛.微循環(huán)的臨床和基礎(chǔ)[M].北京:北京原子能出版社,1996:40.

Detection of Levelsin of IL-2 in the Placenta of Cows with Placenta Retention

MA Qing-he1,LIU Rong-xin1,CHEN Bin1,WANG Shi-zhe2,LI Hai-yan2,JIANG Guo-jun1

(1.College of Traditional Chinese Veterinary Medicine,Hebei Agricultural University,Dingzhou,Hebei,073000,China;2.Agricultural and Animal Husbandry Bureau of Dingzhou County,Dingzhou,Hebei,073000,China)

To investigate the fluctuating regulation of placenta IL-2 levels in cow s with placenta retention,and study the immune mechanisms of placenta retention,twenty cows were divided into two groups,and the foetal placenta of cows were collected.Then the contents of IL-2 in foetal placenta supernatant were measured by ELISA.The results showed that the level of IL-2 in placenta retention group was significantly higher than that in control group(P＜0.01).The results demonstrated that the higher level of IL-2 of placenta retention was one of the important reasons that caused the placenta retention in cow s.

placenta retention;placenta;IL-2;cow

S857.23

A

1007-5038(2010)08-0041-04

2010-02-06

資金項(xiàng)目:河北省畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目(200606)

馬清河(1971-),男,寧夏固原人,講師,碩士,主要從事中藥防治畜禽疾病學(xué)研究。*通訊作者