六種中藥提取物對金黃色葡萄球菌體外抑菌作用的比較

董淑珍,付志新,宋 瑜,馬艷華,曹旺斌

(1.河北科技師范學(xué)院,河北昌黎 066600;2.中國環(huán)境管理干部學(xué)院,河北秦皇島 066004;3.河北科技師范學(xué)院歐美學(xué)院,河北秦皇島 066600)

六種中藥提取物對金黃色葡萄球菌體外抑菌作用的比較

董淑珍1,付志新1,宋 瑜2,馬艷華3,曹旺斌1

(1.河北科技師范學(xué)院,河北昌黎 066600;2.中國環(huán)境管理干部學(xué)院,河北秦皇島 066004;3.河北科技師范學(xué)院歐美學(xué)院,河北秦皇島 066600)

采集昌黎地區(qū)29頭外觀健康正常的奶牛乳樣116份,經(jīng)CMT(加利福尼亞乳房炎試驗)診斷出陽性病例并從陽性乳樣中分離鑒定出其中的優(yōu)勢菌;再用連翹、當(dāng)歸、金銀花、王不留行、蒲公英、川芎等中藥提取物對該菌進行體外抑菌試驗。結(jié)果表明,引起該地區(qū)奶牛隱性乳房炎的主要細菌為金黃色葡萄球菌,經(jīng)診斷患有該病的奶牛為15例,患病陽性率為51.7%,116個乳樣中有30個為陽性,對應(yīng)乳區(qū)陽性率為25.9%;試驗中所選中藥對金黃色葡萄球菌均有抑制作用,其中以750 mL/L醇提的連翹效果最為明顯。

隱性乳房炎;金黃色葡萄球菌;中藥提取物;體外抑菌;奶牛

奶牛乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見的疾病之一。全世界約有2.2億頭奶牛,其中約1/3患各種類型的乳房炎[1]。據(jù)統(tǒng)計,約有97%的乳房炎屬于隱性乳房炎[2]。奶牛乳房炎仍然是奶牛群中花費最多的疾病之一,且是造成早期犢牛大批發(fā)生胃腸道疾病與死亡的原因之一[3]。奶牛乳房炎是其乳腺受到微生物感染,其中最主要的是病原微生物感染[4]。其中金黃色葡萄球菌是乳房炎的重要致病菌之一,它引起的乳房炎多為亞臨床感染,但其急性或復(fù)發(fā)性暴發(fā)比鏈球菌多見,病變區(qū)會纖維化和形成微小膿腫,造成永久性實質(zhì)破壞。最急性金黃色葡萄球菌乳房炎易導(dǎo)致壞疽。壞疽時,毒血癥癥狀加重,病區(qū)有水皰,漿液滲出,觸之發(fā)涼,呈黑色。乳房炎的傳統(tǒng)治療措施為應(yīng)用抗生素治療,由于長期使用抗菌藥物治療,使耐藥菌株不斷產(chǎn)生,療效降低,隨著用藥量逐漸增大,造成乳中藥物殘留超標(biāo),影響人類健康,從而嚴(yán)重阻礙了奶業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。中藥屬于純天然制品,毒性低,不會造成嚴(yán)重的藥物殘留,不易產(chǎn)生抗藥性,克服了使用抗生素的某些不足[5],因此,使用中藥治療乳房炎的研究一直倍受關(guān)注。本試驗通過對河北省昌黎地區(qū)某奶牛場29頭隱性乳房炎奶牛致病菌進行分離鑒定,并運用中藥提取物進行體外抗菌試驗,旨在為治療奶牛隱性乳房炎篩選合適的中藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 連翹、當(dāng)歸、金銀花、王不留行、蒲公英、川芎6味中藥材,購自昌黎縣樂民藥店。

1.1.2 乳樣 河北省昌黎地區(qū)某奶牛場中外觀表現(xiàn)正常的29頭奶牛的116份奶樣 。

1.1.3 主要儀器 醫(yī)用凈化工作臺,立式壓力蒸汽滅菌器筒,電熱恒溫培養(yǎng)箱,微波爐,CMT(加利福尼亞乳房炎試驗)診斷盤,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

1.1.4 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍瓊脂、三糖鐵瓊脂、營養(yǎng)肉湯瓊脂等(杭州天和微生物試劑有限公司制造,批號:20080320);CMT診斷液(北京三元集團畜牧獸醫(yī)總站,批號:20080110);甘露醇微量發(fā)酵(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn),批號:20087110);革蘭染色液(杭州天和微生物試劑有限公司制造,批號:20080320);過氧化氫(批號:20090120);成年公綿羊脫纖維血等。

1.2 方法

1.2.1 乳樣的采集及隱性乳房炎的診斷 用溫水清洗乳房,用毛巾擦干凈,棄去前兩把奶,取乳汁約5 mL,裝入青霉素小瓶內(nèi),置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。診斷時用干凈的診斷盤進行,每個乳盤中將被檢牛4個乳區(qū)的乳依次放入2 mL,再加入等量的CMT診斷試液,呈同心圓搖動診斷盤,根據(jù)混合物的凝集反應(yīng)和顏色變化綜合判定結(jié)果。

1.2.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)國際乳業(yè)聯(lián)合會(IDF),奶牛隱性乳房炎診斷標(biāo)準(zhǔn)進行診斷。

1.2.3 病原的分離與鑒定 對診斷出患有隱性乳房炎奶牛的乳區(qū)進行無菌采集乳樣,先溫水清洗乳房,用毛巾擦干凈,碘酊消毒,5 min后,750 mL/L酒精脫碘,用一次性紙巾吸干酒精,戴一次性滅菌手套采集乳樣,將其放入滅菌的青霉素小瓶中,置于4℃保存?zhèn)溆?。將無菌采集的乳樣分別劃線接種于血液瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板中,在37℃下培養(yǎng)24 h。再挑取單個優(yōu)勢菌落接種到普通營養(yǎng)瓊脂、血液平板和伊紅美藍營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài),再分別涂片并革蘭染色。根據(jù)菌落形態(tài),菌體及其染色特征初步確定細菌的類屬,然后再按常規(guī)方法進行生化鑒定。

1.2.4 中藥的提取及藥液制備

1.2.4.1 水煮法 準(zhǔn)確稱取中藥材20 g置于圓底燒瓶中,加10倍量蒸餾水,浸泡30 min后加冷凝管回流提取1 h(回流時調(diào)溫電熱套電壓220 V,沸騰后電壓調(diào)至50 V;沸騰后開始計時),過濾并收集濾液,藥渣再加入10倍量蒸餾水回流提取1 h(方法同上),過濾,合并上次的濾液,在水浴鍋上揮發(fā)至干燥,獲得提取物。

1.2.4.2 750 mL/L乙醇提取法 準(zhǔn)確稱取中藥材20 g置于圓底燒瓶中,加10倍量750 mL/L乙醇,浸泡30 min后加冷凝管回流提取1 h(回流時調(diào)溫電熱套電壓220 V,沸騰后電壓調(diào)至50 V;沸騰后開始計時),過濾并收集濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀,干燥,獲得提取物。

1.2.4.3 藥液的制備 準(zhǔn)確稱量中藥提取物1 g,加入1 mL的蒸餾水,配制成1 g/mL的母液。再將母液稀釋10倍置于1.5 mL Eppendorf管中備用。

1.2.5 藥物敏感性試驗 取37℃培養(yǎng)18 h的試驗菌肉湯培養(yǎng)液,用滅菌的棉拭子蘸取菌液,均勻的涂在普通營養(yǎng)瓊脂平板上,再用打孔器在普通營養(yǎng)瓊脂上打孔(直徑6 mm),然后在酒精燈火焰上稍微烘烤后,每孔分別加入不同的藥液(注意不要溢出孔外),每種藥液分別做4次平行試驗 ,37℃培養(yǎng)24 h。分別觀察并記錄不同中藥對細菌抑菌圈直徑的大小。當(dāng)抑菌圈直徑＜7 mm或無抑菌圈時,因幾乎無作用,不記在內(nèi)。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)按《中藥藥理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn):抑菌直徑＞20 mm為極敏,15 mm～19 mm為高敏,10 mm～14 mm為中敏,10 mm以下為低敏。

2 結(jié)果

2.1 病原鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 在普通營養(yǎng)瓊脂中菌落成乳白色或黃色,針尖大小,邊緣光滑;在血液平板中菌落為大而光滑、邊緣整齊、濕潤、中等程度隆起,金黃色、淺黃色或灰白色圓形菌落,有的菌落呈β型溶血;在伊紅美蘭營養(yǎng)瓊脂中基本無菌落生長。在顯微鏡下觀察細菌革蘭染色為陽性,菌體呈葡萄串狀簇集成堆,少數(shù)散在成雙、短鏈狀排列的紫紅色球菌。

在30個陽性乳區(qū)中有24個乳區(qū)細菌培養(yǎng)呈以上特點,占總數(shù)的80%。

2.1.2 生化試驗 從表1可以看出,陽性乳區(qū)樣本中大部分優(yōu)勢菌符合金黃色葡萄球菌的生化特性,故引起該地區(qū)奶牛隱性乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌。

表1 主要致病菌鑒定指標(biāo)Table 1 Identification indexes of the major pathogenic bacteria

2.1.3 藥物敏感性試驗的結(jié)果 由表2可知,連翹、當(dāng)歸、金銀花、王不留行、蒲公英和川芎的不同方法提取物都對金黃色葡萄球菌有抑菌作用。其中750 mL/L醇提的連翹、水提的連翹和水提的金銀花對金黃色葡萄球菌為高敏的抑菌作用;水提的當(dāng)歸、750 mL/L醇提的金銀花、水提的王不留行、750 mL/L醇提的王不留行、水提的蒲公英和水提的川芎對金黃色葡萄球菌為中敏的抑菌作用;750 mL/L醇提的當(dāng)歸、750 mL/L醇提的蒲公英和750 mL/L醇提的川芎對金黃色葡萄球菌為低敏的抑菌作用。

表2 中藥提取物對金黃色葡萄球菌抑菌試驗的效果Table 2 The effect of bacteriostasis test on traditional Chinese drug extract forStaphy lococcus aureus mm

3 討論

3.1 奶牛隱性乳房炎的發(fā)病情況

乳房炎在奶牛業(yè)中是一種多發(fā)病,臨床型乳房炎占乳房炎發(fā)病率的很小一部分,約1%～2%,而絕大部分是乳汁和乳房無明顯的可見肉眼變化,可從乳汁中能檢出很多體細胞和病原菌為特征的,在牛群中更為普遍的隱性乳房炎[6]。蕭乾慶等[7]、楊素平[8]李國江[9]報道我國奶牛隱性乳房炎頭陽性率分別為51.3%,54.1%和46.4%;單志貴[10],蕭乾慶等,楊章平等報道隱性乳房炎乳區(qū)陽性率分別為59.1%、31.9%和28.0%。本試驗中測定的昌黎地區(qū)的奶牛隱性乳房炎頭陽性率為51.7%,乳區(qū)陽性率為25.9%,與國內(nèi)報道基本一致。臨床型乳房炎給生產(chǎn)造成的損失顯而易見,而隱性乳房炎所造成的潛在生產(chǎn)性能的降低,諸如產(chǎn)奶量下降,牛奶品質(zhì)較差,奶牛利用年限縮短等經(jīng)濟損失則無法估計。但由于此類患牛乳房和乳汁無明顯的可見肉眼變化,所以很難被發(fā)現(xiàn),以致往往被人們所忽視。

3.2 奶牛隱性乳房炎的主要致病菌

奶牛乳房炎是其乳腺受到微生物感染或因物理、化學(xué)刺激而引起的一種炎癥,多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期,其中最主要的因素是病原微生物感染。迄今為止,人們已從奶牛乳房中分離到了130多種微生物,其中包括多種細菌、真菌、病毒、支原體等[11]。病原微生物主要為條件性致病菌,尤其以葡萄球菌、鏈球菌為主,大腸埃希菌也較常見,這3種細菌引起的乳房炎占總發(fā)病率的90%以上[1]。而本試驗所鑒定的主要病原菌也屬此范疇,即金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌是傳染性致病菌,其傳播主要發(fā)生在擠奶過程中,如通過擦洗乳房用的毛巾、水、擠奶員的手、擠奶杯等傳播。

3.3 中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

試驗所需菌株是直接從患有隱性乳房炎的奶牛乳中分離并鑒定出的主要病原菌——金黃色葡萄球菌,用不同的中藥提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌活性進行測定,其結(jié)果更具有說服力。該結(jié)果表明試驗所選6味中藥均對葡萄球菌有一定的抑菌作用,其中以水提的連翹效果最佳,其抑菌圈直徑達17 mm,該結(jié)果與連學(xué)昭[12]的研究結(jié)果相似。從試驗結(jié)果可以得出,中藥對所分離的金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用,為中藥治療奶牛乳房炎提供了有利的依據(jù)。隨著抗生素和合成抗菌藥物的限制使用,急需開發(fā)能夠替代抗菌藥物且安全性能好的產(chǎn)品[5]。據(jù)研究證實,中藥制劑既可防病又能提高生產(chǎn)性能,不但能夠直接抑殺病原微生物,而且能夠提高機體的免疫機能[13]。另外,中藥毒副作用小,在治療乳房炎方面具有很大發(fā)展前景[14]。隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展和人們對生活質(zhì)量的提高和綠色食品消費的強烈要求,在尋求防治疾病方面,中藥無疑是重要的發(fā)展方向之一。

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Comparison of Antibacterial Effects of Six Herb Drug Extracts onStaphy lococcus Aureus in Vitro

DONG Shu-zhen1,FU Zhi-xin1,SONG Yu2,MA Yan-hua3,CAO Wang-bin1

(1.Hebei Normal University of Science&Technology,Changli,066600,China;
2.Environment Management College of China,Qinqhuangdao,066004,China;
3.E&A College of Hebei Normal University of Science&Technology,Qinqhuangdao,066004,China)

To find the optimal drugs for treating the subclinical mastitis of dairy cattle.116 milk samples of 29 dairy cows were collected in Changli country,Hebei province.Positive milk tests were determined using california mastitis Test.Isolation and identification of dominant colony for positive milk were conducted.The antibacterial experiment was proceeded using herb drug extracts ofForsythia suspens,Angelica sinensis,Flos lonicerae,Vacca segetalis,Taraxaci mongolicum,Ligusticumwallichii,et al.The results showed thatStaphylococcus aureuswas the dominant baacterium.15 cases were diagnosed as cow mastitis,the positive rate reached 51.7%(15/29),30 of 116 milk teats were positive,the positive rate was 25.9%(30/116).The whole herb drugs had antibacterial effect forStaphylococcus aureus.Forsythia suspensextracted by 75%alcohol had best antibacterial effect.

subclinical mastitis;Staphylococcus aureus;herb drug extract;in vitroantibacteria;dairy cow

S853.73;S852.612

B

1007-5038(2010)08-0121-04

2009-12-31

董淑珍(1967-),女,河北蔚縣人,實驗師,主要從事動物組織胚胎病學(xué)研究。