鵝細(xì)小病毒不同毒株VP13基因的克隆與序列分析*

韋艷梅,曹宗喜,廖 明,張桂紅,鄭煦燦,單 芬,羅開(kāi)健

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

鵝細(xì)小病毒不同毒株VP13基因的克隆與序列分析*

韋艷梅#,曹宗喜#,廖 明,張桂紅,鄭煦燦,單 芬,羅開(kāi)健*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

分別將鵝細(xì)小病毒(GPV)的5個(gè)分離株通過(guò)PCR技術(shù),從病毒基因組DNA中擴(kuò)增出病毒蛋白VP1和VP3非重疊區(qū)的基因片段(VP13基因),并與pMD18-T質(zhì)粒載體連接,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌Top10中,經(jīng)PCR鑒定后,對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定及分析。結(jié)果表明,5株GPV VP13基因全長(zhǎng)均為594 bp,編碼198個(gè)氨基酸。不同毒株主要結(jié)構(gòu)蛋白VP13基因與國(guó)外已發(fā)表的鵝細(xì)小病毒B株核苷酸序列相似性較高(93.4%～98.7%),但毒株間也存在一定差異。

鵝細(xì)小病毒;VP13基因;克隆;序列分析

同等貢獻(xiàn)

鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)是感染禽類的主要自主性細(xì)小病毒,由它引起的鵝細(xì)小病毒病又名小鵝瘟,嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)[1-3]。GPV屬細(xì)小病毒科濃核病毒屬[4],其基因組DNA為單鏈、線性DNA,大小約為5.0 kb;含有正鏈DNA和含有負(fù)鏈DNA的病毒粒子數(shù)目基本相等,各占50%。GPV基因組中含有2個(gè)主要開(kāi)放閱讀框架(ORF)[5-6],左側(cè)ORF(LORF)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS),右側(cè)ORF(RORF)編碼 3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP)VP1、VP2和VP3,其中編碼VP1、VP3的啟動(dòng)密碼子ATG分別位于2 439 bp和3 033bp處,編碼VP2的啟動(dòng)密碼子為不典型的ACG,位于2874 bp處。編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白的終止密碼子位點(diǎn)相同,位于4 635 bp處。VP1、VP2和VP3基因的核苷酸全長(zhǎng)分別為2 199、1 764、1 605 bp[7]。VP1與VP3基因的核苷酸非重疊序列共594 bp(以下簡(jiǎn)稱VP13基因)。VP3為GPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是病毒核衣殼的主要成分,約占總蛋白含量的80%,且暴露于病毒粒子表面[5],是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的重要抗原蛋白。在自然感染條件下,GPV誘導(dǎo)產(chǎn)生抗VP3的中和抗體,故VP3基因是研制基因工程疫苗的首選基因。為區(qū)分鑒別自然感染和接種VP3基因工程疫苗而產(chǎn)生的抗體,本試驗(yàn)針對(duì)不同毒株,進(jìn)行VP1和VP3非重疊基因序列的克隆,為后期制備檢測(cè)自然感染的診斷抗原和標(biāo)記探針奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 5株鵝細(xì)小病毒分別為SCh株(四川株)、F株(佛山株)、DB3株(東北株)、H 株(東北株)和Q株(東北株)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株 pMD-18T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,大腸埃希菌DH5α為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA抽提試劑盒、膠回收(小量)試劑盒、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖及鑒定 將病毒適當(dāng)稀釋后,經(jīng)尿囊腔接種9日齡的非免疫鴨胚,收集接種后72 h～240 h死亡的鴨胚尿囊液,經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性者置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的GPV B株全基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增VP13基因,上游 P1:5′-CCGGGATGTCTACTT TT T TAGA-3′;下游 P2:5′-CGT TAT TCAGATGCTGCC-3′,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 將含有GPV的尿囊液按照DNA抽提試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA模板的提取。DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)體系為:模板2 μ L,50 pmol上 、下游引物各 1 μ L,4種 dNTP 分別為5 μ L,ExTaqDNA 聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L,加水至 50 μ L 。PCR反應(yīng)條件為:97℃30 s,50℃1 min,72℃2 min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4 GPV VP13基因的克隆及鑒定 將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物按一定比例與pMD-18T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒,置-40℃冰箱備用。

圖1 VP13基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of VP13 gene of GPV

1.2.5 序列分析與比較 將轉(zhuǎn)入重組載體的感受態(tài)細(xì)菌Top10,同時(shí)送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)Blast得到一些與試驗(yàn)毒株一致性較高的國(guó)外發(fā)表序列,并用 DNA Star軟件中的Clustal W Method將這些序列進(jìn)行一致性比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約為0.6 kb的片段(圖1)。

2.2 菌液PCR檢測(cè)

菌液PCR產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約為0.6 kb的片段(圖2)。

圖2 VP13基因菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of VP13 gene of GPV in bacterial culture

2.3 序列測(cè)定分析

5株GPV的VP13基因序列測(cè)定結(jié)果如圖3,由其推導(dǎo)氨基酸序列如圖4。測(cè)定及分析結(jié)果顯示,5株GPV的VP13基因全長(zhǎng)均為594 bp,編碼198個(gè)氨基酸,將此序列與GPV B株的VP13基因序列進(jìn)行比較,核苷酸序列相似性如圖5所示,其推導(dǎo)氨基酸序列一致性如圖6所示。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)GPV Sch株、F株、DB3株、H 株和 Q株的VP13基因進(jìn)行了克隆和序列測(cè)定及分析,結(jié)果表明,SCh、F、DB3、H 和 Q 這 5株GPV VP13基因核苷酸序列長(zhǎng)度均為594bp,編碼198個(gè)氨基酸。它們的VP13序列與國(guó)外發(fā)表的GPV B株VP3基因核苷酸序列相比較,除個(gè)別突變點(diǎn)外,大多數(shù)變異集中在VP13基因5′端,核苷酸序列相似性分別為93.4%、96.8% 、98.7%、98.5%和 96.8%;由這些序列推導(dǎo)的氨基酸序列較GPV B株的突變主要集中在28位和59位氨基酸之間,這一區(qū)域可能是VP13基因的高變區(qū),氨基酸序列相似性分別為94.9%、97.5%、98.0%、97.5%和 97.5%。

Strassheime M L等[8]研究犬細(xì)小病毒衣殼蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)決定中和抗體產(chǎn)生位點(diǎn)區(qū),分別位于纖突頂端和VP2第300氨基酸殘基周圍及三倍體纖突的“肩”部,它們的堿基突變可引起病毒抗原性的變化。犬細(xì)小病毒衣殼蛋白中有10個(gè)抗原表位,免疫吸附試驗(yàn)證實(shí),其中6個(gè)位于病毒表面;6個(gè)中又有3個(gè)位于VP2氨基端,另外的3個(gè)位于病毒三重對(duì)稱軸上形成“穗狀突起”的VP2的“環(huán)”上,是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要部位[9]。通過(guò)X射線技術(shù),犬細(xì)小病毒(CPV)、貓細(xì)小病毒(FPV)、小鼠細(xì)小病毒(MVM)、人細(xì)小病毒B19的三維結(jié)構(gòu)已被證實(shí)。其中VP2是構(gòu)成病毒表面“穗狀突起”的成分之一,VP2的第93、300、301、426位氨基酸殘基對(duì)病毒和單抗的結(jié)合能力有一定的影響,在VP2氨基酸序列的第95位和第200位之間有B細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)[8]?；谝陨涎芯?結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果,推斷GPV的VP13的3′端可能具有B細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)。

圖3 5株GPV VP13基因測(cè)序結(jié)果與國(guó)外已發(fā)表序列(GPV B株)的比較Fig.3 Comparison of nucleotide sequences of VP13 gene between 5 goose parvovirus strains and B strain

圖4 5株GPV VP13基因推導(dǎo)的氨基酸序列與國(guó)外已發(fā)表序列(GPV B株)的比較Fig.4 Comparison of the deduced amino acid sequence of VP13 gene between 5 goose parvovirus strains and B strain

圖5 5株GPV VP13與GPV B VP13的基因進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phy logenetic tree analy sis between the 5 strains of GPV-VP13 gene and GPV-B-VP13 gene

圖6 5株GPV VP13基因推導(dǎo)氨基酸與GPV B VP13基因推導(dǎo)氨基酸的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis between the 5 strains of deduced aminoacids of GPV-VP13 gene and GPV-B-VP13 gene

Morinet F 等[10]、Le Gall-Recule G 等[11]和Takehara K等[12]應(yīng)用相同的表達(dá)體系研究表明,細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2和VP3)可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,通過(guò)體外表達(dá)細(xì)小病毒的該結(jié)構(gòu)基因,制備重組抗原,可通過(guò)檢測(cè)抗體對(duì)病原進(jìn)行檢測(cè)。由于GPV的培養(yǎng)和增殖常用鵝胚,因此常規(guī)全病毒抗原的制備存在諸多不便。此外,GPV分離株的抗原性均非常接近,僅表現(xiàn)一個(gè)血清型,與本屬其他病毒無(wú)血清學(xué)交叉反應(yīng)。因此,利用VP1與VP3非重疊基因序列表達(dá)產(chǎn)物作為抗原和用該區(qū)段的核苷酸序列作為標(biāo)記探針,在細(xì)小病毒病特異性診斷以及區(qū)分VP3基因工程疫苗接種和野毒感染中具有良好的應(yīng)用前景。

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Cloning and Sequencing of non-repeated VP1 and VP3 Genes of Different Goose Parvovirus Strains

WEI Yan-mei,CAO Zong-xi,LIAO Ming,ZHANG Gui-hong,ZHENG Xu-can,SHAN Fen,LUO Kai-jian

(College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

In this article,non-repeated VP1 and VP3 genes of different Goose parvovirus strains were amplified from the DNA by(PCR,the non-repeated VP1 and VP3 genes(VP13)were cloned into pMD18-T vector respectively.The recombinant plasmids were identified by PCR and then sequenced.The result of sequence analysis showed that non-repeated VP1 and VP3 gene had 594 bp and included a complete open reading frame which encoding a protein of 198 amino acids,and all the 5 strains of GPV shared highly common identity compared with GPV B strain(93.4%-98.7%),but there were also some differences between different strains.

Goose parvovirus;VP3 gene;cloning;sequencing

S852.659.2

A

1007-5038(2010)08-0055-05

2010-01-05

韋艷梅(1986-),女,廣西百色人,碩士研究生,主要從事病毒分子生物學(xué)研究。*通訊作者 #對(duì)本文有