串珠鐮刀菌素對仔豬部分免疫指標(biāo)的影響*

黃露菡,王 凱,唐兆新,魏文康

((1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510640;2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣東佛山 528231;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣東廣州 510640)

串珠鐮刀菌素對仔豬部分免疫指標(biāo)的影響*

黃露菡1,王 凱2*,唐兆新1,魏文康3

((1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510640;2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣東佛山 528231;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣東廣州 510640)

12頭40日齡三元雜仔豬,平均初體重12 kg±0.5 kg,隨機(jī)分成兩組,每組6頭,以研究串珠鐮刀菌素對仔豬免疫功能影響。對照組喂飼正常飼料,試驗(yàn)組在飼料中按 30 mg/kg添加串珠鐮刀菌素(MON)提取物。試驗(yàn)期為42 d,每周清晨空腹抽血1次。結(jié)果發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組在攻毒后的第1周血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組相比差異不顯著,第2、3、4、5、6周顯著下降(P＜0.01)。試驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力在第1,2,3周與對照組相比差異不顯著,第4、5、6周差異極顯著(P＜0.01)。與對照組相比,試驗(yàn)組血清中免疫球蛋白IgG含量在第1周差異不顯著,第2、3、4周差異顯著下降(P＜0.01)。結(jié)果表明,MON可降低仔豬血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)量,T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及血清中免疫球蛋白IgG含量,從而降低機(jī)體抵抗力。

串珠鐮刀菌素;仔豬;免疫功能

霉菌毒素污染飼料是當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大問題。霉菌毒素能抑制豬的免疫功能,造成動(dòng)物對感染性疾病的抵抗力下降、誘發(fā)慢性感染,或降低疫苗和藥物的治療效果[1]。因此,霉菌毒素污染飼料對養(yǎng)豬業(yè)來說是一大潛在危害。其中黃曲霉毒素、赭曲霉素、T-2毒素和脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等對免疫系統(tǒng)破壞作用已被證實(shí)。黃曲霉毒素不但影響細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng),破壞巨噬細(xì)胞的噬菌能力,抑制淋巴細(xì)胞的增殖與活化,引起胸腺發(fā)育不良和萎縮,同時(shí)也影響體液的應(yīng)答反應(yīng),如降低血清免疫球蛋白濃度。另外,單端孢霉烯族毒素是一類強(qiáng)有力的免疫抑制劑,已證明動(dòng)物接觸T-2毒素或脫氧雪腐鐮孢菌烯醇后淋巴細(xì)胞反應(yīng)有所減弱,其中包括中性粒細(xì)胞趨向性,肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬作用[2]。在全球范圍內(nèi),串珠鐮刀菌是污染玉米等糧食作物的主要真菌,能產(chǎn)生多種毒素并給人類和動(dòng)物造成很大危害[3-4]。串珠鐮刀菌素(moniliformin,MON)是串珠鐮刀菌等20余種鐮刀菌所產(chǎn)生的一種水溶性毒素[5-7]。MON對動(dòng)物有較強(qiáng)的毒性作用,主要作用于增殖活躍的細(xì)胞,如肝、脾、心肌、骨骼肌和軟骨細(xì)胞等。抑制細(xì)胞蛋白合成,干擾細(xì)胞分裂增殖,對生物膜通透性和各種酶活性有明顯影響,同時(shí)引起機(jī)體過氧化損傷[8]。但關(guān)于MON對動(dòng)物免疫功能影響的研究報(bào)道較少,僅見于對雞的研究,而對仔豬免疫功能影響的研究尚未見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況,旨在研究MON是否影響仔豬免疫功能,為解決豬場免疫失敗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 串珠鐮刀菌 從廣州某飼料廠原料玉米中分離的串珠鐮刀菌作為本試驗(yàn)產(chǎn)毒菌株。

1.1.2 培養(yǎng)液、試劑等 RPMI1640培養(yǎng)液購自GIBICO公司。淋巴細(xì)胞分離液,雙抗,MTT、ConA均為Sigma公司產(chǎn)品,96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板為美國corning公司產(chǎn)品。

1.1.3 IgG測試試劑盒 購自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 試驗(yàn)用動(dòng)物 40日齡健康五元雜仔豬12頭,平均初體重12 kg±0.5 kg,其中公豬6頭,母豬6頭。

1.2 方法

1.2.1 串珠鐮刀菌的產(chǎn)毒培養(yǎng) 將分離到經(jīng)鑒定為串珠鐮刀菌菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),25℃培養(yǎng)7 d。以滅菌玉米粉為產(chǎn)毒培養(yǎng)基,每250 g干燥玉米粉加水150 mL,拌勻,裝入1 000 mL三角瓶中,121℃,45 min高壓滅菌,冷卻后用滅菌手術(shù)刀將PDA平板劃碎成小塊接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基上,搖勻。置25℃培養(yǎng)10 d后,轉(zhuǎn)4℃培養(yǎng)7 d,再轉(zhuǎn)25℃培養(yǎng)10 d。

1.2.2 串珠鐮刀菌素的提取與純化 經(jīng)過27 d的培養(yǎng),選擇生長良好的串珠鐮刀菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基,115℃高壓滅菌15 min,烘干。將培養(yǎng)物用中藥粉碎機(jī)粉碎。取粉碎后的培養(yǎng)物20 g于300 mL具塞錐三角瓶中,加入150 mL二氯甲烷振蕩2 min,過濾棄去二氯甲烷,再加 150 mL二氯甲烷振蕩15 min,同樣棄去二氯甲烷。然后向樣品中加入100 mL乙腈∶水((95∶5)振蕩 30 min,過濾,收集濾液50 mL于250 mL分液漏斗中,加入同體積的正己烷振搖2 min,待分層后棄去正己烷層,將乙腈水層再分別用20 mL正己烷提取2次,收集乙腈水層于圓底燒瓶中,50℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓蒸干,加入0.5 mL甲醇溶解殘?jiān)?/p>

1.2.3 毒素鑒定 分別將MON標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司產(chǎn)品)和提取物進(jìn)行高效液相色譜儀檢測(用紫外監(jiān)測器,波長254 nm,柱溫35 ℃)。

圖1 MON標(biāo)準(zhǔn)液高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography for MON standard substance

1.2.4 攻毒試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物飼喂廣東某飼料廠生產(chǎn)的仔豬全價(jià)日糧。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分成試驗(yàn)組(n=6)和對照組(n=6)。在試驗(yàn)攻毒前先空腹抽血,檢測各項(xiàng)待測免疫指標(biāo),無顯著差異后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。試驗(yàn)組飼料中添加MON提取物(MON含量為30 mg/kg)。兩組試驗(yàn)動(dòng)物均在相同條件下飼養(yǎng) 42 d,于試驗(yàn)第 7、14、21 、28、35、42 天清晨空腹進(jìn)行前腔靜脈抽血,每次采血 7 mL,用38 g/L枸櫞酸納溶液抗凝。其中2 mL用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),0.5 mL用于 T淋巴細(xì)胞值的測定,4.5 mL抗凝血以3 000 r/min 10 min分離血漿,分裝,置-70℃超低溫冰箱保存待測。

1.2.5 測定指標(biāo)和方法 T淋巴細(xì)胞值的測定采用酸性非特異性酯酶染色法。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定采用四甲基偶氮唑鹽(MT T)顏色反應(yīng)比色法。IgG含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜圖

如圖1和圖2所示,結(jié)果表明,在本試驗(yàn)所采用的條件下,MON標(biāo)準(zhǔn)液的出峰時(shí)間為12.80 min;提取液在12.84 min有出峰,表明提取液中含有MON。

圖2 提取液高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography for MON extract

2.2 T淋巴細(xì)胞值

結(jié)果見圖3?？芍麄€(gè)試驗(yàn)中,對照組仔豬血液中T淋巴細(xì)胞值變化不大,試驗(yàn)組則出現(xiàn)明顯的下降趨勢,從攻毒后第2周開始至第6周,對照組和試驗(yàn)組血液中T淋巴細(xì)胞值差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

結(jié)果見圖4,可知在試驗(yàn)開始的第1周和第2周,試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率略高于對照組,但差異不顯著。第3周開始,試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢,轉(zhuǎn)化率低于對照組,第4,5,6周時(shí)對照組與試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)差異極顯著(P＜0.01)。

2.4 IgG含量測定

結(jié)果見圖5。在試驗(yàn)第2,3,4周,試驗(yàn)組血液中IgG含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢,對照組與試驗(yàn)組差異極顯著(P＜0.01)。

圖3 T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.3 T lymphocy te count

圖4 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率Fig.4 Lymphocy te transformation rate

圖5 血清中IgG含量Fig.5 IgG concentration in serum

3 討論

至今為止,有關(guān)串珠鐮刀菌素對免疫功能的影響報(bào)道很少,僅有的幾篇報(bào)道主要集中于對雞的研究。Dombrink Kurtzman M A等[9]給小雞飼喂含MON 66 mg/kg～367 mg/kg的飼料一段時(shí)間后,可引起血液學(xué)上的一系列改變。表現(xiàn)在血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)的明顯減少,血沉降低,且外周血出現(xiàn)了異常紅細(xì)胞。Qureshi M A等[10]報(bào)道MON具有一定的免疫抑制作用,給小雞含MON 42.7 mg/kg的飼料6周后可引起血清IgG水平降低,巨噬細(xì)胞的吞噬功能降低34%。王凱等[11-12]報(bào)道,MON會影響雞免疫器官的生長發(fā)育,造成雞的免疫病理損傷,血清中IL-2含量減少,血液中T淋巴細(xì)胞比例下降,T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低。這與本次試驗(yàn)結(jié)果相一致。

T淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分,來源于骨髓的多能干細(xì)胞,具有多種重要的生物學(xué)功能。T淋巴細(xì)胞主要是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)抗原引起的所有免疫應(yīng)答,并具有清除細(xì)胞內(nèi)寄生菌效應(yīng)的作用。效應(yīng)CTL可直接殺傷靶細(xì)胞,發(fā)揮特異性細(xì)胞免疫功能,Th輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,并分泌多種細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組仔豬血液中 T淋巴細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢,由此說明串珠鐮刀菌素對 T淋巴細(xì)胞的生成有明顯抑制作用,從而抑制細(xì)胞免疫功能。

T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是用于顯示淋巴細(xì)胞受到外來抗原攻擊的反應(yīng)能力,其轉(zhuǎn)化能力高低反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞免疫缺陷時(shí),轉(zhuǎn)化率顯著降低,甚至看不到轉(zhuǎn)化現(xiàn)象?；紣盒阅[瘤或其他疾病時(shí),這種轉(zhuǎn)化功能也降低,而具有強(qiáng)烈致癌作用,黃曲霉毒素對細(xì)胞免疫就具有顯著抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,MON可抑制T淋巴細(xì)胞對外來刺激物免疫應(yīng)答水平,從而減弱機(jī)體細(xì)胞免疫功能,增加機(jī)體對疾病的易感性。

IgG主要由脾、淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌,是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體。其以單體形式存在,是血清中的主要抗體,具有吞噬、凝集、沉淀抗原,中和病毒和毒素的作用。IgG在抗體介導(dǎo)的抗細(xì)菌、抗病毒、抗外毒素等多種免疫防御機(jī)制中起著重要作用。IgG是惟一能從母體通過胎盤轉(zhuǎn)移到胎兒體內(nèi)的免疫球蛋白,是胎兒和新生兒抗感染免疫的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究表明,在試驗(yàn)的 2、3、4周,試驗(yàn)組血液中IgG含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢,對照組與試驗(yàn)組差異極顯著。說明試驗(yàn)組仔豬機(jī)體合成和分泌IgG功能降低。由此可知,MON可使仔豬機(jī)體體液免疫功能下降,降低機(jī)體抵抗力。

本研究表明,MON可通過降低仔豬血液中 T淋巴細(xì)胞數(shù)量,T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力以及血清中免疫球蛋白IgG含量,減弱機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能,從而增加動(dòng)物對疾病的易感性。

[1]敖志剛.養(yǎng)豬生產(chǎn)中的霉菌毒素沒有安全限量[J].養(yǎng)豬,2009(2):6-8.

[2]計(jì) 成.霉菌毒素與飼料食品安全[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007:58-60.

[3]趙獻(xiàn)軍,汪昭賢,曹光榮,等.串珠鐮刀菌素對雛雞的毒性研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1998,7(4):36-38.

[4]劉 江.串珠鐮刀菌素與鐮刀菌素的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊,1996,23(6):351-356.

[5]Rabie C J,Marasas W F O,Thiel P G,et al.Moniliformin production and toxicty of different fusarium species from southern Africa[J].Environ Microbiol,1982,43:517-521.

[6]Chelkowski J,Zawadzki M,Zajkowski P,et al.Moniliformin production byFusariumspecies[J].Mycotoxin Res,1990,6:41-44.

[7]Marasass W F Thiel P G,Sydenham E W,et al.Toxicity and moniliformin production by four recently described species ofFusaniumand two uncertain taxa[J].Mycopathologia,1991,113(3):191-197.

[8]趙獻(xiàn)軍.串珠鐮刀菌研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2002,23(4):19-22.

[9]Dombrink Kurtzman M A,Javed T.Serohematologic alterations in broiler chicks on feed amended withFusarium proli feratumculture material on fumonision B1 and monilifo rmin[J].J Vet Diag n Invest,1995,7(4):520-526.

[10]Qureshi M A,Garlieh J D,Hagler W M,et al.Fusarium prolif eratumculture material alters severa;production and immune performance parameters in white Leghorn chickens[J].Immunopharmacol-Immunotoxicol,1995,17(4):791-804.

[11]王 凱,楊麗梅,何永明,等.串珠鐮刀菌素的培養(yǎng)提取及對雞的免疫病理損傷[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39(9):29-32.

[12]王 凱,楊麗梅,黃慶敏,等.串珠鐮刀菌素對雞血清白介素 2含量的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(9):1081-1083.

Effects of Moniliformin on Immune Indexes in Piglets

HUANG Lu-han1,WANG Kai2,TANG Zhao-xin1,WEI Wen-kang3

(1.South China Agriculture University,Guangzhou,Guangdong,510640,China;2.Foshan Science and Techology Collegee,Foshan,Guangdong,528231,China;3.Guangdong Institute of Veterinary,Guangzhou,Guangdong,510640,China)

12 crossbred piglets at 40 days were randomly divided into 2 groups,each with 6 piglets,mean weight 12 kg±0.5 kg.To study moniliformin effect on the immune function of piglets,the control group were fed with basal diets.In the treatment group,piglets were fed with diets added 30 mg/kg MON.The trail lasted for 42 days.The blood were collected per week for investigating the effects of MON on immunological function.The result indicated that no significant difference on T lymphocyte count between control group and treatment group in the first week.But in the second week to the sixth week,T lymphocytes were significantly decreased(P＜0.01)in the treatment group.T he treatment group had no significant difference compared with the control group at lymphocyte transformation rate in the early three weeks.But T lymphocyte transformation rate had very significant difference(P＜0.01)between control group and treatment group from the fourth week to the sixth week.Serum IgG concentration in treatment group was significantly lower(P＜0.01)than that in the control group in the second week to the sixth week.In conclusion,MON can decrease the T lymphocyte count,lymphocyte transformation rate and serum IgG in piglets.

moniliformin;piglets;immunological function

S856.9

A

1007-5038(2010)08-0064-05

2010-01-06

黃露菡(1984-),女,廣東潮州人,碩士研究生,主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者