脂質(zhì)體介導(dǎo)的 VEGF-C反義寡核苷酸對(duì)肺癌微淋巴管生成的影響

丁成智 錢永躍 郭旭峰 徐中華 徐忠恒

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸心外科,江蘇 蘇州 215004)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌 80%,隨著對(duì)綜合治療和個(gè)體化治療的認(rèn)識(shí)不斷加深和推廣,NSCLC的治療已經(jīng)有了很大提高,但目前 5年生存率仍低于 15%〔1〕。一般認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性是決定腫瘤類型和患者死亡的主要原因,因此明確腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制對(duì)腫瘤的治療有重要意義。目前認(rèn)為,抗腫瘤的血管生成和淋巴管生成是有效治療腫瘤的主要途徑之一〔2〕。我們前期研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí),肺癌細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 C(VEGF-C)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 VEGFR-3特異性結(jié)合刺激肺癌新生淋巴管生成〔3〕。本研究通過(guò)建立肺癌裸鼠皮下種植瘤模型,研究脂質(zhì)體介導(dǎo)的 VEGF-C反義寡核苷酸對(duì)肺癌細(xì)胞VEGF-C表達(dá)水平和種植瘤內(nèi)微淋巴管生成的影響,來(lái)尋找肺癌基因治療新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動(dòng)物 肺癌 A549細(xì)胞株由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科胡國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng),生長(zhǎng)特性為貼壁生長(zhǎng),傳代培養(yǎng)。4～6周齡雌性 BALB/C系裸鼠 30只,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自 GIBCO公司,胎牛血清系杭州四季青產(chǎn)品。全硫代磷酸化修飾的寡核苷酸均由上海生工公司合成,VEGF-C反義寡核苷酸序列為 5′-CCCACATCTGTAGAGGGAGGACTC-3′, 正 義 寡 核 苷 酸 序 列 為 5′-TACGTAGTATGGTGTACGATC-3′;RT-PCR試劑購(gòu)自 Promega公司。 VEGF-C上游引物序列為 5′-CATGTACGAACCGCCAG-3′,下游引物序列為 5′-TTGGCTGTTTGGTCATTGGC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物320 bp,β-actin上游引物序列為 5′-ACGTCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,下 游引物 序列為 5′-GGTACCACCATGTACCCAGG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物 163 bp,由上海生工公司合成。兔抗人多克隆抗體VEGF-C、VEGFR-3及免疫組織化學(xué)試劑盒 PV-9000均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肺腺癌細(xì)胞株A 549裸鼠皮下種植瘤模型建立和分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A 549細(xì)胞,經(jīng) 2.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA消化液消化后,PBS洗滌 2次,離心 5 min(1 500 r/min),棄上清,加生理鹽水制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為 1×106個(gè)/ml,以0.2ml/只接種于 BALB/C小鼠右腋皮下。建模 1 w后,隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液對(duì)照組(PBS組)、正義和反義寡核苷酸對(duì)照組(SODN組和 AODN組),每組各 10只。

1.2.2 脂質(zhì)體(Lip)+ODN復(fù)合物的制備和作用 FuGENE 6 Lip由陽(yáng)離子脂質(zhì) DOTMA和中性磷脂 DOPE按 1∶1(W/W)比例在膜過(guò)濾生理鹽水中合成,每毫升含 1 mg。按 1μg∶2μl的比例將AODN和SODN及脂質(zhì)體輕柔混勻,室溫下靜置30 min,制成 Lip+ODN復(fù)合物。

1.2.3 干預(yù)方法和動(dòng)物取材 寡核苷酸用量為每次 10 mg/kg體重,隔日 1次,每周 3次,共 3 w,分別抽取 0.2 ml濃度為8 mg/μl的正義和反義 VEGF-C寡核苷酸 PBS溶液給 SODN和AODN組小鼠注射,PBS組僅注射 0.2 ml PBS。第 4周末時(shí)所有動(dòng)物模型均存活,頸椎脫臼法處死裸鼠,立即剖出腫瘤,置入10%中性甲醛常規(guī)固定標(biāo)本石蠟包埋,行HE染色。

1.2.4 種植瘤內(nèi) VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)量檢測(cè) 按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取種植瘤中總RNA,用引物 Oligo dT反轉(zhuǎn)錄 (RT)合成 cDNA鏈,RT反應(yīng)產(chǎn)物用作PCR的模板DNA,使用特異性引物進(jìn)行 PCR,β-actin作為內(nèi)參照。取 10μl PCR產(chǎn)物在 2%瓊脂凝膠電泳,紫外燈下觀察電泳帶,應(yīng)用Smart View凝膠成像分析系統(tǒng)及其分析軟件,以VEGF-C帶峰面積與內(nèi)參照β-actin帶峰面積的比值表示VEGF-C mRNA水平。Western印跡檢測(cè) VEGF-C蛋白的表達(dá)。主要步驟包括:細(xì)胞總蛋白的提取,SDS-PAGE電泳,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印及抗體染色,Ecl試劑檢測(cè)、X-光電曝光及顯影。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色計(jì)數(shù)微淋巴管密度 采用免疫組化Wax Envision多聚復(fù)合物酶標(biāo)法,具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。陰性對(duì)照采用 0.01 mol/L PBS代替一抗。VEGFR-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物定位于微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,呈棕紅色顆粒。腫瘤微脈管計(jì)數(shù)方法:判定標(biāo)準(zhǔn)為由內(nèi)皮細(xì)胞形成條狀、隙狀等孤立或簇狀結(jié)構(gòu)棕紅染色及有管腔者,先在低倍光鏡(×40)視野下尋找癌周組織微脈管最密集區(qū)即“熱點(diǎn)”(hot spot),然后在高倍鏡(×200)下觀察,以 4個(gè)高倍鏡視野脈管的平均數(shù)表示脈管數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以 x±s表示,應(yīng)用 SPSS l3.0軟件包單因素方差分析和 q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF-C反義寡核苷酸對(duì)種植瘤內(nèi) VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)的影響 PBS組、SODN組和 AODN組種植瘤 VEGF-C mRNA表達(dá)量分別為 24.13±3.34、20.74±3.59和 4.61±1.57。AODN組種植瘤 VEGF-CmRNA表達(dá)顯著減少,與對(duì)照組比較差異顯著 (P＜0.05),見圖 1。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示 AODN組種植瘤 VEGF-C蛋白表達(dá)量亦明顯減少,見圖 2。

圖1 VEGF-C mRNA RT-PCR結(jié)果

圖2 各組瘤組織VEGF-C Western印跡檢測(cè)結(jié)果

2.2 VEGF-C反義寡核苷酸對(duì)種植瘤微淋巴管生成的影響PBS組、SODN組和 AODN組種植瘤內(nèi)微淋巴管密度分別為43.4±2.3、32.4±2.1和 3.2±1.7,AODN組種植瘤內(nèi)微淋巴管密度顯著減少,與對(duì)照組比較差異顯著 (P＜0.01),見圖 3。

圖3 轉(zhuǎn)染后各瘤組織中微淋巴管免疫組化檢測(cè)結(jié)果(DAB,×400)

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的血性和淋巴轉(zhuǎn)移是影響患者生存的重要因素。而肺癌患者早期即可發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移,這是長(zhǎng)時(shí)間困擾臨床醫(yī)生的一個(gè)難題。有研究報(bào)道,肺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往預(yù)示著臨床結(jié)果的高危性〔3〕。因此,研究清除淋巴轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及有效抑制腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移顯得十分必要。

腫瘤的淋巴管生成是指在腫瘤原位形成新的毛細(xì)淋巴管,它僅由單層淋巴內(nèi)皮細(xì)胞組成、基底膜不完整、管壁薄、流速緩慢、剪切力低且淋巴與組織間液的組成基本相同,因而有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管道,進(jìn)而形成淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔4～7〕。研究發(fā)現(xiàn) VEGF在腫瘤的生長(zhǎng)和血管和淋巴管轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用,特別是VEGF-C是作為特異性淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子,可通過(guò)誘導(dǎo)微淋巴管的生成使得腫瘤“淋巴管生成”失調(diào)控,并影響淋巴管內(nèi)皮的通透性,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔5～7〕。Zip等〔8〕通過(guò)建立動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移模型,研究 VEGF-C的促淋巴管生成機(jī)制,結(jié)果提示抑制 VEGF和 VEGFR的表達(dá)能顯著增加腫瘤對(duì)治療的敏感性。Miyata等〔9〕研究發(fā)現(xiàn) VEGF-C在腫瘤淋巴管生成中起決定作用。Maekawa等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)在 T1肺腺癌中 VEGF-CmRNA和蛋白質(zhì)水平在 T1期肺腺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間無(wú)明顯差異,但 5年生存率優(yōu)于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的 T1期肺腺癌。因此,進(jìn)一步探討肺癌中 VEGF-C介導(dǎo)的淋巴管生成機(jī)制及其干預(yù)措施對(duì)于尋找有效的肺癌抗淋巴管生成治療方法具有重要的實(shí)驗(yàn)和臨床意義。

本研究通過(guò)建立肺癌裸鼠皮下種植瘤模型,應(yīng)用反義核酸技術(shù),根據(jù)核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)的規(guī)律設(shè)計(jì)出能與靶基因特定區(qū)域結(jié)合的干擾 DNA,從而影響靶基因的表達(dá)。寡核苷酸干預(yù)后,RT-PCR和 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示 AODN組種植瘤VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)量明顯為低,與 PBS和 SODN組比較差異顯著。分別從基因和蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了 VEGF-C反義寡核苷酸可明顯抑制肺癌細(xì)胞 VEGF-C基因的表達(dá),表明VEGF-C可能在促進(jìn)肺癌淋巴管生成方面扮演著重要角色,同時(shí)也表明,VEGF-C反義寡核苷酸在抑制肺癌淋巴管生成中發(fā)揮了重要作用。

淋巴管密度是評(píng)價(jià)腫瘤淋巴管生成的重要指標(biāo)。本研究中,AODN組種植瘤內(nèi)微淋巴管密度顯著低于兩對(duì)照組,提示VEGF-C反義寡核苷酸靶向抑制肺癌 A 549細(xì)胞 VEGF-C蛋白的表達(dá),從而減少了VEGF-C與腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性受體 VEGFR-3的結(jié)合,進(jìn)而降低肺癌淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和遷移游走的能力,抑制肺癌微淋巴管的生成。如此,將可能阻斷肺癌細(xì)胞通過(guò)新生淋巴管轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的通道,有效防止淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述,我們認(rèn)為VEGF-C反義寡核苷酸能有效抑制肺癌細(xì)胞 VEGF-C的微淋巴管基因表達(dá),進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和淋巴轉(zhuǎn)移,可作為一種抗肺癌淋巴管生成治療方法。

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