冬蟲夏草對糖尿病大鼠纖溶系統(tǒng)的影響

陳 葉 傅余芹 方華偉 韓亞莉 杜月娟

(山東大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科,山東 濟(jì)南 250012)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重威脅人類的健康。關(guān)于 DN的發(fā)病機(jī)制,目前認(rèn)為高糖造成的腎臟血流動力學(xué)改變及葡萄糖本身代謝異常所致的一系列后果是造成腎臟病變的基礎(chǔ),其中腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蓄積引起的腎小球硬化與間質(zhì)纖維化是 DN發(fā)展至終末期腎衰竭的主要病理表現(xiàn)。ECM是細(xì)胞外大分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò),主要包括膠原、層黏連蛋白及纖維連接蛋白等,其過度堆積或降解減少均視為病理性重塑,是腎臟病變發(fā)生發(fā)展的主要原因。生理狀態(tài)下,ECM受各種因子的調(diào)節(jié)保持生成和降解的平衡,其中主要為金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、組織蛋白酶、纖溶酶原等,而纖溶酶原激活后不僅能直接降解細(xì)胞外基質(zhì),還能激活金屬蛋白酶間接降解基質(zhì),處于各種調(diào)節(jié)酶系的上游,發(fā)揮更為重要的作用。冬蟲夏草(CS)為我國傳統(tǒng)名貴中藥,具有補(bǔ)肺腎、止咳嗽、益虛損、養(yǎng)精氣之功能,但其保護(hù)腎臟的具體機(jī)制尚未完全明了,本研究觀察CS干預(yù)對局部纖溶系統(tǒng)紊亂的作用,揭示其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級 8周齡雄性 Wistar大鼠 44只,體重(180±10)g,山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 藥物與試劑 蟲草菌絲粉由杭州中美華東制藥有限公司提供。鏈脲佐菌素(STZ)購自 Sigma公司。兔抗大鼠纖溶酶原激活物(t-PA)抗體為博士德產(chǎn)品;兔抗大鼠纖溶酶原激活物抑制劑 (PAI)、兔抗大鼠Ⅳ型膠原(ColⅣ)抗體為美國 Santa-Cruz公司產(chǎn)品;兔抗大鼠纖維連接蛋白(FN)為北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物模型的建立與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 w后隨機(jī)分為正常對照組 10只,模型組 12只,CS早期干預(yù)組 11只,CS晚期干預(yù)組 11只。模型組大鼠給予STZ 55 mg/kg體重腹腔內(nèi)注射,STZ粉末用 pH4.5的檸檬酸緩沖液溶解,正常對照組給予同等劑量的檸檬酸緩沖液腹腔內(nèi)注射。72 h后給予尾靜脈采血測血糖,凡隨機(jī)血糖在 16.7 mmol/L者視為糖尿病模型成功(其中有1只未成模型)。CS干預(yù)組造模同模型組,早期干預(yù)組大鼠于成模后即開始每天給予CS粉末混懸液 5.0 mg/kg/體重灌胃,晚期干預(yù)組于成模后 4w開始灌胃,CS劑量同早期組。正常組和模型組的大鼠分別給予等量的清水的灌胃。在飼養(yǎng)過程中,模型組死亡 2只,早期干預(yù)組死亡 1只。

1.4 血生化指標(biāo)檢測及形態(tài)學(xué)觀察 于 12 w時(shí)測大鼠體重、24 h尿蛋白(代謝籠收集 24 h尿)、血糖,處死大鼠,眼眶取血測肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。取左腎稱重,常規(guī)脫水,石蠟包埋,HE染色觀察腎臟的組織學(xué)變化。

1.5 免疫組化檢測 免疫組化法檢測腎臟 t-PA、PAI、FN及ColⅣ表達(dá)。免疫組化采用卵白素-生物素復(fù)合物 (ABC)技術(shù)。主要步驟如下:組織經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后,用 3%過氧化氫避光封閉 20 min;枸櫞酸水浴修復(fù),正常山羊血清封閉 20 min,滴加不同濃度的一抗;4℃過夜,滴加生物素標(biāo)記的二抗,37℃ 20 min,滴加 ABC,37℃ 20 min,滴加顯色劑 DAB,發(fā)現(xiàn)組織已經(jīng)染色后馬上用蒸餾水沖洗中止顯色。蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、封片。采用北京航空航天大學(xué)計(jì)算機(jī)中心提供的醫(yī)學(xué)彩色圖像分析軟件,分析每只小鼠的腎臟皮質(zhì)組織化學(xué)染色片,100倍顯微鏡下,視野上、下、左、右、中各任意取 2個(gè)腎小球(共 10個(gè)腎小球)進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)單位面積腎小球內(nèi)免疫組化陽性組織所占的比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS17.0軟件包,各組數(shù)據(jù)以 x±s表示,采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況和生化指標(biāo)的變化 注射 STZ后大鼠出現(xiàn)多飲,多食,多尿,消瘦,皮毛無光澤,活動反應(yīng)差,CS干預(yù)后一般情況有所好轉(zhuǎn),早期干預(yù)組效果較晚期組為好。12 w時(shí),模型組、CS干預(yù)組體重較正常組明顯減輕,Scr、尿蛋白、血 BUN、腎重/體重明顯升高(P＜0.01),提示造模成功。干預(yù)組除血糖外,余指標(biāo)都較模型組改善(P＜0.01或 P＜0.05),見表 1。

2.2 腎臟病理組織結(jié)果 光鏡下,HE與 PAS染色均顯示,與正常對照組比較,模型組與干預(yù)組腎小球截面積增大,系膜區(qū)增寬,部分有結(jié)節(jié)性沉積物,毛細(xì)血管壁基底膜增厚,部分腎小管擴(kuò)張,伴空泡樣變性,部分腎小管萎縮,伴單核細(xì)胞,淋巴細(xì)胞浸潤。干預(yù)組上述病變減輕,早期干預(yù)組更明顯,見圖 1。

2.3 腎組織中 t-PA、PAI、FN及 ColⅣ蛋白表達(dá)的變化 免疫組化染色顯示,大鼠腎組織中的 t-PA、PAI主要分布在腎小管基底膜,除部分腎小球系膜區(qū)可有少量著色,腎小球基本無分布。FN、ColⅣ主要分布在腎小球系膜區(qū),毛細(xì)血管基底膜,腎小球囊壁,腎小管基底膜等。與正常對照組比較,PAI、FN和ColⅣ在模型組均增高(P＜0.01),干預(yù)后減輕,早期干預(yù)較晚期干預(yù)效果好;t-PA在模型組、干預(yù)組均減少(P＜0.01),模型組更明顯,見表 2。

圖1 腎臟病病理組織圖片(×400)

表1 12 w末各組大鼠生化指標(biāo)(x±s)

表2 各組大鼠 t-PA、PAI、FN及 ColⅣ蛋白表達(dá)比較(x±s,%)

3 討 論

近年來,DN已成為慢性腎衰竭的主要病因之一。目前認(rèn)為,除了高糖造成腎臟血流動力學(xué)改變以及葡萄糖本身代謝異常所致的外,ECM積聚引起的進(jìn)行性腎小球硬化與間質(zhì)纖維化是 DN進(jìn)行性惡化的主要原因。而引起 ECM積聚的原因在早期主要為合成增多,晚期主要為降解減少。

纖溶酶原纖溶系統(tǒng)是腎小球 ECM的主要降解酶系統(tǒng),除了可直接降解 ECM外,還能將基質(zhì)金屬蛋白酶原分解為基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)〔1〕,處于基質(zhì)降解級聯(lián)的上游,在 ECM降解中,較其他酶更為重要。纖溶酶原激活物分為組織型 (t-PA)與尿激酶型 (u-PA)。t-PA主要參與腎小球及血管內(nèi)血栓溶解及基質(zhì)溶解,u-PA主要參與腎小管間質(zhì)的基質(zhì)降解。PAI-1是纖溶酶原激活物的生理性抑制劑〔2,3〕,在結(jié)締組織演變、凝血、纖溶、補(bǔ)體激活和炎癥反應(yīng)等過程中具有抑制蛋白降解的作用。維持兩者正常的比例對細(xì)胞形態(tài)的維持,細(xì)胞與其間質(zhì)的黏附,細(xì)胞增殖,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及信號表達(dá)等都有重要意義〔4〕。

糖尿病時(shí)高血糖,高胰島素可以上調(diào) 2型糖尿病患者PAI-1的表達(dá),并與腎損害 (尿蛋白)的程度成正相關(guān)〔5〕,體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞與糖基化終末產(chǎn)物 (AGE-BSA)共孵育也有相似的結(jié)果〔6〕。高糖可以通過激活 NF-k B,從功能和 mRNA轉(zhuǎn)錄水平促使 PAI-1/tPA功能紊亂,導(dǎo)致纖溶酶活化減少,ECM降解受到抑制〔7〕。本研究也證實(shí),糖尿病時(shí),PAI的表達(dá)量較正常對照組明顯增多,FN、COLⅣ等ECM主要成分均增多。同時(shí)伴有t-PA表達(dá)量的減少。光鏡病理顯示腎小球肥大,細(xì)胞外基質(zhì)增多,腎小管萎縮,有單核,淋巴細(xì)胞浸潤。

CS是我國傳統(tǒng)的名貴中藥,主要成分為粗蛋白、粗脂肪酸、D甘露醇、尿嘧啶、麥角菑醇、燂糖等,具有多種保健和藥用活性,研究證實(shí)蟲草及人工蟲草對腎臟均具有保護(hù)作用。蟲草可明顯降低 5/6腎切除模型鼠尿素氮及肌酐水平,阻抑腎小球的代償性肥大,明顯減輕腎臟病理改變,尤其是對腎小管間質(zhì)的病變有明顯的防治作用〔8〕。長期服用蟲草醇提取液能延緩腎功能衰竭大鼠的腎功能減退,減輕蛋白尿,糾正氨基酸,蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝紊亂。CS對氨基糖甙所致腎臟氧耗下降,減輕氨基糖甙溶酶體損傷及脂質(zhì)過氧化損傷,降低組織鈣含量,以及對損傷狀態(tài)下腎內(nèi)腎組織表皮生長因子調(diào)節(jié)的保護(hù),促進(jìn)腎小管的再生修復(fù)有關(guān)〔9〕。本研究也證實(shí) CS干預(yù)后,DN大鼠一般情況較模型組好轉(zhuǎn),血肌酐,尿素氮減少,腎臟病理改變減輕。t-PA/PAI紊亂得到部分糾正,提示蟲草治療DN的機(jī)制之一為糾正纖溶酶原系統(tǒng)的紊亂,且早期干預(yù)較晚期干預(yù)效果好。至于CS中的具體什么成分起作用,有無副作用,多大劑量為最佳治療量,還需要進(jìn)一步的研究。

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