表皮細(xì)胞生長因子對角質(zhì)形成細(xì)胞體外增殖作用的研究

楊曉波 王思斯 卿欽 王沼丹 楊云霞△

(1.四川省雙流縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,四川 成都 610200;2.四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心,四川 成都 610044)

細(xì)胞增殖、分化、成熟的調(diào)控依賴多種活性蛋白質(zhì)及多肽,統(tǒng)稱為生長因子。目前已發(fā)現(xiàn)包括表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)在內(nèi)的多種生長因子。重組人表皮生長因子(recombinant human EGF,rhEGF)是通過人工合成的表皮生長因子基因片段在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行有效表達(dá)而獲得的可促進(jìn)多類細(xì)胞生長的多肽類物質(zhì),其活性和結(jié)構(gòu)與天然產(chǎn)物高度一致[1]。具有廣泛的促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織再生的生物學(xué)活性,對體表創(chuàng)傷、燒傷和潰瘍等創(chuàng)面的治療具有較大的臨床應(yīng)用價值。臨床手術(shù)無菌切口情況下,由于沒有感染存在,rhEGF對創(chuàng)面是否像其他創(chuàng)面一樣有效,在臨床應(yīng)用方面尚有一定的爭議。rhEGF對人角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期尚未見報道,本文就rhEGF對人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖作用及其細(xì)胞周期進(jìn)行分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 角質(zhì)形成細(xì)胞,由小兒包皮環(huán)切術(shù)后標(biāo)本制得。實(shí)驗(yàn)時將細(xì)胞懸液按一定細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中,置37℃,5%CO2孵箱中;2-3d換液一次;當(dāng)細(xì)胞長滿瓶皿70-80%時,根據(jù)需要傳代或凍存細(xì)胞。

1.1.2 試劑 rhEGF,經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵獲得,凍干粉保存,臨用時用生理鹽水配制成所需濃度。DMEM、PRMI-1640培養(yǎng)基(Gibco),小牛血清、胎牛血清(成都哈里生物工程有限公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(M TT)(Sigma)。金因肽(JYT)：無色透明液體,規(guī)格：15ml?支-1,2000IU?ml-1,批號：20030904;(深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司)。

1.1.3 儀器 SANYO CO2培養(yǎng)箱(SANYO Labo Autoclave);超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);Epics-XLII型流式細(xì)胞儀(美國);31007R型液體閃爍計(jì)數(shù)器(美國)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細(xì)胞的增殖 取對數(shù)生長期細(xì)胞1.5×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 100μ l,設(shè) 6個復(fù)孔。加 rhEGF使?jié)舛葹?,5,10,20,50,100 ng?ml-1及調(diào)零孔加100μ l培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48h,結(jié)束前4h,加 10μ l M TT,常規(guī)終止實(shí)驗(yàn),與DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光值,波長490nm。按下列公式計(jì)算相對增殖率(Relative growth rate,RGR)：RGR=給藥孔吸光度值/對照孔吸光度值×100%。

1.2.2 不同作用時間對細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞1.5×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100μ l,設(shè)6個復(fù)孔。分別在不同時間(6,12,24,48,72h)加濃度為10 ng?ml-1rhEGF培養(yǎng),結(jié)束前4h,加10μ l MTT,常規(guī)終止實(shí)驗(yàn),按照2.1的方法測定吸光值并計(jì)算相對增殖率。

1.2.33HtdR摻入法測細(xì)胞生長率 以每孔2×105個細(xì)胞的濃度加入六孔板中,設(shè)4個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的rhEGF作用與細(xì)胞48h,然后加入3HtdR(3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷)(終濃度為0.5μ Ci?ml-1)。6h后收集細(xì)胞,紙片法在液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞的液體閃爍計(jì)數(shù)(cpm)值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 接種2×105個細(xì)胞于75ml培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的rhEGF作用于細(xì)胞48h,收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀激發(fā)光源為15mW 氬離子激光器,激發(fā)波長488mm,應(yīng)用Expo 32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析,用Muticycle AV分析軟件對DNA細(xì)胞周期擬合;根據(jù)細(xì)胞周期時相,計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100% 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)及x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MT T法測定細(xì)胞的增殖 結(jié)果見表1,rhEGF在濃度為5～100 ng?ml-1均可以促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞的生長,在 10 ng?ml-1時促進(jìn)細(xì)胞的生長的作用最為明顯。

2.2 不同作用時間對細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果見表2,濃度為10 ng?ml-1的rhEGF在各時間點(diǎn)均可以促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞的生長,作用48h促進(jìn)細(xì)胞的生長的作用最為明顯。

表1 重組人表皮細(xì)胞生長因子對表皮細(xì)胞吸光值及增殖率的影響±s,n=6)

組別(ng?ml-1) 光密度 相對增殖率(%)對照組 0.69±0.020 rhEGF 5 0.93±0.019 134.7810 0.99±0.010 143.4820 0.95±0.018 137.6850 0.92±0.013 133.33100 0.91±0.011 131.88

表2 重組人表皮細(xì)胞生長因子作用不同時間對表皮細(xì)胞吸光值及增殖率的影響(,n=6)

表2 重組人表皮細(xì)胞生長因子作用不同時間對表皮細(xì)胞吸光值及增殖率的影響(,n=6)

組別 光密度 相對增殖率(%)對照組 0.69±0.020作用時間(小時) 6 0.91±0.017 131.8812 0.92±0.014 133.3324 0.94±0.021 136.2348 0.99±0.010 143.4872 0.92±0.013 133.33

2.33HtdR摻入法測細(xì)胞生長率 不同濃度的rhEGF作用與細(xì)胞48h,用3HtdR摻入法測定細(xì)胞生長,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhEGF在濃度為5～50 ng?ml-1均可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長,在10 ng?ml-1時促進(jìn)細(xì)胞的生長的作用最為明顯,經(jīng)t檢驗(yàn)各濃度rhEGF與對照組相比有明顯差異(P＜0.01)(表3)。

表3 重組人表皮細(xì)胞生長因子促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長的cpm值(,n=4)

表3 重組人表皮細(xì)胞生長因子促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長的cpm值(,n=4)

與對照組相比：△△P＜0.01

組別(ng?ml-1) Cpm值對照組 875.67±332.85 rhEGF 5 2541.67±38.40△△10 3304.33±134.24△△50 2982.33±88.56△△

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 rhEGF處理組的細(xì)胞在DNA合成前期減少,而處于DNA合成期的細(xì)胞相對增加,S和G2/M期細(xì)胞數(shù)增加,G0/G1細(xì)胞數(shù)減少,增殖率較未用rhEGF組明顯增高,相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明重組人表皮細(xì)胞生長因子可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的分裂增殖,結(jié)果見表4。

表4 重組人表皮細(xì)胞生長因子對角質(zhì)形成細(xì)胞周期的影響以及增殖指數(shù)的變化(,n=6)

表4 重組人表皮細(xì)胞生長因子對角質(zhì)形成細(xì)胞周期的影響以及增殖指數(shù)的變化(,n=6)

與對照組相比：△P＜0.05,△△P＜0.01,△△△P＜0.001

組別(ng?ml-1) G0/G1期(%) S期(%)G2/M期(%) 增殖指數(shù)rhEGF 0 53.9 29.4 16.7 46.15 39.3 41.3 19.4 60.7△10 31△ 39.9 29.1 69△△△50 35.8△ 42.3 21.9 64.2△△

3 討論

表皮生長因子(EGF)是廣泛存在于人體多種組織的一種多肽因子,具有刺激上皮細(xì)胞增生,加快創(chuàng)傷愈合的作用[1]。創(chuàng)面愈合能力除與創(chuàng)面產(chǎn)生原因有關(guān)外,還與創(chuàng)面修復(fù)內(nèi)環(huán)境的改變、內(nèi)源性生長因子含量或受體活性等因素有關(guān)。EGF與其受體結(jié)合可激活直接調(diào)控或誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)生長基因,參與體表創(chuàng)傷的愈合過程。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中,由于組織中的EGF含量普遍較低,難以滿足細(xì)胞增殖和肉芽組織發(fā)育的需要,因此,理論上外源性的EGF可加速創(chuàng)面的愈合速度[2]。

目前,重組人表皮生長因子已成為多種創(chuàng)傷的治療藥物,如在燒傷及各種慢性創(chuàng)面、消化系統(tǒng)潰瘍、口腔潰瘍、角膜潰瘍的治療中取得了一定進(jìn)展。臨床手術(shù)無菌切口情況下,由于沒有感染存在,愈合比感染傷口為快,rhEGF對創(chuàng)面是否像其他創(chuàng)面一樣有效,在外科手術(shù)后切口應(yīng)用的實(shí)際價值方面尚有一定的爭議。有研究顯示,在小兒腭裂修復(fù)時使用基因重組人表皮生長因子,能有效地促進(jìn)和加快切口愈合[3]。為此我們從小兒包皮環(huán)切術(shù)后皮膚標(biāo)本制得角質(zhì)形成細(xì)胞,觀察 rhEGF對其是否具有增殖作用,結(jié)果顯示,rhEGF對人角質(zhì)形成細(xì)胞具有促增殖作用,而且在10 ng?ml-1時作用最為明顯;MT T法和3HtdR摻入法測細(xì)胞生長率結(jié)果一致,作用48h促進(jìn)增殖作用最為明顯。流式細(xì)胞術(shù)的進(jìn)一步研究表明rhEGF處理細(xì)胞48h后處于DNA合成期的細(xì)胞增加,細(xì)胞增殖率分別較陰性對照組增加,表明rhEGF促進(jìn)細(xì)胞增殖與加快細(xì)胞周期有關(guān),可促使更多的細(xì)胞進(jìn)入分裂期。以往的動物研究顯示rhEGF可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[4-5]。

EGF的量效關(guān)系有不同的報道,一般認(rèn)為在適當(dāng)濃度時可有效刺激表皮細(xì)胞的增殖,過高濃度的rhEGF并不促進(jìn)細(xì)胞的增殖,生物學(xué)效應(yīng)反而降低,其機(jī)制可能是rhEGF受體活性的下調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rhEGF小、中、大劑量之間未見明顯的量效關(guān)系,在所選的劑量范圍內(nèi)均能有效地促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合,但小劑量就能夠達(dá)到有效的治療目的。

1 Jahovic N,Guzel E,Arbak S,et al.The healing-promoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor(EGF)：role of the neutrophils[J].Burns,2004,30(6)：531-538.

2 Hardwicke J,Ferguson EL,M oseley R,et al.Dextrin-rhEGF conjugates as bioresponsive nanomedicines for wound repair[J].J Control Release,2008,130(3)：275-283.

3 王懷谷,汪春蘭,李光早,等.基因重組人表皮生長因子在腭裂修復(fù)術(shù)中的應(yīng)用[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,33(1)：41-42.

4 郝杰,彭波,楊云霞,等.重組人表皮生長因子加速皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].四川生理科學(xué)雜志,2006,28(4)：156-158.

5 繆世坤,彭波,楊云霞,等.重組人表皮生長因子對大鼠皮膚燒傷愈合的促進(jìn)作用[J].四川生理科學(xué)雜志,2007,29(3)：107-108.

6 Duconge J,Prats PA,Valenzuela C,et al.Topical disposition of two strengths of a 125I-rhEGF jelly in rat skin wounds[J].Biopharm Drug Dispos.,2004,25(5)：193-201.