補(bǔ)腎活血法對腎陽虛大鼠內(nèi)耳細(xì)胞Caspase-3凋亡影響的實(shí)驗研究

李 莉，王俊鋒，熊大經(jīng)

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)耳鼻喉科教研室，四川 成都 610075）

耳聾是耳鼻咽喉科的常見病之一。近年來的臨床調(diào)查表明，明顯聽力障礙者約占世界總?cè)丝诘?%～10%［1］，耳聾已成為影響人類生活質(zhì)量的最主要問題之一。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為，“腎主骨，在竅為耳”，“腎氣通于耳，腎和則耳能聞五音亦”（《靈樞·脈度篇》），耳司聽覺從屬于腎，腎氣足則聽覺聰敏，腎虛則耳鳴耳聾?，F(xiàn)代研究已表明中醫(yī)腎與耳在醛固酮、甲狀腺素、微量元素等方面存在著密切的聯(lián)系，但鮮見從更深的層次細(xì)胞凋亡來探討二者的關(guān)系。基于此，本實(shí)驗采用補(bǔ)腎活血法來觀察腎陽虛大鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的凋亡情況并探討其作用機(jī)制，從而為中醫(yī)腎與耳的關(guān)系提供新的實(shí)驗資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物 用耳廓反應(yīng)靈敏的健康SD大鼠30 只，體重（220±20）g，雌雄各半（由四川大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，合格證號：24101113），飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥理實(shí)驗中心，室內(nèi)溫度控制在20℃～25℃。

1.1.2 主要試劑及儀器 醋酸強(qiáng)的松龍注射液由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)（批號：021225）。Cap－sase-3試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供（批號：BAO0588）。主要儀器有MEB-2208肌電圖/誘發(fā)電位儀、FJ-2008pr自動計數(shù)儀等，cAMP、cGMP放射免疫測定箱均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室。

1.1.3 實(shí)驗藥物 補(bǔ)腎活血方由山茱萸、熟地、山藥、枸杞子、紅花、水蛭等10味藥組成，按比例煎成濃度為1.458 g/mL的溶液，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制備。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 造模與分組 自由喂養(yǎng)1 w后，按體重、雌雄隨機(jī)選取10只用作空白對照組，其余20只造模。造模方法如下：先將醋酸強(qiáng)的松龍注射液125 mg/5mL用生理鹽水稀釋為5 mg/mL，按0.8 mg/100 g量后腿肌肉注射，每天1次，連續(xù)10 d。將造模后大鼠隨機(jī)分成模型組、中藥組，每組10只。

1.2.2 各組用藥及處理 造模后，空白對照組與模型組每天灌胃10 mL/kg的生理鹽水，中藥組每天灌胃14.58 g生藥/kg的補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方（1.458 g生藥/mL）。每日灌胃1次，連續(xù)給藥2 w。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 一般情況觀察 實(shí)驗期間觀察大鼠的反應(yīng)、活動情況、進(jìn)食量、毛色、大小便等，隔日稱體重。

1.2.3.2 測定環(huán)磷酸腺苷 （cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量 采用放射免疫法，采血用0.5 mol/L EDTA（pH 7.5）生理鹽水溶液抗凝，用量為血液體積的1%。取股動脈血，搖勻放入冰浴中，1 h內(nèi)離心10 min（2000轉(zhuǎn)/min），取出血漿置于－15℃～－20℃保存，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。然后嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.3.3 聽性腦干反應(yīng)（ABR） 以美國Larson Davis公司生產(chǎn)的聲級計，校準(zhǔn)日本NIHON KONDEN公司生產(chǎn)的MEB-2208肌電圖/誘發(fā)電位儀檢測。大鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮注射液（劑量為5 mg/100 g按大鼠實(shí)際體重計算，必要時用一般劑量重復(fù)一次）進(jìn)行麻醉。記錄針電極插入顱中線前囟皮下，參考電極和地線分別置于左側(cè)和右側(cè)耳后皮下。YE-102J型耳塞插入耳廓內(nèi)距鼓膜1 cm處并保持密閉，左耳分別以10 Hz和50 Hz刺激率、80 dB SPL疏密交替極性短聲刺激，右耳以50 dB SPL白噪聲掩蔽，記錄通頻帶 1 Hz～3 KHz，靈敏度 10 μV/格（μV/D），分析時間1 ms/格（ms/D），疊加200次記錄ABR。每次重復(fù)測試3次觀察重復(fù)性，以潛伏期最短、幅度最高的波型為準(zhǔn)，并記錄ABR閾值。

1.2.3.4 耳蝸HE染色 處死動物后，迅速取出聽泡，用4%多聚甲醛固定液固定48 h，10%的EDTA脫鈣1 w后，逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，平行于蝸軸方向切片。切片4 μm，HE染色。

1.2.3.5 耳蝸切片Caspase-3染色 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察Caspase-3染色情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

每組均隨機(jī)選取6只大鼠測試指標(biāo)并納入統(tǒng)計。SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 動物的一般情況

造模過程中實(shí)驗大鼠逐漸出現(xiàn)飲食減少，體溫下降，蜷縮懶動、倦怠，畏寒喜暖，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)失去光澤，體重增長緩慢等不良反應(yīng)。用藥后，實(shí)驗大鼠飲食逐漸增加，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，脫毛現(xiàn)象逐漸減少，精神好轉(zhuǎn)，體重增加明顯?？瞻讓φ战M未見明顯異常。給藥2 w后各組大鼠體重比較，結(jié)果見表1。

表1 給藥2 w后各組大鼠體重比較 （g，±s）

表1 給藥2 w后各組大鼠體重比較 （g，±s）

注：與空白對照組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01

組別 n 體重空白對照組 6 244.9583±2.79129模型組 6 226.0517±3.414731）中藥組 6 243.4833±4.967922）

由表1可以看出，模型組大鼠體重顯著低于空白對照組（P<0.01），而中藥組與空白對照組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中藥組大鼠體重較模型組顯著增加（P<0.01）。

2.2 給藥后各組大鼠血漿cAMP、cGMP含量及其cAMP/cGMP比值比較

結(jié)果見表2。

表2 用藥2 w后各組大鼠血漿cAMP、cGMP含量及其比值比較 （±s）

表2 用藥2 w后各組大鼠血漿cAMP、cGMP含量及其比值比較 （±s）

注：與空白對照組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01

組別 n cAMP（fM/mL） cGMP（fM/mL） cAMP/cGMP空白對照組 6167.8967±14.6604 229.6850±14.52520.7300±0.4850模型組 6 49.5450±12.68141） 324.6183±37.07071）0.1802±0.55011）中藥組 6200.3417±14.25452） 287.3177±15.07010.6957±0.25092）

由表2可以看出，模型組大鼠血漿cAMP含量顯著低于空白對照組（P<0.01），中藥組與空白對照組大鼠血漿cAMP含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中藥組大鼠血漿cAMP含量較模型組顯著升高（P<0.01）。與空白對照組比較，模型組大鼠血漿cGMP含量顯著增高（P<0.01），中藥組與空白對照組cGMP含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；模型組大鼠cAMP/cGMP比值顯著低于空白對照組（P<0.01），中藥組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中藥組cAMP/cGMP比值與模型組相比顯著增高（P<0.01）。

2.3 給藥后各組大鼠ABR閾值比較

結(jié)果見表3。

表3 用藥2 w后各組大鼠ABR閾值比較 （dB SPL，±s）

表3 用藥2 w后各組大鼠ABR閾值比較 （dB SPL，±s）

注：與空白對照組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01

組別 n ABR閾值空白對照組 6 4.59833±0.231379模型組 6 7.29583±0.5169191）中藥組 6 4.71867±0.3633732）

由表3可以看出，模型組大鼠ABR閾值較空白對照組顯著升高（P<0.01），中藥組大鼠ABR閾值較空白對照組升高，但差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。中藥組ABR閾值與模型組比較顯著降低（P<0.01）。

2.4 給藥后各組大鼠耳蝸切片HE染色情況比較

各組大鼠耳蝸切片都未見蝸神經(jīng)及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性，血管紋處清晰，Corti器處也無炎細(xì)胞浸潤。但Corti器毛細(xì)胞數(shù)目各組之間有著明顯的變化。空白對照組Corti器毛細(xì)胞數(shù)目正常，未見缺損；模型組Corti器毛細(xì)胞數(shù)目較正常明顯減少；中藥組Corti器毛細(xì)胞數(shù)目大多正?；蛉?，僅有少部分喪失1個左右。結(jié)果見圖1～圖3，表4。

表4 給藥2 w后各組大鼠耳蝸殘存毛細(xì)胞計數(shù)比較 （個，±s）

表4 給藥2 w后各組大鼠耳蝸殘存毛細(xì)胞計數(shù)比較 （個，±s）

注：與空白對照組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01

組別 n 毛細(xì)胞計數(shù)空白對照組 6 16.65±4.34模型組 6 9.79±4.341）中藥組 6 15.21±4.192）

2.5 用藥后各組大鼠耳蝸切片免疫組化情況比較

模型組大鼠耳蝸組織切片Caspase-3免疫組化染色呈強(qiáng)陽性，顏色呈棕黃色，染色范圍超過一半，Corti器上毛細(xì)胞普遍發(fā)生凋亡?？瞻讓φ战M耳蝸組織切片Caspase-3免疫組化染色淺，比陰性略強(qiáng)，染色范圍較小，Corti器上毛細(xì)胞僅有極少部分凋亡陽性染色，多數(shù)無凋亡發(fā)生。中藥組免疫組化染色呈不典型弱陽性，染色較淺，而且大多數(shù)毛細(xì)胞無凋亡發(fā)生。結(jié)果見圖4～圖6，表5。

表5 給藥2 w后各組大鼠耳蝸切片Corti器免疫組化染色陽性強(qiáng)度情況

3 討 論

圖1 空白對照組大鼠耳蝸HE×400

圖2 模型組大鼠耳蝸HE×400

圖3 中藥組大鼠耳蝸HE×400

圖4 空白對照組大鼠耳蝸Caspase-3染色

圖5 模型組大鼠耳蝸Caspase－3染色

圖6 中藥組大鼠耳蝸Caspase－3染色

3.1 腎陽虛動物模型的評價

合理的動物模型是開展醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腎陽虛動物模型的研究至今已有幾十年的歷史，取得了長足的進(jìn)展。目前常用的方法有皮質(zhì)激素造模法、抑制甲狀腺功能法、抑制DNA合成等法。而皮質(zhì)激素造模法是應(yīng)用最廣泛的造模方法，該方法經(jīng)過多方面的驗證，已成為應(yīng)用較多且較公認(rèn)的腎陽虛模型之一。我們在實(shí)驗中觀察到，大鼠在肌肉注射醋酸強(qiáng)的松龍注射液后，出現(xiàn)了飲食減少，體溫下降，蜷縮懶動、倦怠，畏寒喜暖，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)失去光澤，體重增長緩慢等不良反應(yīng)，符合腎陽虛的臨床特征，而且血漿中cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP比值降低，也進(jìn)一步支持腎陽虛模型，這也是公認(rèn)的腎陽虛證的特異性病理變化之一［2］。

3.2 補(bǔ)腎活血法對腎陽虛大鼠聽力的影響

ABR是Jewett在1970年利用電子計算機(jī)技術(shù)描記成功并命名的一種均和誘發(fā)電反應(yīng)。它可無損傷地描記不到1 μV的極小的生物電位。目前ABR在聽覺誘發(fā)電位中是應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最快的一項技術(shù)。ABR為突觸后電位，在一定刺激強(qiáng)度下相當(dāng)穩(wěn)定，其兩耳間幾乎無差別，個體間和性別間差異均在0.2 ms以內(nèi)，而且鎮(zhèn)靜藥、麻醉藥等對ABR皆無影響。因此ABR各波潛伏期是良好的觀測指標(biāo)。ABR的臨床應(yīng)用主要有：①了解聽閾情況；②了解聽神經(jīng)至外側(cè)丘系處的神經(jīng)功能是否完整，即確定病變部位［3］。由此我們可通過檢測ABR來客觀了解中藥治療后大鼠的聽力情況。

本實(shí)驗結(jié)果表明，腎陽虛大鼠ABR反應(yīng)閾升高，中藥組可降低ABR反應(yīng)閾，說明補(bǔ)腎活血法具有改善腎陽虛大鼠聽力的作用。中藥復(fù)方可能通過整體的調(diào)節(jié)改善內(nèi)耳的聽覺通路傳導(dǎo)，或直接促進(jìn)內(nèi)耳細(xì)胞功能活動，從而提高耳蝸感音功能。其中方中的黃芪、山茱萸、懷山藥、五味子等均有增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用，而且黃芪還有促使Na＋、K＋、ATP酶的活性增高，保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞，改善聽力的作用。

3.3 補(bǔ)腎活血法對抗腎陽虛大鼠內(nèi)耳細(xì)胞Capsase－3 的凋亡

凋亡是一高度可調(diào)控的生理過程，它在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟以及維持正常組織和器官的細(xì)胞數(shù)目恒定與生長平衡、人體衰老及疾病發(fā)生等方面都起著重要作用。在細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)的研究中，許多蛋白酶尤其是蛋白酶同源物的發(fā)現(xiàn)，使蛋白酶在細(xì)胞凋亡中的重要地位越來越被人所關(guān)注［4］。目前已發(fā)現(xiàn)一類并且已成為研究熱點(diǎn)的是Caspase家族。目前已發(fā)現(xiàn)該蛋白酶家族成員至少有14個，其中最關(guān)鍵的是Caspase-3。本實(shí)驗中模型組大鼠的耳蝸Corti器毛細(xì)胞普遍發(fā)生凋亡，染色呈強(qiáng)陽性且較深，中藥組僅部分細(xì)胞凋亡呈弱陽性染色且較淺，說明中藥復(fù)方在腎陽虛所誘發(fā)的耳蝸毛細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期，能夠?qū)蛊涞蛲龅陌l(fā)生。許多活血化瘀中藥作為氧自由基的清除劑，通過對氧離子的清除作用，能對抗耳蝸損害時產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［5］，有效保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，緩解細(xì)胞凋亡發(fā)生?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)腎活血方中山茱萸能夠抑制血小板聚集，降低血黏度，抑制脂質(zhì)過氧化的作用。五味子能改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能，可加強(qiáng)調(diào)節(jié)腎臟小動脈的能量代謝，延緩衰老。紅花、水蛭能改善耳蝸微循環(huán)，抗血栓形成的作用。其中黃芪、五味子還可誘導(dǎo)IL-2、INF的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［6］。中藥復(fù)方能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，有效減輕或阻止疾病的發(fā)展，可能與黃芪、熟地、五味子等藥物的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用有關(guān)，還可能與紅花、水蛭等具有清除氧自由基的作用有關(guān)。

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