超聲波協(xié)同等電點(diǎn)沉淀法提取螺旋藻藻膽蛋白工藝的優(yōu)化

朱 劼，董文杰，劉 佳

(1.江蘇工業(yè)學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.江蘇工業(yè)學(xué)院數(shù)理學(xué)院，江蘇 常州 213164)

超聲波協(xié)同等電點(diǎn)沉淀法提取螺旋藻藻膽蛋白工藝的優(yōu)化

朱 劼1，董文杰1，劉 佳2

(1.江蘇工業(yè)學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.江蘇工業(yè)學(xué)院數(shù)理學(xué)院，江蘇 常州 213164)

以螺旋藻粉為原料，通過正交試驗(yàn)，對(duì)超聲波細(xì)胞破碎及等電點(diǎn)沉淀提取藻膽蛋白進(jìn)行研究，并優(yōu)化其工藝條件。結(jié)果表明，在藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、630W(額定功率為900W)條件下超聲20min，效果最佳；而采用冰醋酸作為等電點(diǎn)沉淀介質(zhì)，在pH4.0的條件下，從提取液中低溫沉淀藻蛋白，其操作較為簡(jiǎn)便。由于冰醋酸溶液易揮發(fā)分離，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。最后通過冷凍干燥，得到粗蛋白粉末。利用本法優(yōu)化工藝后，提取液中藻藍(lán)蛋白的含量高達(dá)4.36%；而經(jīng)沉淀干燥得到的粗蛋白粉末得率為52.5%，其中藻藍(lán)蛋白含量為7.7%、別藻藍(lán)蛋白含量為7.9%、藻紅蛋白含量為0.8%。

螺旋藻；藻膽蛋白；超聲波細(xì)胞破碎；等電點(diǎn)沉淀

鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是一種生長(zhǎng)在熱帶及亞熱帶堿性湖泊中的微藻類植物，富含各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及活性成分，如蛋白質(zhì)、γ-亞麻酸、β-胡蘿卜素、維生素及鈣、鋅、鐵、鉀、鎂、硒等礦物質(zhì)和微量元素，被聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織稱之為“21世紀(jì)人類最理想的天然保健食品”[1-3]。其中，藻膽蛋白的含量高達(dá)10%左右，主要有藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)、藻紅蛋白(p h y c o e r y t h r i n，P E)及別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)等3類。大量實(shí)驗(yàn)表明，螺旋藻膽蛋白具有提高人體免疫力、促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，同時(shí)在抗輻射、抗疲勞、清除自由基等方面也具有一定的生理活性，存在很高的藥

用價(jià)值[4-8]。而對(duì)于其生物活性蛋白的提取、分離及純化，已成為螺旋藻深加工研究和開發(fā)的熱點(diǎn)[9-10]。

超聲波細(xì)胞破碎具有高提出率、提取時(shí)間短、節(jié)約溶劑、低溫提取有效成分等優(yōu)點(diǎn)[11]；而蛋白質(zhì)等電點(diǎn)法則利用等電點(diǎn)處蛋白質(zhì)溶解度最小的原理，在低溫下析出大量蛋白質(zhì)[12]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波協(xié)同等電點(diǎn)沉淀法從螺旋藻粉中提取活性藻膽蛋白，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻粉 常州溧陽天目湖保健品有限公司；濃硫酸、冰乙酸、NaHPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1型冷凍干燥機(jī) 鞏義市京華儀器有限公司；JYD-900智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(額定功率900W 上海之信儀器有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA1104型分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

藻懸液的配制：稱取一定量的螺旋藻粉，加去離子水混勻，使藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%、10%、15%，待用；超聲細(xì)胞破碎：將配制好的藻懸液在20℃，一定超聲功率下間歇超聲一段時(shí)間，按正交表(表1)進(jìn)行正交試驗(yàn)；分離上清液：將細(xì)胞破碎后的懸濁液在5000 r/min離心20min，收集上清液，并分析其中藻藍(lán)蛋白的含量及其純度；等電點(diǎn)沉淀藻膽蛋白：將0.1mol/L的稀硫酸和0.1mol/L的冰醋酸分別加入上清液中，邊滴加邊攪拌混勻，分別調(diào)節(jié)pH值至3、3.5、4、4.5、5、6，靜置6h后，在4℃以5000r/min離心25min，收集蛋白沉淀；然后采用冷凍干燥的方法得到粗蛋白粉末，計(jì)算其得率，并分析其成分。

1.4 正交試驗(yàn)

表1 超聲波細(xì)胞破碎正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of ultrasonic cell disruption

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果[13]，以超聲功率(額定功率900W)、超聲時(shí)間及藻懸液質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，綜合分析提取液中藻藍(lán)蛋白含量及其純度，確定最佳超聲細(xì)胞破碎工藝條件，方案見表1。

1.5 分析方法

1.5.1 提取液中藻膽蛋白分析方法

螺旋藻中以藻膽蛋白吸收光譜的差異作為其鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。藻藍(lán)蛋白(PC)最大光吸收在620nm波長(zhǎng)處，別藻藍(lán)蛋白(APC)在650nm波長(zhǎng)處，藻紅蛋白(PE)最大光吸收在490～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，藻紅藍(lán)蛋白(PEC)在568nm波長(zhǎng)處。提取液中藻藍(lán)蛋白的純度及各組分質(zhì)量濃度按如下公式計(jì)算[13-15]：

式中：A568、A620、A650分別為蛋白溶液在波長(zhǎng)568、620nm和650nm處的吸光度；c為提取液中各蛋白的質(zhì)量濃度/(mg/mL)，參照公式(2)～(4)計(jì)算；V為提取液體積/mL；Y為提取液中各種藻膽蛋白的含量；mSP為藻粉原料的質(zhì)量/mg。

1.5.2 蛋白沉淀的pH值測(cè)定

經(jīng)等電點(diǎn)沉淀，將離心收集的蛋白沉淀置于通風(fēng)櫥中敞口干燥，每隔15min，準(zhǔn)確稱取0.02g蛋白質(zhì)沉淀，溶于2.0mL去離子水中，使其質(zhì)量濃度達(dá)到1g/100mL，并測(cè)其pH值，用以測(cè)試等電點(diǎn)沉淀法中酸性物質(zhì)稀硫酸及冰醋酸在蛋白沉淀中的殘余情況。

1.5.3 粗蛋白粉末中藻膽蛋白組成及其含量分析方法

冷凍干燥后，準(zhǔn)確稱取粗蛋白粉末0.02g，充分溶解于2.0mL磷酸緩沖液(pH7.0)，在4℃、5000r/min離心25min，吸取上清液，在波長(zhǎng)568、620、650nm處測(cè)吸光度，分別計(jì)算粗蛋白粉中藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白及別藻藍(lán)蛋白的含量。計(jì)算公式如下[9]：

式中：m＇SP為經(jīng)冷凍干燥后，得到的粗蛋白粉末質(zhì)量/mg；C＇為粗蛋白粉末溶解于磷酸緩沖液后各蛋白的質(zhì)量濃度/(mg/mL)，參照公式(2)～(4)計(jì)算；V＇為蛋白溶液體積/mL；Y＇PC為粗蛋白中藻藍(lán)蛋白的含量1/%，參照公式(7)計(jì)算；YPC為最初提取液中藻藍(lán)蛋白的含量1/%，參照公式(5)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻細(xì)胞超聲破碎工藝條件的確定

根據(jù)表1中三因素三水平的條件，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)表，采用極差分析，以確定超聲破碎細(xì)胞的最佳工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 超聲細(xì)胞破碎工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of orthogonal array design for the optimization of ultrasonic cell disruption

從表2中藻藍(lán)蛋白含量的極差分析(R)可以看出，對(duì)于提取液中的藻藍(lán)蛋白含量而言，3個(gè)影響因素中，藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)其影響最大，超聲功率次之，而超聲時(shí)間的影響最小。結(jié)果表明，藻液的配比濃度對(duì)超聲波細(xì)胞破碎影響最大，其主要原因有兩點(diǎn)：首先，藻粉在懸濁于水的過程中本身需要吸收一定的水量，故作為超聲波介質(zhì)的水溶劑量相對(duì)減少。由于超聲波具有在液相中吸收大于在固相中吸收的特性，因此，隨著藻懸液濃度的減少，水溶劑量增大，細(xì)胞受超聲的刺激也增大，破壁率也隨之提高，致使大量胞內(nèi)蛋白溶出；其次，由于藻膽蛋白在超過30℃就開始變性[13]，故提取藻膽蛋白應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。超聲波會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的熱效應(yīng)，若藻液濃度較高，超聲所產(chǎn)生的熱量在局部不易擴(kuò)散，部分蛋白可能會(huì)受熱變性，導(dǎo)致所測(cè)蛋白含量下降。從結(jié)果還可以看出，隨著藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低，經(jīng)超聲后，提取液中藻藍(lán)蛋白的含量也不斷增加。因此，選擇藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

對(duì)于超聲功率而言，對(duì)細(xì)胞破碎具有一定的影響。超聲功率越大，它所產(chǎn)生的超聲波越強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞的破壞性也越大。從結(jié)果看，也符合這一規(guī)律。隨著超聲功率的加強(qiáng)，提取液中藻藍(lán)蛋白的含量也有增加的趨勢(shì)；但超聲波的熱效應(yīng)亦在不斷增強(qiáng)，可能會(huì)造成局部蛋白的變性。從這個(gè)角度考慮，超聲功率應(yīng)盡可能小一些。從表2可以看出，超聲功率的第二、三水平，即630W及720W的結(jié)果較為接近，因此，綜合藻藍(lán)蛋白含量及成本考慮，選擇630W超聲功率比較合適。

本實(shí)驗(yàn)所選擇的超聲時(shí)間對(duì)于細(xì)胞破碎的影響最小。這一因素的3個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為接近。說明超聲時(shí)間超過15min，細(xì)胞的破壁率已經(jīng)基本穩(wěn)定，增加量較少；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波的熱效應(yīng)也會(huì)逐漸增加，因此，從成本角度考慮，可選擇第一個(gè)水平15min。

綜上分析，對(duì)于提取液中藻藍(lán)蛋白的含量，從工業(yè)化角度考慮，最優(yōu)組合為A2B1C3。

從表2中藻藍(lán)蛋白純度的極差分析(R＇)可以看出，超聲功率對(duì)藻藍(lán)蛋白純度的影響最大，藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，而超聲時(shí)間影響最小。

超聲功率對(duì)于藻藍(lán)蛋白純度的影響較為明顯。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，630W超聲時(shí)，藻藍(lán)蛋白的純度最大；而低于或高于630W時(shí)，純度均出現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能為，細(xì)胞破碎過程中，藻紅蛋白首先被釋放到溶液中，然后再為藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。因此，當(dāng)超聲功率較小時(shí)，細(xì)胞破碎較慢，釋放到溶液中的藻藍(lán)蛋白較少；隨著功率逐漸增加，細(xì)胞破碎加快，破碎程度也加大，使得藻藍(lán)蛋白的釋放量增加，純度提高；但功率繼續(xù)加強(qiáng)，導(dǎo)致熱效應(yīng)增加，而藻藍(lán)蛋白易發(fā)生變性，純度再次降低，故超聲功率選用630W。

對(duì)藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)而言，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低，純度不斷上升，可能是由于破壁率提高和熱效應(yīng)減少共同影響的結(jié)果。因此，藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)可選擇5%；對(duì)于超聲時(shí)間，正如上一節(jié)的推測(cè)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大

量的藻藍(lán)蛋白被釋放到溶液中，純度提高，而第二、三水平，即超聲20min及30min的結(jié)果幾乎沒有差別，可認(rèn)為超聲20min后，藻藍(lán)蛋白的釋放已相對(duì)穩(wěn)定，故可選擇第二個(gè)水平20min。因此，對(duì)于提取液中藻藍(lán)蛋白的純度，最優(yōu)組合為A2B2C3。

通過以上分析，藻藍(lán)蛋白含量及純度的最優(yōu)組合出現(xiàn)差異，主要在超聲時(shí)間上。由于超聲15min和20min，對(duì)于藻藍(lán)蛋白的含量幾乎沒有太大區(qū)別，而對(duì)于其純度存在一定的影響，故綜合含量及純度，最優(yōu)條件組合為A2B2C3，即藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、超聲功率630W、超聲時(shí)間20min。

2.2 等電點(diǎn)沉淀工藝的確定

2.2.1 pH值對(duì)提取藻藍(lán)蛋白的影響

分別以稀硫酸及冰醋酸溶液為等電點(diǎn)介質(zhì)進(jìn)行蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表3、4。

表3 不同pH值的稀硫酸溶液對(duì)提取藻藍(lán)蛋白的影響Table 3 Effect of pH on phycocyanin precipitation by the addition of dilute sulfuric acid

表4 不同pH值的冰醋酸溶液對(duì)提取藻藍(lán)蛋白的影響Table 4 Effect of pH on phycocyanin precipitation by the addition of glacial acetic acid

由表3、4可知，采用稀硫酸和冰醋酸作為等電點(diǎn)沉淀的介質(zhì)，在蛋白沉淀效果方面基本相似。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，粗蛋白得率最大達(dá)到52.5%。其中藻藍(lán)蛋白的含量為7.7%，提取率為92.7%。但在藻藍(lán)蛋白的含量方面，pH4.5時(shí)最高，占粗蛋白總量的8.3%左右。由此推測(cè)，藻藍(lán)蛋白的等電點(diǎn)可能位于4.0～4.5之間，當(dāng)pH值從4.0升至4.5時(shí)，藻藍(lán)蛋白的沉淀量下降較為緩慢，而其他藻蛋白的等電點(diǎn)偏離4.5相對(duì)較遠(yuǎn)，沉淀量下降較快，使得藻藍(lán)蛋白在粗蛋白中的比重有所上升。當(dāng)pH值降至3.0時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白開始變性，部分蛋白沉淀不能溶于磷酸緩沖液，故藻藍(lán)蛋白含量及提取率迅速下降。因此，從生產(chǎn)角度考慮，選擇pH值為4.0時(shí)進(jìn)行操作較為合適。

2.2.2 等電點(diǎn)介質(zhì)對(duì)提取藻藍(lán)蛋白的影響

由于采用等電點(diǎn)沉淀需要引入額外的化學(xué)試劑硫酸及冰醋酸，故在提取蛋白過程中必須考慮其在蛋白中的殘留情況。本實(shí)驗(yàn)以蛋白沉淀pH值的變化為依據(jù)，來說明介質(zhì)在沉淀中的殘留情況。

圖1 放置時(shí)間對(duì)不同等電點(diǎn)介質(zhì)提取蛋白質(zhì)pH值的影響Fig.1 pH change during standing for phycocyanin precipitation by the addition of dilute sulfuric acid or glacial acetic acid

從圖1可以看出，離心后的蛋白沉淀置于通風(fēng)櫥中，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，使用冰醋酸作為沉淀介質(zhì)的樣品中，pH值不斷上升，45min后，即由酸性轉(zhuǎn)為中性；而相同時(shí)間內(nèi)，使用稀硫酸作為沉淀介質(zhì)的樣品，其pH值變化不明顯。由此可以推斷，由于冰醋酸易揮發(fā)的特點(diǎn)，殘留于沉淀中的少量冰醋酸溶液，隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷揮發(fā)，且溶質(zhì)冰醋酸的揮發(fā)速度高于溶劑水的速度，使得在較短時(shí)間內(nèi)，便可除去絕大部分冰醋酸；而硫酸不易揮發(fā)的特點(diǎn)，使得其在蛋白沉淀中不易除去。因此，從操作性及成本考慮，可采用易揮發(fā)的冰醋酸替代硫酸作為等電點(diǎn)沉淀的介質(zhì)。

綜合等電點(diǎn)介質(zhì)及pH值對(duì)藻藍(lán)蛋白提取的影響，采用冰醋酸介質(zhì)，在pH值為4.0的條件下進(jìn)行藻蛋白提取，可達(dá)到較好的效果。

2.3 粗蛋白中藻膽蛋白成分分析

根據(jù)公式(2)～(4)及(7)進(jìn)行計(jì)算，在所提取的粗蛋白中，藻藍(lán)蛋白含量Y＇PC為7.7%；別藻藍(lán)蛋白含量Y＇APC為7.9%；藻紅蛋白含量Y＇PE為0.8%。

3 結(jié) 論

通過正交試驗(yàn)，優(yōu)化了超聲波細(xì)胞破碎及等電點(diǎn)沉淀的工藝條件，實(shí)現(xiàn)了在低溫下，較為便捷的從螺旋藻粉中提取活性藻膽蛋白操作。結(jié)果表明，超聲波細(xì)胞破碎的最優(yōu)條件為：藻液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、超聲功率630W、超聲時(shí)間20min；而等電點(diǎn)沉淀則采用冰醋酸為介質(zhì)，在pH值為4.0的條件下提取蛋白。經(jīng)分析，

粗蛋白得率為52.5%；在粗蛋白中，藻藍(lán)蛋白占7.7%、別藻藍(lán)蛋白占7.9%、藻紅蛋白占0.8%。

[1]李神舟, 李岳, 陶明方. 淺談螺旋藻開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用[J]. 科技資訊, 2008(14): 202-204.

[2]鐘耀廣. 木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25 (9): 135-136.

[3]CLAUDIO S. Mass production of Spirulina[J]. Experientia, 1982, 38: 40-43.

[4]NARASIMHA D L R. Nutritional quality of Spirulina platensis[J]. J Sci Food Agric, 1982, 33: 456-460.

[5]SILVEIRA S T, BURKERT J F M, COSTA J A V, et al. Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design [J]. Bioresource Technology, 2007, 98: 1629-1634.

[6]YOSHIDA A, TAKAGAKI Y, NISHIMUNE T. Enzyme immunoassay for phycocyanin as the main component of Spirulina color in foods[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1996, 60: 57-60.

[7]張成武, 曾昭琪, 張媛貞. 鈍頂螺旋藻藻膽蛋白的分離、純化及其理化特性[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 1996, 8(2): 29-33.

[8]PATIL G, RAGHAVARAO K S M S. Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 34(2): 156-164.

[9]張成武, 殷志敏, 歐陽平凱. 藻膽蛋白的開發(fā)與利用[J]. 中國(guó)海洋藥物, 1995(3): 52-53.

[10]溫燕梅, 馮亞非, 部音利. 螺旋藻中藥用成分的綜合提取研究[J]. 食品科技, 2008, 33(6): 168-170.

[11]郭孝武. 超聲提取分離[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 23-44.

[12]董銀卯, 馮明珠, 趙華, 等. 燕麥麩蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定及其稀堿法提取工藝優(yōu)化的研究[J]. 食品科技, 2007, 32(3): 258-265.

[13]朱曉君, 安辛欣, 顧麗, 等. 超聲輔助同時(shí)提取條斑紫菜多糖及藻膽蛋白工藝的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(5): 241-244.

[14]BENNETT A, BOGORAD L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga[J]. J Cell Biol, 1973, 58: 419-435.

[15]劉楊, 王雪青, 龐廣昌, 等. 鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白的富集分離及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 39-42.

Ultrasonic Cell Disruption Followed by Isoelectric Point Precipitation for Extraction of Phycobiliprotein from Spirulina platensis

ZHU Jie1，DONG Wen-jie1，LIU Jia2
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangsu Polytechnic University, Changzhou 213164, China；2. School of Mathematics and Physics, Jiangsu Polytechnic University, Changzhou 213164, China)

A procedure based on ultrasonic cell disruption followed by isoelectric point precipitation was considered for the extraction of phycobiliprotein from Spirulina platensis powder. The respective optimal conditions for ultrasonic cell disruption and isoelectric point precipitation were determined. Results showed that an optimal ultrasonic cell disruption was obtained through 630 W ultrasonic treatment for 20 min of 5% aqueous suspension of Spirulina platensis powder. The optimal medium was glacial acetic acid for the isoelectric point precipitation of phycobiliprotein, which was a simple and convenient operation to obtain phycobiliprotein at pH 4.0 and 4 ℃. Glacial acetic acid is easy to volatilize so that the extraction procedure is simplified. Finally, lyophilization was performed to obtain a crude protein powder. The content of phycocyanin was as high as 4.36% in the supernatant separated from ultrasonic treated 5% aqueous suspension of Spirulina platensis powder under optimized conditions, and the yield of crude protein powder from Spirulina platensis powder was 52.5%, in which, the contents of phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin were 7.7%, 7.9% and 0.8%, respectively.

Spirulina platensis；phycobiliprotein；ultrasonic cell disruption；isoelectric point precipitation

TS201.1

A

1002-6630(2010)10-0146-05

2009-08-16

溧陽市天目湖保健品有限公司合作項(xiàng)目

朱劼(1977—)，男，講師，博士，主要從事生物醫(yī)藥開發(fā)及生物活性成分的提取研究。E-mail：zhujie_bit@yahoo.com.cn