綠原酸酵母細胞微膠囊工藝研究

盧 琪，曹少謙，呂思伊，周 熒，高 麗，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070)

綠原酸酵母細胞微膠囊工藝研究

盧 琪，曹少謙，呂思伊，周 熒，高 麗，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070)

采用釀酒酵母的細胞壁包埋水溶性的綠原酸，通過正交試驗考察包埋溫度、包埋時間、芯材比和加水量因素對綠原酸微膠囊包埋率的影響。結(jié)果表明，在包埋溫度40℃、包埋時間6h、芯材比3:1(g/g)，以6mL蒸餾水為包埋介質(zhì)的組合條件下，包埋率最大為18.9%。微膠囊紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)綠原酸的特征官能團的振動消失；熒光顯微鏡觀察顯示微膠囊呈球形，微膠囊內(nèi)的綠原酸自發(fā)明亮的熒光；高效液相色譜定性分析顯示，綠原酸包埋前后保留時間及紫外掃描圖譜相一致。研究結(jié)果表明綠原酸成功的包埋到酵母細胞壁內(nèi)，且在包埋過程中沒有發(fā)生任何化學變化。

綠原酸；細胞壁；微膠囊；正交試驗；高效液相色譜

Abstract ：Brewer's yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells subjected to a 24 h plasmolysis treatment were used to encapsulate chlorogenic acid, a water-soluble antioxidant. The optimal encapsulation for 6 h at 40 ℃ and 3:1 core material/wall material ratio(g/g) in 6 mL of distilled water as encapsulation medium determined using orthogonal array design resulted in a maximum encapsulation efficiency of 18.9%. Infrared spectral analysis indicated the disappearance of characteristic function groups of chlorogenic acid. Fluorescence microscopic studies revealed that the microcapsules were spherical in shape and that the spontaneous fluorescence of chlorogenic acid was observed on the inner side of yeast cell wall. The similar retention time and UV-Vis profiles between unmicroencapsulated and microencapsulated chlorogenic acid were found through HPLC analysis. All these results suggested that chlorogenic acid was successfully encapsulated and no significant chemical changes occurred during the encapsulation process.

Key words：chlorogenic acid；microencapsulation；cell wall；orthogonal array design；HPLC

當今，人們越來越注重通過功能性食品來預防、治療疾病[1]。綠原酸作為天然存在的酚類化合物，具有抗氧化功能，醫(yī)學上證實其具有利膽、降壓、抗菌、消炎及升高白細胞等藥理作用[2-4]。但在許多情況下，酚類物質(zhì)通常具有令人反感的味道和不穩(wěn)定的性質(zhì)。因此，如何利用食品工藝學方法處理綠原酸，既能充分發(fā)揮其療效，又能祛除異味、提高穩(wěn)定性，已成為一項具有探索性的研究課題[5-6]。

微膠囊技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。然而，這些技術(shù)主要應(yīng)用在包埋揮發(fā)性油和香料等酯溶性物質(zhì)中。包埋壁材通常選用具有兩親性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如環(huán)狀糊精和大豆蛋白，它們通過內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)包埋酯溶性的物質(zhì)，提高其穩(wěn)定性，而關(guān)于包埋水溶性物質(zhì)的報道甚少。酵母細胞呈球形或橢球形，以分散的單細胞狀態(tài)存在，大小在幾微米到20微米范圍內(nèi)，完整的酵母細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)具有一定的強度和通透性，因此是理想的微膠囊壁材[7-8]。在包埋過程中無需引入其他的化學試劑，避免了藥物殘留，并且獲得的微膠囊產(chǎn)品大小均一、無毒、生物相溶性好、易生物降解[9]。

本研究采用正交試驗優(yōu)化釀酒酵母細胞壁包埋綠原酸的工藝條件，并通過紅外光譜分析、熒光顯微鏡觀察和高效液相色譜分析來表征綠原酸微膠囊，旨在建立一種綠原酸微膠囊的制備新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與改良國家重點實驗室。

綠原酸(chlorogenic acid，CGA，純度90%) 泰安中薈植物生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2998高效液相色譜儀 美國Waters公司；Eclipse 80i熒光顯微鏡 日本Nikon公司；傅里葉變換紅外光譜美國 Nicolet公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器 常州國華電器有限公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Anke TDL-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 包埋壁材的制備

采用YPD液體培養(yǎng)基(酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，溶于1L水)，水浴振蕩培養(yǎng)酵母細胞(28℃，200r/min，36h)后，離心(4200r/min，10min)收集酵母細胞。酵母細胞經(jīng)5次水洗后，加入質(zhì)量分數(shù)為5%的氯化鈉溶液(體積為酵母細胞的4倍)，置于錐形瓶，放入搖床進行質(zhì)壁分離(54℃，150r/min，24h)。質(zhì)壁分離后的酵母細胞再次離心(4200r/min，10min)，水洗5次后，冷凍干燥。

1.3.2 綠原酸微膠囊的制備

按不同的芯材比加入CGA和酵母細胞及一定體積的蒸餾水，在100mL的燒杯中混合攪拌，加蓋后放入搖床。恒溫恒速振蕩一定時間后，CGA可通過滲透擴散作用進入酵母細胞內(nèi)部，形成微膠囊?；旌弦涸?200 r/min下離心15min后緩慢倒出上層清液，下層細胞用蒸餾水洗滌，除去未包入的綠原酸，40℃真空干燥1h。

1.3.3 包埋率的計算

微膠囊中綠原酸包埋率的計算如下:

式中：Y為綠原酸包埋率/%；mA為加入的干酵母質(zhì)量/g；mB為收集的微膠囊總質(zhì)量/g。

1.3.4 熒光顯微鏡觀察微膠囊形態(tài)[10]

綠原酸酵母微膠囊被分散在雙蒸水中形成懸濁液后，烘干固定。在同一熒光強度，同一激發(fā)波長下，觀察酵母細胞壁所產(chǎn)生的熒光和酵母膠囊包埋的綠原酸發(fā)出的熒光。利用熒光顯微鏡獲得明場視野和熒光顯微鏡圖像，數(shù)字圖像處理使用Adobe Photoshop軟件。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

將2mg的綠原酸樣品、凍干的酵母細胞和已包埋的微膠囊粉末碾磨均勻，使其分布在200mg的溴化鉀中利用壓片。壓片后放置在傅里葉變換紅外分光鏡中測定。

1.3.6 綠原酸微膠囊的釋放及成分分析

將0.1g綠原酸酵母膠囊，用50mL鹽酸(0.1mol/L)破壁萃取5次，綠原酸的定性分析由高效液相色譜儀測定。流動相的成分的體積配比為水:甲醇:冰醋酸=700:300:2；流速為0.8mL/min；樣品上液量為20μL；檢測波長：326nm。此外，酵母包埋后的綠原酸紫外吸收波段在200～400nm之間確定[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸包埋工藝的研究

通過正交試驗設(shè)計，研究了包埋時間(A)、加水量(B)、芯材比(C)和溫度(D)4個因素對酵母微膠囊制備的影響。其中芯材比是指綠原酸純品(囊心)質(zhì)量和酵母細胞壁(壁材)質(zhì)量的配比。結(jié)果如表1～3所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results of the encapsulation efficiency

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of the encapsulation efficiency with various encapsulation conditions

正交試驗方案及結(jié)果如表1～3所示。通過極差分析和方差分析結(jié)果可以看出：包埋芯材比對包埋效果影響最大，當芯材比逐漸增大時，體系中綠原酸的濃度增大，細胞外的滲透壓也隨之增大，加速了綠原酸向細胞內(nèi)擴散從而使包埋率增大。時間對包埋率的影響次之，足夠的時間能保證綠原酸充分的向細胞內(nèi)擴散。加水量間接影響了綠原酸的包埋濃度從而影響包埋率。溫度對包埋率的影響最小，隨著溫度的升高，分子運動加快，促進了綠原酸的擴散。但溫度過高可能破壞了細胞壁和細胞膜的通透性或韌性，導致綠原酸溶出，影響包埋率。結(jié)果說明，極差分析的結(jié)果可信度很高(P ＜ 0.0001)。

通過正交試驗得出各因素的最佳水平組合為A2B2C3D2，即包埋溫度40℃、包埋時間6h、芯材比3:1(g/g)，用6mL的蒸餾水溶解。對該最佳組合條件經(jīng)過3次重復驗證實驗，獲得的微膠囊包埋率平均結(jié)果是18.9%，略高于正交試驗最大值15.6% (5號試驗結(jié)果)。微膠囊中綠原酸包埋率可達18.9%，比環(huán)狀糊精包埋酯溶性物質(zhì)所得的包埋率要低，這可能是由于綠原酸粉末包埋過程中需先溶解再真空干燥成固體的原因，本實驗采用搖床振蕩使綠原酸擴散包埋的方法優(yōu)于文獻報道的加壓包埋的方法，其包埋率為12.6%[12]。

2.2 綠原酸微膠囊的熒光顯微鏡分析

圖1 普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡下的酵母細胞(A, B)和微膠囊(C, D)Fig.1 Optical microscopic observations: A. yeast cells; and C.chlorogenic acid microcapsules. Fluorescence microscopic observations: B. yeast cells; and D. chlorogenic acid microcapsules

光學顯微鏡下(圖1A)酵母細胞呈圓形，有厚厚的細胞壁包圍。光學顯微鏡下的微膠囊的形態(tài)(圖1C)，與酵母細胞的圖片并無明顯區(qū)別。由光顯微鏡下的酵母細胞圖像(圖1B)可看見細胞壁在330～380nm紫外激發(fā)波長下，帶有微弱的藍色熒光。而熒光顯微鏡下的微膠囊圖像(圖1D)中酵母細胞內(nèi)部產(chǎn)生明顯熒光，其熒光強度和色澤較圖B強。由于綠原酸除了自身結(jié)構(gòu)特征能夠自發(fā)熒光，相關(guān)研究表明綠原酸和酵母細胞中的蛋白質(zhì)或多糖之間的相互作用，包括共價鍵作用和非共價鍵作用，如氫鍵、疏水鍵、離子鍵、π鍵等，也能發(fā)出熒光，可以推斷微囊狀熒光是綠原酸包埋后發(fā)出的[13-14]。制片時雖然使微膠囊被分散在雙蒸水中形成懸濁液，但細胞附近并無相應(yīng)的熒光，這說明，酵母細胞與綠原酸之間產(chǎn)生相互作用，酵母細胞能夠有效的阻止綠原酸的釋放和容出。圖1A和圖1C是在光學顯微鏡明場條件下圖片底色為灰色或淡藍色，而圖1B和圖1D是在熒光環(huán)境下，圖片底色為黑色，有助于觀察熒光的強度和色澤。

2.3 微膠囊的紅外光譜分析

圖2 綠原酸、酵母細胞、微膠囊的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of chlorogenic acid, yeast cells and chlorogenic acid microcapsules

綠原酸、酵母細胞和微膠囊的紅外光譜圖，如圖2所示。根據(jù)CGA純品的紅外光譜分析，從特征吸收波數(shù)可知，3390cm-1為O－H的伸縮振動；在1632cm-1有一特征峰，為單核芳香烴C=C伸縮振動，1521cm-1附近出現(xiàn)C=O非伸縮振動，認為是－COO基團；波數(shù)在1389cm-1附近的吸收峰為甲基的面內(nèi)彎曲振動；在1270、1115cm-1和1062cm-1的吸收峰，可能為C－OC反對稱伸縮振動；在 819cm-1處有一吸收峰，可能是由R－CH=CH2面外彎曲振動引起的；在 607cm-1處有一特征峰可能為對稱環(huán)伸縮振動引起的，也可能有C=O面內(nèi)彎曲振動結(jié)構(gòu)[15]。而從微膠囊的紅外光譜可知，在607、819、1389cm-1處的CGA原有的特征峰消失。因此，可考慮以下可能性，如綠原酸，蛋白質(zhì)和多糖之間相互作用，微膠囊和酵母細胞之間形狀和強度的改變使得微膠囊中的綠原酸在 607、819、1389cm-1處的吸收峰消失，這些情況間接表明綠原酸被包埋到了酵母細胞中。

2.4 包埋前后綠原酸的定性分析

圖3 綠原酸純品和酵母微膠囊化的綠原酸色譜(a)和光譜(b)圖形的對比Fig.3 HPLC chromatograms (a) and UV spectra (b) of chlorogenic acid standard and chlorogenic acid microcapsules

圖3a是綠原酸純品和酵母細胞微膠囊化的綠原酸在HPLC中的色譜圖，在同一色譜條件下綠原酸純品和酵母細胞微膠囊化的綠原酸有同樣的出峰時間，而且通過PDA檢測器檢測兩者在其他波長下沒有雜峰。圖3b是綠原酸純品和酵母細胞微膠囊化的綠原酸在HPLC中的光譜圖，綠原酸純品和酵母細胞微膠囊化的綠原酸具有相同的峰形，兩者的最大吸收均在326nm，最小吸收均在264nm和肩峰均在299nm。這些都證明了兩者是相同的物質(zhì)。

圖中同樣的色譜出峰時間和相同的UV-Vis圖譜表明，在包埋過程中綠原酸沒有發(fā)生任何化學變化。

3 結(jié) 論

3.1 優(yōu)化的微膠囊制備條件：包埋溫度40℃、包埋時間6h、芯材比3:1(g/g)，用6mL的蒸餾水溶解。對最佳組合條件經(jīng)過3次重復驗證實驗，獲得的微膠囊包埋率平均結(jié)果是18.9%。

3.2 通過熒光顯微鏡分析，質(zhì)壁分離的酵母細胞呈球形，大小均一，在熒光顯微鏡下發(fā)出淡藍色的熒光。包埋后的綠原酸由于綠原酸自身結(jié)構(gòu)特征，及與酵母細胞的相互作用形成氫鍵、π鍵等，發(fā)出顏色較亮的熒光，圖中只有酵母細胞存在的地方才出現(xiàn)熒光，說明綠原酸被充分的包埋進入酵母細胞，外部無殘留。

3.3 紅外圖譜分析，包埋后的綠原酸在607、819、1389cm-1處的吸收峰消失，證明綠原酸被包埋到酵母細胞內(nèi)，外部無殘留。

3.4 通過高效液相色譜的定性分析，包埋前后綠原酸的保留時間均在6min左右(兩者差值小于2%)，并且PDA檢測器檢測兩者在其他波段沒有吸收峰出現(xiàn)，說明綠原酸在包埋前后沒有發(fā)生任何化學變化。同時，綠原酸包埋前后的紫外吸收圖譜一樣，進一步證明用酵母細胞包埋前后的綠原酸為同一物質(zhì)。

3.5 實驗過程中應(yīng)該注意到綠原酸本身的不穩(wěn)定性，包埋時不能高溫、強光及長時間加熱。此制備工藝僅能反應(yīng)在微量條件下的情況，對日后大批量的工業(yè)生產(chǎn)僅作參考。

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Microencapsulation of Chlorogenic Acid in Yeast Cells

LU Qi，CAO Shao-qian，LSi-yi，ZHOU Ying，GAO Li，PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

O625.31

A

1002-6630(2010)10-0137-05

2009-08-14

盧琪(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：chitty1986@yahoo.com.cn

*通信作者：潘思軼(1964—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品的貯藏加工。E-mail：pansiyi@mail.huau.edu.cn