玉米皮多糖制備、分離純化及相對分子質(zhì)量的測定

張艷榮，于 君，劉相陽，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

玉米皮多糖制備、分離純化及相對分子質(zhì)量的測定

張艷榮，于 君，劉相陽，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

采用微波提取及95%乙醇沉淀處理制備玉米皮粗多糖，經(jīng)D315型離子交換樹脂脫蛋白，乙醇分級沉淀及Sephadex G-100、Sephadex G-75層析柱純化得CSPA-1、CSPA-2和CSPB。紫外-可見光譜在220～400nm處掃描CSPA-1、CSPA-2及CSPB，無蛋白及核酸吸收峰。純化得到的多糖經(jīng)葡聚糖凝膠層析法測得相對分子質(zhì)量分別為186170、103885、146887。

玉米皮；多糖；分離純化；相對分子質(zhì)量

Abstract：Crude corn bran polysaccharides (CBP) were obtained through microwave-assisted extraction followed by 95%alcohol precipitation, purified through D315 ion exchange resin column chromatography for the removal of protein and fractionated into 2 fractions, CBPA and CBPB, through fractional precipitation with alcohol. CBPA was further fractionated through Sephadex G-100 column chromatography into 2 subfractions, CBPA-1 and CBPA-2 of which Sephadex G-75 column elution profile exhibited a single absorption peak. Sephadex G-75 column chromatographic analysis indicated that CBPB comprised a single homogeneous composition. Neither protein nor nuclear acid characteristic absorption peaks were shown in the UV-visible spectra of CBPA-1, CBPA-2 and CBPB. The relative molecular mass of CBPA-1, CBPA-2 and CBPB were determined by the dextran gel filtration method to be 186170, 103885 and 146887 , respectively.

Key words：corn spermoderm；polysaccharide；purification；relative molecular mass

玉米是我國的主要農(nóng)作物之一。我國的玉米消費(fèi)主要用于玉米食品、飼料、化工業(yè)、種業(yè)和出口。其中飼料和工業(yè)消費(fèi)占國內(nèi)玉米消費(fèi)總量的90%。2008年我國玉米產(chǎn)量為1.5億t，玉米深加工業(yè)發(fā)展迅速，玉米加工能力達(dá)到6000萬t。目前我國玉米的精深加工主要是玉米淀粉的生產(chǎn)及其利用，而玉米非淀粉組分如玉米皮、玉米蛋白等的高附加值利用水平很低[1]。玉米非淀粉組分的產(chǎn)出量逐年增多，如何實(shí)現(xiàn)玉米各組分的高附加值綜合利用，有效延長玉米產(chǎn)業(yè)鏈，改變以消耗大量玉米原糧為代價來換取玉米經(jīng)濟(jì)發(fā)展的單一模式，成為我國玉米深加工發(fā)展的重中之重。預(yù)計2010年吉林省玉米非淀粉組分的產(chǎn)出量可達(dá)到260萬t以上，這其中玉米皮的產(chǎn)出量可達(dá)到60萬t以上。玉米皮的主要成分為半纖維素、纖維素及木質(zhì)素，是生產(chǎn)高品質(zhì)膳食纖維的良好原料，研究表明玉米皮膳食纖維對血清膽固醇的升高有明顯的抑制作用，在大腸內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的有益菌群，促進(jìn)胃腸蠕動，加快有毒有害物質(zhì)的排除，抗便秘、預(yù)防直腸癌的發(fā)生[2]。目前，對玉米皮膳食纖維的提取方法及保健功能報道較多[3]，而對玉米皮可溶性多糖的純化方法及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究很少。本實(shí)驗(yàn)對玉米皮多糖(corn spermoderm polysaccharide，CSP)的提取、分離及純化進(jìn)行研究，并測定其相對分子質(zhì)量，為玉米皮多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮 長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

乙醇、苯酚、濃硫酸(均為分析純) 北京化工廠；Folin-酚(分析純) 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠、Sephadex G-75葡聚糖凝膠、藍(lán)色葡聚糖 瑞典Pharmacia公司；Dextran T10、T40、T70、T500 美國Sigma公司；D315離子交換樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HA121-50-02型超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；NN-J993型微波爐 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；層析柱 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BSZ-160F型自動收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；UV2300紫外-可見光分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將濕法生產(chǎn)玉米淀粉時產(chǎn)生的玉米皮在流動水下反復(fù)沖洗，除去殘存的胚芽、胚乳顆粒、淀粉及鹽類等成分，離心脫水，室溫條件下自然晾曬或低于60℃的條件下干燥至水分含量低于8%，粉碎至可全部通過0.125mm孔徑篩的玉米皮粉，采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)對其進(jìn)行脫脂脫異雜味處理[4]，條件為CO2流量22L/h、萃取壓力25MPa、萃取溫度45℃、萃取時間90min。萃取后玉米皮中脂肪含量為0.16%。

1.3.2 多糖的提取

取經(jīng)1.3.1節(jié)預(yù)處理后玉米皮100g，加入10倍體積的蒸餾水，采用微波浸提的方法提取玉米皮多糖，微波功率700W、微波處理時間6min，然后4000r/min離心處理10min，收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至原體積的10%。將濃縮液加入其3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，靜置6h以上，4000r/min離心10min，收集沉淀，冷凍干燥得可溶性玉米皮粗多糖。

1.3.3 脫蛋白

采用D315離子交換樹脂脫除多糖中蛋白質(zhì)及小分子雜質(zhì)。將處理好的樹脂裝填于3.5cm×60cm的層析柱中，填料高度為50cm。用去離子水將粗多糖溶解，配成質(zhì)量濃度為3mg/mL的多糖溶液，上樣后，用去離子水蠕動泵洗脫，流速1mL/min，至苯酚-硫酸法檢測無糖流出[5]。在收集液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置6h后，4000r/min離心10min，收集沉淀，采用Folin-酚試劑法測蛋白的脫除率[6]，按下式進(jìn)行計算。經(jīng)檢測蛋白脫除率為79.18%。

1.3.4 分級沉淀

將多糖配成質(zhì)量濃度2g/100mL的多糖液，分別用終體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%的乙醇溶液沉淀處理6h，4000r/min離心10min，離心后沉淀先后用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，收集沉淀，干燥備用[7-9]。

1.3.5 多糖的分離純化

配成質(zhì)量濃度0.4mg/mL的多糖液用Sephadex G-100及Sephadex G-75層析柱進(jìn)行分離純化，用去離子水洗脫，自動收集器分部收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，直至無糖流出為止。

1.3.6 多糖的紫外光譜分析[10]

將質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的多糖溶液在190～500nm處進(jìn)行紫外光譜掃描，檢測在260nm和280nm處是否有核酸和蛋白質(zhì)吸收，檢測多糖純化程度。

1.3.7 多糖相對分子質(zhì)量測定[11-12]

對于黏度大的多糖，可采用黏度法測相對分子質(zhì)量，此方法最大的缺點(diǎn)是只能檢測高聚物的數(shù)均相對分子質(zhì)量，而寡糖的聚合物在多數(shù)情況下是不均一的，因此采用黏度法不能精確地測定某一多糖混合物中各個組分的相對分子質(zhì)量[13]。采用葡聚糖凝膠層析法測定多糖的相對分子質(zhì)量可避免黏度法的上述缺陷。利用不同方法測定多糖相對分子質(zhì)量可以從不同角度對多糖相對分子質(zhì)量進(jìn)行確定，同時也是對多糖純度的考察。在檢測過程將Sephadex G-100層析柱(1.6cm×60cm)先用兩倍柱床體積的去離子水平衡。用已知相對分子質(zhì)量的Dextran T500、T70、T40、T10分別相繼上柱，上柱量各為5mg，去離子水洗脫流速控制在10min/管，分部收集，苯酚-硫酸法檢測多糖分布，得出不同分子量標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖各自的洗脫體積Ve，然后再用藍(lán)色葡聚糖(平均相對分子質(zhì)量為2×106)上柱，求得柱的外水體積V0，以Ve/V0為縱坐標(biāo)，lgMr為橫坐標(biāo)，做出lgMr-Ve/V0標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣條件下測定多糖樣品的洗脫體積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出每一組分多糖的相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的分級

采用乙醇分級沉淀多糖，當(dāng)乙醇終體積分?jǐn)?shù)為20%時，無多糖沉淀；乙醇終體積分?jǐn)?shù)為40%時可得多糖沉淀占總量的78.47%，此部分命名為CSPA(cornspermoderm polysaccharide A，CSPA)；乙醇終體積分?jǐn)?shù)為60%時得到多糖沉淀占總量的18.12%，此部分命名為 CSPB(corn spermoderm polysaccharide B，CSPB)；乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%時可得多糖沉淀占總量的3.4%，此部分含量較低，收集困難，因此舍去。

2.2 多糖的分離純化

Sephadex G-100凝膠柱分離純化CSPA，上樣量8mL，去離子水洗脫流速控制在40min/管，經(jīng)苯酚-硫酸顯色，可得到洗脫曲線見圖1。由圖1可以看出，經(jīng)過Sephadex G-100凝膠柱分離純化，可以較好的將CBPA分為兩個組分，第一個組分是從一開始到26管的部分，命名為CSPA-1，峰形基本上呈正態(tài)分布，證明該組分具有較好的均一性[14]。第二個組分是從第31到第61管的部分，命名為CBPA-2，峰形雖然接近正態(tài)分布，但存在起伏，因此收集CSPA-2濃縮至10mL后Sephadex G-75凝膠柱層析，去離子水洗脫流速控制在15min/管，經(jīng)苯酚-硫酸顯色，可得到洗脫曲線見圖2。從圖2可以看出，CSPA-2的Sephadex G-75洗脫曲線接近正態(tài)分布，為單一峰，證明CBPA-2為較均一的組分。將CSPB上Sephadex G-100凝膠柱分離純化，上樣量10mL，去離子水洗脫流速控制在30min/管，經(jīng)苯酚-硫酸顯色，可得到洗脫曲線見圖3。由圖3可以看出，CSPB的Sephadex G-100洗脫曲線在第21管處出現(xiàn)了一個明顯的主峰，接近正態(tài)分布，但在35管處出現(xiàn)了一個小峰，造成這種現(xiàn)象的原因可能是CSPB中含有兩種相對分子質(zhì)量相差不大的組分，它們在凝膠柱上分離效果不好。為了能夠得到相對分子質(zhì)量較為均一的多糖，只對11～35管的洗脫液進(jìn)行集中收集進(jìn)一步研究。

圖1 CSPA的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.1 Sephadex G-100 elution profile of CBPA

圖2 CSPA-2的Sephadex G-75洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-75 elution profile of CBPA-2

圖3 CSPB的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.3 Sephadex G-100 elution profile of CBPB

2.3 多糖的紫外-可見光譜分析

圖4 CSPA-1的紫外-可見光譜掃描Fig.4 UV-visible spectrogram of CBPA-1

由圖4可知，對CSPA-1、CSPA-2、CSPB進(jìn)行紫外掃描，3個多糖組分在260nm及280nm處均無核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，表明多糖組分中蛋白質(zhì)脫除效果較好，已得到純化的多糖組分。

2.4 多糖相對分子質(zhì)量測定

用藍(lán)色葡聚糖測定Sephadex G-100層析柱的外水體積V0為18.4mL，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran T500、T70、T40及T10的洗脫體積Ve分別為20.6、40.2、45.2、62.4mL，按lgMr-Ve/V0關(guān)系作圖得相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5。根據(jù)CSPA-1、CSPA-2、CSPB各自的洗脫體積分別為29.8、36.2、32.4mL，代入回歸方程y＝－0.7284x＋6.4496可得CSPA-1、CSPA-2、CSPB的相對分子質(zhì)量分別為186170、103885、146887。

圖5 多糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve for dextran with different molecular masses

3 結(jié) 論

隨著天然產(chǎn)物的功效成分成為國內(nèi)外研究重點(diǎn)，具有生物活性的植物多糖備受關(guān)注。多糖的生物活性與多糖的溶解度、黏度、相對分子質(zhì)量等密切相關(guān)，溶解度越大，黏度越小，活性越高；具有剛性結(jié)構(gòu)的大分子多糖，幾乎不溶于水，生物活性較低，只有相對分子質(zhì)量適中的多糖，才具有較強(qiáng)的生理活性[15]。不同提取方法及不同的純化過程所得到的多糖組成和相對分子質(zhì)量可能不一致，這是多糖構(gòu)效研究的一個難點(diǎn)。本研究采用乙醇分級沉淀的方法對玉米皮粗多糖進(jìn)行初步分級，通過Sephadex G-100、Sephadex G-75層析柱進(jìn)一步分離純化，得到3種多糖CSPA-1、CSPA-2、CSPB，紫外光譜掃描均無蛋白及核酸吸收峰。采用葡聚糖凝膠層析法測定3種多糖的相對分子質(zhì)量約為186170、103885、146887。證明采用95%乙醇溶液一步沉淀法獲得的玉米皮多糖是一種混合多糖，且相對分子質(zhì)量較大(均大于100000)，可推斷其生理活性及保健功能較弱[16]，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行降解及功能化處理，方可適于健康食品的生產(chǎn)。另外應(yīng)對其單糖及糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究，以利于對其構(gòu)效關(guān)系的探索。

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Isolation, Purification and Relative Molecular Mass Determination of Corn Bran Polysaccharides

ZHANG Yan-rong，YU Jun，LIU Xiang-yang，WANG Da-wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

S513

A

1002-6630(2010)10-0016-04

2010-03-02

國家“863”計劃項(xiàng)目(2007AA10Z336)

張艷榮(1965—)，女，教授，博士，主要從事糧油精深加工與開發(fā)研究。E-mail：xcpyfzx@163.com

*通信作者：王大為(1960—)，男，教授，博士，主要從事功能性食品開發(fā)研究。E-mail：xcpyfzx@163.com