大豆活性肽酶解制備的工藝條件研究

李 峰，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000)

大豆活性肽酶解制備的工藝條件研究

李 峰，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000)

以大豆分離蛋白為原料，選用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，分別從酶解pH值、酶解溫度、酶用量和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)因素研究其對(duì)單酶酶解大豆分離蛋白的影響。并通過(guò)Minitab軟件，利用響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化雙酶酶解工藝條件。結(jié)果表明，其最佳酶解條件為酶解pH7.7、堿性蛋白酶用量為110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量為90mg/g底物、酶解溫度56℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、酶解時(shí)間7h，所得的大豆活性肽的分子量主要集中在1000D以下。

大豆活性肽；堿性蛋白酶；風(fēng)味蛋白酶；水解度；制備工藝

Abstract ：To achieve an optimal degree of hydrolysis of soybean protein isolate (SPI) enzymatically hydrolyzed for the production of soybean bioactive peptides, single factor experiments were carried out to investigate 4 hydrolysis parameters(namely pH, hydrolysis temperature, enzyme dosage and substrate concentration) affecting Alcalase and Flavourzyme hydrolysis procedures of SPI and subsequently, according to experimental results, both enzymes were used for the combined hydrolysis of SPI and the optimal values of 4 hydrolysis parameters (namely pH, Alcalase dosage, Flavourzyme dosage and hydrolysis temperature) were investigated using a 4-variable, 3-level Box-Behnken design and response surface methodology. Results showed that a maximum degree of hydrolysis of SPI was achieved through the optimal double enzymatic hydrolysis for 7 h at 56 ℃ and pH 7.7 with Alcalase at a dosage of 110 mg/g substrate and Flavourzyme at a dosage of 90 mg/g substrate. Most of the soybean bioactive peptides obtained under such hydrolysis conditions exhibited a molecular weight below 1000 D.

Key words：soybean active protein；Alcalase；Flavourzyme；hydrolysis degree；production procedure

大豆活性肽是大豆分離蛋白經(jīng)酶水解后再經(jīng)過(guò)特殊處理而得到的寡肽混合物，是一類(lèi)具有生理功能的活性物質(zhì)。一般由2～9個(gè)氨基酸殘基組成，分子量分布以低于1000D的為主，主要在300～700D的范圍內(nèi)[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)攝取蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用后，吸收形式主要是肽而不是氨基酸。大豆活性肽與大豆分離蛋白相比，它的氨基酸含量與大豆分離蛋白基本相同，必需氨基酸含量豐富；理化特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更是優(yōu)于大豆分離蛋白。大豆活性肽沒(méi)有大豆腥味，口感良好；它具有抗疲勞[2]、抗氧化輻射[3-6]、降血壓血脂[7-9]、抗血栓、減肥以及調(diào)節(jié)免疫功能[10]、促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)等作用；最近還發(fā)現(xiàn)大豆活性肽具有和鈣有效結(jié)合的活性基團(tuán)，可以形成有機(jī)鈣多肽絡(luò)合物，使溶解性、吸收率和輸送速度都明顯地提高，防止骨質(zhì)疏松。隨著科技的日新月異，大豆活性肽的其他生物功能也將被人們逐漸發(fā)現(xiàn)。大豆活性肽的優(yōu)勢(shì)使得它在普通食品、保健品、醫(yī)藥日化行業(yè)以及飼料行業(yè)[11-12]中有著廣泛的應(yīng)用。為充分利用我國(guó)的大豆資源并提高它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)其進(jìn)行深加工研究顯得尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)外研究多是從實(shí)驗(yàn)室的角度采用酶水解大豆蛋白制備大豆活性肽[13]，研究出簡(jiǎn)便、易行、高產(chǎn)、低耗、高效的大豆活性肽制備方法已經(jīng)成為大豆活性肽開(kāi)發(fā)利用中一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)以大豆分離蛋白為原料，選堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為水解酶，分別以酶解pH值、酶解溫度、堿性蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶)的酶用量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以水解度為特征，分別研究?jī)煞N酶對(duì)水解大豆分離蛋白的影響；并通過(guò)Minitab軟件，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，優(yōu)化雙酶同時(shí)酶解的條件；最后利用單因素試驗(yàn)確定水解時(shí)間。最后得到的水解液通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)是否符合大豆活性肽的標(biāo)準(zhǔn)，即大豆分離蛋白水解度一般為30%～40%，大豆活性肽一般由2～9個(gè)氨基酸殘基組成，分子量分布以低于1000D為主，主要在300～700D的范圍內(nèi)。本研究可為大豆活性肽進(jìn)一步地分離提純和生理功能研究以及大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龜2200大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)含量為94%) 日本不二制油公司；堿性蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味酶(酶活力為2×105U/g) 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司。

細(xì)胞色素C(MW12500D)、桿菌酶(MW1450D)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451D)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189D)標(biāo)準(zhǔn)樣品(色譜純) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

膠體磨 溫州市七星乳占設(shè)備廠；PHS-3CT pH計(jì)上?？祪x儀器有限公司；SYC-LB搖床 上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司；TGL-16A型離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；A200-IC氨基酸分析儀 德國(guó)安米諾西斯公司；K-355、K-435凱氏定氮儀 瑞士BUCHI公司；1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 水解度(DH)

采用TCA法[13]測(cè)定。

式中：N2為大豆蛋白酶酶解上清液中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸(TCA)溶液后的可溶性氮質(zhì)量/mg(取10mL離心后的酶解液，加入10mL的10%的三氯乙酸溶液，振蕩，過(guò)濾后取上清液，用凱氏定氮法測(cè)定可溶性氮)；N1為反應(yīng)前大豆分離蛋白上清液中加10%TCA溶液后的可溶性氮質(zhì)量/mg(取10mL反應(yīng)前大豆分離蛋白溶液，加入10mL的10%的TCA溶液，振蕩，過(guò)濾后取上清液，用凱氏定氮法測(cè)定可溶性氮；N0為大豆分離蛋白中總氮質(zhì)量/mg(取等量的大豆分離蛋白，直接用凱氏定氮法測(cè)定氮)。

1.3.2 氮含量

采用凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.3 分子量范圍

采用高效液相色譜法測(cè)定。TSK-G 2000色譜柱(7.8mm×300mm)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，進(jìn)樣量5μL，柱溫30℃，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)12%乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸)。

1.3.4 溶解度

將酶解液冷凍干燥制成大豆活性肽粉末，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g粉末于50mL燒杯中，加入19mL水。在磁力攪拌器上攪拌，用0.2mol/L HCl溶液或NaOH溶液在2min內(nèi)將pH值調(diào)至預(yù)定值。待pH值穩(wěn)定后再連續(xù)攪拌25min，并控制料液比為1:20。待浸提完全后離心(3000r/min，10min)，之后取上清液測(cè)定氮含量，并換算成氮溶解指數(shù)值，繪制出NSI-pH曲線。

1.4 大豆分離蛋白的酶解工藝

準(zhǔn)確稱(chēng)量大豆分離蛋白，用緩沖液(Na2HPO4和NaH2PO4)配制成一定的濃度。經(jīng)過(guò)預(yù)處理(90℃加熱10min)后冷卻；加入一定量的酶；調(diào)pH值到預(yù)定值；在搖床里以一定的溫度和轉(zhuǎn)速反應(yīng)一定的時(shí)間后放到水浴鍋進(jìn)行沸水浴1min，使酶失活。迅速冷卻到室溫，4000r/min離心10min，測(cè)量其上清液的水解度。

1.4.1 單酶水解條件的初步確定

pH值對(duì)酶水解條件的影響：以溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量110mg/g底物、反應(yīng)時(shí)間6h的條件下，分別設(shè)定pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五個(gè)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)量其上清液的水解度。

溫度對(duì)酶解反應(yīng)條件的影響：以pH7.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量110mg/g底物、反應(yīng)時(shí)間6h，分別設(shè)定溫度為45、50、55、60、65℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)量其上清液的水解度。

酶用量對(duì)酶水解條件的影響：以溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、pH7.5、水解6h，分別設(shè)定酶用量為30、50、70、90、110mg/g底物五個(gè)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)量其上清液的水解度。

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解反應(yīng)條件的影響：以溫度55℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量110mg/g底物、pH7.5、反應(yīng)6h，分別設(shè)定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%五個(gè)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)量其上清液的水解度。

1.4.2 雙酶酶解大豆分離蛋白最佳條件的確定

響應(yīng)曲面分析最佳工藝參數(shù)：根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合以往的知識(shí)從中選出pH值、酶(堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶)用量、溫度4個(gè)因素設(shè)計(jì)四因素三水平的相應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，通過(guò)Mintab軟件進(jìn)一步優(yōu)化雙酶酶解大豆分離蛋白的酶解條件。

反應(yīng)時(shí)間的確定：以以上得到的條件為條件，分別設(shè)定反應(yīng)時(shí)間4、5、6、7、8h進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)量其上清液的水解度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響

圖1 pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of pH value on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

由圖1可知，在溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量110mg/g底物、反應(yīng)時(shí)間6h的條件下，堿性蛋白酶為pH8.0，風(fēng)味蛋白酶pH7.5，其上清液的水解度達(dá)到最大值。

2.1.2 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

圖2 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

由圖2可知，以pH7.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量110mg/g底物的條件下反應(yīng)6h，可發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶均在溫度為55℃清液中的水解度達(dá)到最大值。

2.1.3 酶用量對(duì)酶水解條件的影響

由圖3可知，在溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、pH7.5、水解6h的條件下，堿性蛋白酶用量為110mg/g底物，風(fēng)味蛋白酶用量為90mg/g底物時(shí)，其上清液的水解度達(dá)到最大值，并且從經(jīng)濟(jì)角度考慮為最好。

圖3 酶用量對(duì)酶解反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

2.1.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解反應(yīng)條件的影響

圖4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

由圖4可知，以溫度55℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量110mg/g底物、pH7.5的條件下反應(yīng)6h，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)其上清液的水解度達(dá)到最大值。在8%以上水解度變小的原因是由于大豆分離蛋白的黏度變大，酶與大豆分離蛋白的作用面積反而變小。

2.2 大豆分離蛋白最佳酶解條件的確定

2.2.1 響應(yīng)曲面分析最佳工藝參數(shù)

響應(yīng)曲面試驗(yàn)中固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，以水解度作為響應(yīng)值，利用Minitab軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)(表1)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)的因素水平Table 1 Variables and levels in Box-Behnken design

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values of degree of hydrolysis of SPI hydrolyzed with both enzymes

2.2.1.1 回歸分析

表3 各因素的方差和交互作用Table 3 Regression analysis for fitted regression model describing degree of hydrolysis of SPI as a function of various hydrolysis conditions

由表3可以看出：pH值、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)水解度有極顯著的影響，溫度影響不顯著；pH值和風(fēng)味蛋白酶有顯著的交互作用；堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶、pH值與堿性蛋白酶之間有顯著的交互作用，溫度和堿性蛋白酶、溫度和風(fēng)味蛋白酶以及溫度和pH值沒(méi)有交互作用；利用Minitap軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得水解度Y對(duì)pH值、堿性蛋白酶用量、風(fēng)味蛋白酶用量和溫度的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

2.2.1.2 顯著性分析

表4 顯著性分析Table 4 Analysis of variance for fitted regression model describing degree of hydrolysis of SPI as a function of various hydrolysis conditions

由表4可知，失擬項(xiàng)0.077＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著；線性、平方與交互作用的影響都是顯著的，因此各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

利用Minitab統(tǒng)計(jì)分析中響應(yīng)曲面中的相應(yīng)優(yōu)化器分析得到雙酶水解的最佳條件為pH7.7、溫度56℃(原數(shù)據(jù)為55.65℃)、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量90mg/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，此時(shí)水解度達(dá)到37.37%。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的確定

以pH7.7、溫度56℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量90mg/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%為條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖5可知，在7h以后其上清液的水解度變化不大，從實(shí)際生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)考慮選用7h。

圖5 時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響Fig.5 Time course of degree of hydrolysis of SPI hydrolyzed with both enzymes under optimized hydrolysis conditions

2.3 所得大豆分離蛋白酶解液的性質(zhì)

2.3.1 相對(duì)分子質(zhì)量范圍的檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)分子量的HPLC圖譜見(jiàn)圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)分子量的HPLC圖譜Fig.6 HPLC profile of 4 mixed protein markers

以pH7.7、56℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風(fēng)味蛋白酶用量90mg/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、酶解7h得到的水解液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 根據(jù)最佳條件酶解后的高效液相色譜分析結(jié)果Table 5 Molecular weight determination of 5 fractions shown in based on HPLC data

圖7 用最佳條件酶解后的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC profile of SPI hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

由圖7可知，分子量大于1112D的只占3.60%，分子量小于177D的占21.73%(這一部分大致為游離氨基酸所占的比例，所以游離氨基酸占總的氨基酸的含量小于21.73%)，其余為實(shí)驗(yàn)所需的分子量范圍，即177～1000D，其占75%左右。

2.3.2 溶解性

圖8 pH值對(duì)NSI的影響Fig.8 Effect of pH value on NSI of SPI and its hydrolysate under optimized hydrolysis conditions

由圖8可知，大豆分離蛋白在酸性狀態(tài)下溶解性降低，特別是在pH4.5(大豆蛋白的等電點(diǎn))時(shí)，蛋白質(zhì)基本上不溶解而沉淀。而大豆活性肽的功能性質(zhì)發(fā)生了明顯的改變，大豆活性肽在較寬的pH值范圍內(nèi)仍保持良好的溶解狀態(tài)，溶液保持透明。溶解性增強(qiáng)是因?yàn)槠潴w積變小，離子性增強(qiáng)，端基極性基團(tuán)增加，使溶解度增加。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用常用的堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解以及采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面進(jìn)行試驗(yàn)，得到最佳工藝條件為pH7.7、溫度56℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物，風(fēng)味蛋白酶用量90mg/g底物，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、反應(yīng)時(shí)間7h，此條件下，水解度達(dá)到37.37%。大豆分離蛋白酶解液分子量大于1112D的只占3.60%，分子量小于177D的占21.73%，其余為所需分子量范圍，占75%以上。大豆活性肽肽狀氮占氮的總量為75%，游離氨基酸占總的氨基酸的含量小于21.73%。大豆活性肽在較寬的pH值范圍內(nèi)仍保持良好的溶解狀態(tài)，而大豆分離蛋白在酸性狀態(tài)下溶解性降低，特別是在pH4.5(大豆蛋白的等電點(diǎn))時(shí)，蛋白質(zhì)基本上不溶解而沉淀。通過(guò)研究所得到的樣品基本符合大豆活性肽的要求，即大豆活性肽一般由2～9個(gè)氨基酸殘基組成，分子量分布以低于1000D為主，主要在300～700D的范圍內(nèi)。

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Enzymatic Production of Soybean Bioactive Peptides

LI Feng，PAN Yao，CHEN Qi
(Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology, College of Life Sciences, Huaibei Coal Industry Teacher’s College,Huaibei 235000, China)

TQ464.7

A

1002-6630(2010)10-0069-06

2010-02-03

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2008A086)

李峰(1970—)，男，副教授，博士，主要從事微生物生理、發(fā)酵及分子遺傳學(xué)研究。E-mail：rx2500@163.com