PCR法檢測肉鴨屠宰加工生產鏈中沙門氏菌的污染

袁 偉，唐善虎*，岑璐伽，李 雪，陳 諾，羅 薇

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

PCR法檢測肉鴨屠宰加工生產鏈中沙門氏菌的污染

袁 偉，唐善虎*，岑璐伽，李 雪，陳 諾，羅 薇

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

為建立肉鴨加工中快速、準確的沙門氏菌PCR檢測方法，并應用于肉鴨屠宰生產加工鏈沙門氏菌的實時監(jiān)測。采用Primer Premier 5.0軟件針對沙門氏菌特有的fimY基因設計合成一對引物5′- GCATTCCGCTCATTAGAT-3′和5′-TGGAGGCTGATAACAAGG-3′，并對沙門氏菌DNA擴增PCR體系的退火溫度、引物濃度、Mg2+濃度和聚合酶濃度進行優(yōu)化。結果表明：成功擴增出沙門氏菌標準株和分離株的275bp目的片段，靈敏度達到了1.2pg；應用建立的PCR方法對國內某典型肉鴨屠宰廠的肉鴨屠宰鏈環(huán)節(jié)進行沙門氏菌污染的檢測，發(fā)現(xiàn)在屠宰環(huán)境、拔毛浸燙水、浸蠟冷卻水、清洗池水、宰前毛、食道、糞便和瀝水體腔內共有25個樣品中擴增出了275bp大小的特異性片段，而空白對照無擴增條帶。

肉鴨；PCR；沙門氏菌；檢測；生產鏈

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌，是引起食物中毒的主要病原之一[1]。沙門氏菌主要以動物的肉、蛋和奶為污染對象，在動物性食品的加工、貯藏、運輸和銷售等各個環(huán)節(jié)中能夠導致產品的污染，是動物性食品行業(yè)的巨大安全隱患。如何有效開展對沙門氏菌進行檢測和監(jiān)控是一項十分有意義的工作。

現(xiàn)階段檢測沙門氏菌的方法主要有傳統(tǒng)標準檢測的方法、PCR方法和免疫學方法。免疫學方法準確、靈敏度相對較低、卻成本較高；傳統(tǒng)的沙門氏菌檢驗方法費時、操作繁瑣，難以應對食品中沙門氏菌污染的快

速診斷及食品生產加工過程中的實時監(jiān)控的需要。PCR法檢測沙門氏菌是一種快速、靈敏、準確的新方法，在食品檢測中有著十分廣泛的應用。目前，雖然已經應用于乳品、肉品等食品中沙門氏菌的檢測，并建立了相應的方法[2-3]，但是主要針對沙門氏菌的invA基因[4]、hilA基因[5]、fimA基因[6]和stn基因[7]等靶基因進行檢測。其中，利用invA基因進行檢測的方法普遍。隨著對PCR檢測技術研究的深入，用invA基因所設計的引物的靈敏度和特異性不能滿足現(xiàn)階段的檢測的要求[8]，如何篩選新的引物和建立新的PCR檢測方法顯得十分重要。另外，在豬肉和雞肉的生產加工過程中，已經報道有加工過程的沙門氏菌的檢測研究[9-11]，但是，在鴨肉的生產過程中尚未見相關研究報道。本研究的目的是為肉鴨加工業(yè)建立一個快速準確的沙門氏菌檢測方法，并應用于肉鴨屠宰生產加工鏈沙門氏菌的實時監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

樣品：肉鴨 某肉鴨加工企業(yè)。

菌株：沙門氏菌標準株C79-13、DY60沙門氏菌分離菌株、DT4沙門氏菌分離菌株、NO44志賀氏菌分離菌株由本實驗室分離保存；大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌標準株ATCC 25923 中國藥品生物制品檢定所。

引物：在NCBI數(shù)據(jù)庫[12]中搜索沙門氏菌特有的hilA基因序列及fimY基因序列，并分別對比其同源性，選取保守區(qū)域的一段核苷酸序列，分別設計了1對引物，設計引物選用primer 5(V5.0)軟件，由Invitrogen公司合成。引物序列如下：

1.1.2 試劑與儀器

10×PCR buffer(Mg2+free)、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)、MgCl2(25mmol/L)、r-Taq DNA(5 U/μL)聚合酶 大連寶生物工程公司；DNA MarkerⅠ 北京天根生化科技有限公司；GoldViewTM核酸染料、BestaTM瓊脂糖 北京賽百勝基因技術有限公司；SS固體培養(yǎng)基、SC液體培養(yǎng)基 杭州天和微生物試劑有限公司。

PCR儀、移液器、低溫離心機、核酸蛋白測定儀德國Eppendorf公司；超低溫冰箱 美國Thermo公司；水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；生物安全柜 Baker公司。

1.2 PCR方法的建立

1.2.1 沙門氏菌培養(yǎng)和樣品中沙門氏菌增菌

將－80℃凍存的沙門氏菌標準菌株取出，在無菌操作臺中操作。取5mL LB液體培養(yǎng)基加至10mL EP管中，用接種環(huán)挑取沙門氏菌菌液于LB培養(yǎng)基，置于水浴振蕩器中(37℃，200r/min)振蕩12h。將培養(yǎng)的菌液劃線接種至LB平板培養(yǎng)基，接種完后倒置平板5min，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，至平板出現(xiàn)明顯菌落后用接種環(huán)挑取單一菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基，置于水浴振蕩器(37℃，200r/min)振蕩過夜，備用。

在肉鴨屠宰線樣品增菌中，取液體樣品1mL或取固體樣品1cm×1cm×1cm加入裝有5mL LB培養(yǎng)基的離心管中，置水浴振蕩器，在37℃、220r/min培養(yǎng)24h，備用。

1.2.2 沙門氏菌基因組DNA的抽提

沙門氏菌菌液(3.4×107CFU/mL)經離心和蛋白酶消化，采用酚氯仿法進行提取[13]。

1.2.3 沙門氏菌基因組DNA質量濃度測定

取1μL DNA加69μL滅菌蒸餾水作為待測樣品，對照組取70μL滅菌蒸餾水，在紫外核酸定量儀上測定OD260和OD280的光密度，計算DNA的質量濃度。

1.2.4 PCR擴增

以沙門氏菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，將影響反應條件的Mg2+(1、1.5、2μL)、引物濃度(0.5、1、1.5、2μL)、r-Taq DNA(0.2、0.5μL)聚合酶濃度進行優(yōu)化試驗，最終得出以下最優(yōu)PCR反應體系(25μL體系)10×PCR buffer 2.5μL、Mg2+(20mmol/L)2μL、dNTP Mixture(各10mmol/L)2μL、模板DNA 1μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、r-Taq DNA聚合酶0.2μL、用滅菌去離子水補齊25μL。

對退火溫度進行梯度優(yōu)化，從引物Tm值(53±5)℃進行優(yōu)化，優(yōu)化溫度分別為47.0、48.9、50.4、52.0、53.8、56.3、57.7℃，最終得到最適合的反應溫度52.0℃。PCR擴增反應最優(yōu)條件如下：94℃預變性3min，94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、40個循環(huán)，72℃終延伸5min。

反應結束后取5μL產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 特異性檢測

分別將沙門氏菌標準菌株C79-13、沙門氏菌DT4分離菌株、沙門氏菌DY60分離菌株、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌標準菌株(ATCC 25922)、志賀氏菌NO44分離菌株為模板，進行PCR擴增，反應條件同1.2.4節(jié)，反應結束后取5μL產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 靈敏度檢測

將沙門氏菌基因組DNA以十倍稀釋法進行梯度稀釋，分別取1μL作為模板進行PCR擴增，反應條件同1.2.4節(jié)，反應結束后取5μL產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 肉鴨屠宰鏈中沙門氏菌污染的檢測

1.3.1 采樣

在某肉鴨加工企業(yè)，根據(jù)HACCP原則[14]，選取生產控制關鍵點進行隨機采樣、檢測。首先對環(huán)境進行樣品的采集，用棉簽蘸取屠宰場地面作為樣品，取3個平行樣品；然后，對宰前鴨隨機采集鴨子的毛發(fā)5個平行樣；最后，對屠宰加工流程中主要環(huán)節(jié)進行隨機取樣：①拔毛：拔毛過程中采3個浸燙用水平行樣；②浸蠟：浸蠟池的冷卻槽，采3個平行水樣；③驗毛：驗毛池內取水樣3個；④掏膛：選取掏膛過程中開膛后鴨子的食道、小腸、大腸、大腸內容物(糞便)裝入離心管，用封口膠封口，采5個平行樣品；⑤清洗：在清洗池內取3個水樣；⑥瀝水：取瀝水后的鴨子皮膚、肌肉5個平行樣。其中拔毛、浸蠟、驗毛、清洗環(huán)節(jié)樣品為液體樣品，裝入100mL塑料瓶，而掏膛、瀝水環(huán)節(jié)樣品為固體樣品，裝入10mL離心管。所有樣品用封口膠封口，備用。

1.3.2 PCR樣品制備

待測樣品的制備參照徐德順等[15]和鐘偉軍等[16]報道的方法進行。在實驗室樣品處理過程，均在無菌條件下操作，將樣品取1cm×1cm×1cm左右大小裝入10mL離心管，再加入5mL生理鹽水后勻漿成懸液，隔水煮沸20min，12000r/min離心15min后取上清液作為檢測模板；水樣則直接用作DNA提取。

1.3.3 PCR檢測

檢測方法同1.2.4節(jié)，反應結束后取5μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA質量濃度的確定

取1μL DNA加69μL滅菌蒸餾水作為待測樣品，對照組取70μL滅菌蒸餾水，在核酸蛋白測定儀上測定OD260和OD280的光密度值，OD260/OD280=1.85，測得沙門氏菌基因組DNA的質量濃度為1200μg/mL。

2.2 特異性檢測

沙門氏菌PCR特異性PCR產物(fimY引物)用2%的瓊脂糖凝膠(含1μL GoldView)，在100V電壓條件下電泳30min，結果如圖1所示。PCR電泳結果顯示，只有沙門氏菌標準菌株和分離菌株有擴增條帶，其他菌株(金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌標準菌株ATCC 25922、志賀桿菌分離株NO44)無條帶擴增，說明改進的PCR法有較高的特異性。

圖1 特異性實驗結果Fig.1 Experimental results for detection specificity

2.3 靈敏度檢測

沙門氏菌模板DNA梯度稀釋PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠，結果如圖2所示。PCR電泳結果表明，采用fimY引物擴增的最低檢測限為模板DNA稀釋至10-6，最低DNA的檢出量為1.2pg。

圖2 靈敏度測定結果Fig.2 Determination results of detection limit

2.4 樣品檢測結果

環(huán)境水樣、拔毛浸燙水樣、浸蠟冷卻水樣、驗毛池水樣、清洗池水樣、宰前毛樣、食道樣、小腸樣、瀝水肉樣和瀝水皮膚樣前增菌后PCR產物分別電泳，結果見圖3。

圖3A顯示環(huán)境水樣PCR產物電泳結果顯示增菌后1至3號樣品均為沙門氏菌陽性；圖3B PCR產物電泳結果表明增菌后拔毛浸燙水1至3號樣品均為陽性；由圖3C可以看出，增菌后浸蠟冷卻水1、2號樣品為陽性，而3號樣品為陰性；圖3D顯示增菌后驗毛池水1～3號樣品均不帶菌，為陰性結果；圖3E所示的PCR產物電泳結果顯示增菌后清洗池水1～3號樣品顯示陽性結果；

圖3F表明增菌后宰前毛1～5號樣品為陽性帶菌；圖3G結果顯示增菌后食道2號和6號樣品為陽性結果，1、3～5號樣品為陰性；圖3H結果顯示增菌后小腸4號樣品為陽性，而1～3號和5號樣品為陰性；圖3I結果表明增菌后瀝水肉3～5號樣品為陽性，而1號和2號樣品為陰性；圖3J結果顯示增菌后瀝水皮膚1～5號樣品均不帶菌，為陰性。整個屠宰鏈沙門氏菌檢出情況見表1。

圖3 各樣品PCR產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products from each sample

表1 屠宰環(huán)節(jié)樣品沙門氏菌污染情況Table1 Contamination status of duck-slaughtering chain by Salmonella typhimurium

2.5 討 論

檢測沙門氏菌的方法主要有PCR方法，該法所采用的靶基因主要有invA基因[4]、hilA基因[5]、fimA基因[6]和stn基因[7]等。本實驗選取了沙門氏菌DNA中高度保

守的fimY基因[17-18]序列設計合成特異性引物，采用PCR方法原理建立了肉鴨沙門氏菌檢測方法。

在PCR擴增中對影響擴增效果的幾個因素進行優(yōu)化處理[19]，包括引物濃度、Mg2+濃度、酶的用量和退火溫度進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，該研究中設計的引物的特異性都很高，PCR結果顯示沙門氏菌標準菌株和沙門氏菌分離菌株(DY60、DT4)均顯示出陽性結果，而金黃色葡萄球菌標準株(ATCC 25923)、志賀桿菌分離菌株(NO44)、大腸桿菌(ATCC 25922)均顯示陰性。針對fimY基因設計的引物靈敏度達到了1.2pg，優(yōu)于江樹勛等[20]建立的PCR檢測沙門氏菌的方法的檢測限。

禽類在屠宰過程中，容易受到沙門氏菌污染的環(huán)節(jié)有自身原料帶菌污染、屠宰環(huán)境不潔造成污染、屠宰器械及操作臺面消毒不徹底造成交叉污染、以及人手在操作過程中污染[21]。根據(jù)HACCP原則，本實驗樣品采集選取鴨肉屠宰生產鏈的幾個重要的環(huán)節(jié)，分別為環(huán)境、宰前鴨毛、拔毛浸燙水、浸臘冷卻水、驗毛池水、清洗池水，瀝水后皮膚、瀝水后腹腔肉這幾個容易產生污染的關鍵點收集試驗樣品[11]，檢測結果讓人十分擔心。發(fā)現(xiàn)鴨子屠宰前的鴨毛上、屠宰時拔毛使用的浸燙用水、浸蠟冷卻用水、清洗池水、以及瀝水后胴體腔內的肉樣均檢測出了沙門氏菌，說明整個生產鏈中均存在著沙門氏菌的污染。

本結果顯示所使用的活鴨就存在沙門氏菌的污染，在拔毛浸燙池水的3個樣品中全部檢出了沙門氏菌，在5個瀝水后體腔樣品中有3例檢出了沙門氏菌。這將對繼后的生產衛(wèi)生可能產生比較嚴重的問題。

由于各個屠宰場的規(guī)模不一樣，各個環(huán)節(jié)流程可能也與標準有所差別，在清洗預冷的這一道工序，標準的屠宰工藝是有預冷這一道工序的，但是在這家屠宰廠沒有見到預冷池，清洗完的肉鴨胴體瀝水后則直接入庫了。本實驗采集了清洗池內的水和瀝過水的皮膚和體腔肉作為樣品檢測，結果發(fā)現(xiàn)清洗池3個水樣都顯陽性，說明清洗池存在著沙門氏菌的污染；皮膚上沒有檢出沙門氏菌；體腔的5個肉樣3個樣品顯陽性。在肉鴨屠宰工藝流程上預冷工序的好壞直接影響產品質量[12]，屠宰完成后要將樣品迅速的降到4℃左右方能保證肉質在較高的水平上[22]。另外在預冷水中還要加入一定濃度的次氯酸鈉進行殺菌，以減少胴體上微生物的生長。該廠沒有預冷池，對產品質量的控制顯然不夠高，在檢測中發(fā)現(xiàn)了較高比例的沙門氏菌的污染，說明這一環(huán)節(jié)的控制是影響屠宰后肉質質量的重點，應引起足夠多的重視。

在屠宰生產過程中在某些需要人工操作的環(huán)節(jié)中，工人的素質直接影響到產品的質量好壞。在采樣中發(fā)現(xiàn)有個別工人沒有帶手套進行操作，在浸臘冷卻池和清洗池內洗手，這些違規(guī)的操作直接導致產品的污染，并且有可能污染整個生產線。在禽類屠宰加工工藝的摘取內臟的環(huán)節(jié)中，應注意避免劃破腸道導致胴體體腔內的污染，在采樣的過程中發(fā)現(xiàn)還是有較多的劃破腸道情況，直接造成內臟污染的情況出現(xiàn)。本實驗在消化道、腸道樣品的檢測中，5例食道樣品1例呈陽性、5例小腸樣品1例呈陽性、5例大腸樣品3例陽性、5例糞便樣品3例陽性。這可能是因為工人在摘除內臟時腸道被劃破，并且腸道并沒有分開放置，造成了各臟器的交叉污染。

3 結 論

3.1 根據(jù)Genbank已公布的fimY基因序列分別設計了一對特異性引物，通過優(yōu)化的PCR條件成功建立了檢測沙門氏菌的方法，目的擴增片段為275bp，在大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、志賀桿菌(NO44)、空腸彎曲菌的PCR反應中呈陰性，而在沙門氏菌標準株(C79-13)及2株分離株的PCR反應中呈陽性，表現(xiàn)出了較高的特異性，且檢測限達到了1.2pg，通過菌液PCR和菌落計數(shù)，得到最低能檢測到的菌落數(shù)為340CFU/mL。

3.2 通過建立的沙門氏菌PCR檢測方法檢測了肉鴨屠宰鏈不同環(huán)節(jié)的50個樣品，共檢測出25個陽性結果，陽性率為50%。

3.3 檢測結果顯示，在肉鴨屠宰過程中，存在著多處沙門氏菌的污染，屠宰環(huán)境、宰前毛、拔毛浸燙水、清洗池水、瀝水后體腔肉污染嚴重；缺少預冷工序和屠宰過程中工人違規(guī)操作會導致肉鴨屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌嚴重污染。

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Detection of Salmonella typhimurium in Duck-slaughtering Chain by PCR

YUAN Wei，TANG Shan-hu*，CEN Lu-jia，LI Xue，CHEN Nuo，LUO Wei
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

In order to establish a rapid and accurate detection method of Salmonella typhimurium contamination in duck-slaughtering chain, PCR was used to monitor duck-slaughtering chain in real time. A pair of primers 5＇-GCA TTCCGCTCATTAGAT-3＇and 5＇-TGGAGGCTGATAACAAGG-3＇ were designed to amplify fimY gene by PCR according to the published fimY gene sequence of Salmonella typhimurium. PCR reaction conditions were optimized. Results indicated that a fragment with 275 bp in length was amplified in both standard strain and isolated strain of Salmonella typhimurium. The detection limit of PCR assay was 1.2 pg. This established PCR method was used for the detection of Salmonella typhimurium in a typical duck-slaughtering chain. Totally 25 samples from plucking pool, cooling wax pool, cleaning pool, feathers, esophagus, intestine, colorectal feces, and dripping peritoneal were amplified to produce the 275 bp fragment. In contrast, no amplified fragment was achieved in the negative control. In the present study, a PCR assay was first developed for the detection of Salmonella typhimurium in duckslaughtering chain and typical duck-slaughtering chain with serious contamination of Salmonella typhimurium was observed. These results provided a practical application and useful guidance to the management of duck meat production and food safety.

duck；PCR；Salmonella typhimurium；detection；duck-slaughtering chain

R155.55

A

1002-6630(2010)22-0326-06

2010-07-04

西南民族大學資助項目

袁偉(1985—)，男，碩士，研究方向為食品衛(wèi)生與安全。E-mail：warrior101@163.com

*通信作者：唐善虎(1964—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學和食品安全。E-mail：stang01@126.com