新疆準噶爾鐵線蓮不同部位多糖提取工藝優(yōu)化

古麗巴哈爾·阿巴拜克力

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

新疆準噶爾鐵線蓮不同部位多糖提取工藝優(yōu)化

古麗巴哈爾·阿巴拜克力

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

采用分光光度法，以葡萄糖為標準樣品測定新疆準噶爾鐵線蓮不同部位中的多糖含量，采用正交試驗設(shè)計對其不同部位中多糖提取工藝進行最佳篩選、優(yōu)化。分別得到的最佳提取工藝條件為：莖：溫度90℃、浸提時間2.5h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)5次，OD值達0.408；葉：溫度90℃、浸提時間2h、料液比1:60 (g/mL)，提取次數(shù)5次，OD值達0.493；花：溫度90℃, 時間2h，料液比1:60，提取次數(shù)4次，OD值達0.418；果實：溫度90℃、浸提時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)5次，OD值達0.315。

準噶爾鐵線蓮；多糖；提取工藝；優(yōu)化

多糖的保健功能是目前保健食品功能因子中研究焦點之一。近年來，有大量有關(guān)多糖保健功能的研究報道，主要方面有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤作用、抗凝血作用，此外，多糖還具有抗衰老、解毒、抗病毒、降血糖、降血脂、抗消化性潰瘍、促進核酸與蛋白質(zhì)的生物合成，阻止放射性元素和抗輻射以及早期引產(chǎn)作用等功效。雖然到目前為止，只有少數(shù)藥用植物多糖用于臨床，但隨著多糖的制備、結(jié)構(gòu)、合成、藥理學(xué)及臨床學(xué)研究的不斷深入，多糖藥物將具有更廣闊的前景[1]。

準噶爾鐵線蓮(Clematis songarica Bge.)毛茛科鐵線蓮屬，主要產(chǎn)于新疆、內(nèi)蒙古西部，蒙古、中亞荒漠地區(qū)也有分布。生長于荒漠低山麓前洪積扇，石礫質(zhì)沖積堆以及荒漠河岸[2-3]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于準噶爾鐵線蓮有效成分的報道極少，準噶爾鐵線蓮在新疆的分布極廣，為了充分開發(fā)利用這一資源，研究一種操作方法穩(wěn)定、簡便的提取工藝，提高有效成分的提取率，本研究以準噶爾鐵線蓮多糖含量為指標，采用正交試驗設(shè)計對準噶爾鐵線蓮不同部位進行最佳提取工藝的篩選。以期為開發(fā)和利用其有效成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

準噶爾鐵線蓮采自新疆烏魯木齊縣永豐鄉(xiāng)農(nóng)田田埂等地。

碘、蒽酮、丙酮、乙醚、氯仿、濃硫酸、葡萄糖、正丁醇、5%α-萘酚水溶液、無水乙醇。

HH-S型水浴鍋；回流提取裝置；S24分光光度計；722型分光光度計；101A-1型干燥箱；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHZ-D循環(huán)水式真空泵；LAC164分析天平(感量0.0001g)。

1.2 方法

1.2.1 多糖類物質(zhì)的鑒定方法[4-5]

取樣品粉末適量，加水10倍量，室溫浸泡過夜，在60℃水谷中加熱30min，過濾，濾液分別加碘液，α-萘酚水試劑，觀察反應(yīng)結(jié)果見表1。

1.2.2 鐵線蓮不同部位多糖的測定[6-7]

1.2.2.1 標準溶液的配制及標準曲線制作

稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標準品1g，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，移取1mL該標準液于100mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，配成100 μg/mL的標準溶液。

分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL標準溶液，置于10mL容量瓶中定容，配成系列標準溶液。在波長600nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，做標準曲線，標準曲線的回歸方程為：y=0.034x+0.007，R2=0.9989，在2～20 μg/mL范圍內(nèi)對照品的量與吸光度有良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2 樣品中多糖含量測定[8]

稱取干燥恒質(zhì)量的精制準噶爾鐵線蓮不同部位的多糖30mg，置于250mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容(可以稍微加熱助溶多糖)，制得準噶爾鐵線蓮多糖貯備液。測定準噶爾鐵線蓮多糖貯備液的OD值，由回歸方程求出準噶爾鐵線蓮多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，按式(1)計算換算因子(f)。

式中：m為稱取多糖的質(zhì)量/μg；c為精制準噶爾鐵線蓮多糖貯備液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；D為多糖的稀釋因素。

吸取樣品貯備液1mL，由回歸方程計算樣品液中葡萄糖濃度(c)，按照式(2)計算樣品中多糖的含量。

式中：c1為樣品貯備液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(μg/ mL)；D為多糖的稀釋因素；f為換算因子；m為稱取多糖的質(zhì)量/μg。

1.2.2.3 穩(wěn)定性實驗[8]

取樣品貯備液1mL，測定OD值，每隔1h測定1次，連續(xù)4 h，考察生成物顏色的穩(wěn)定性。

1.2.3 鐵線蓮多糖不同部位提取的單因素試驗

1.2.3.1 提取溫度對提取效果的影響

在溫度分別為60、70、80、90、100℃時，以蒸餾水為提取溶劑，在料液比為1:30(g/mL)，時間為2h的提取條件下分別浸泡提取2次，測定其OD值。

1.2.3.2 浸泡時間對提取效果的影響

在料液比為1:30，溫度為90℃的提取條件下分別浸泡0.5、1、1.5、2、2.5h、分別提取2次，合并濾液，測定其O D值。

1.2.3.3 料液比對提取效果的影響

分別用20、30、40、50、60倍量溶劑在溫度為90℃，浸泡時間每次2h的提取條件下提取2次，測定其O D值。

1.2.3.4 提取次數(shù)對提取效果的影響

分別在溫度為90℃，料液比為1:30，每次2h的提取條件下進行1、2、3、4、5次提取，測定其OD值。1.3正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以多糖提取率為考察指標，選取提取溫度、提取時間、料液比和次數(shù)作為考察因素，各取3個水平，進行正交試驗設(shè)計，覓粗多糖的提取工藝條件并對優(yōu)化條件進行驗證實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的鑒定

顯色反應(yīng)結(jié)果見表1，說明準噶爾鐵線蓮含有多糖類化合物。

表1 顯色反應(yīng)結(jié)果Table1 Results of color reactions

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對多糖提取率的影響

圖1 溫度對準噶爾鐵線蓮多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

提取溫度對準噶爾鐵線蓮多糖提取率的影響如圖1顯示，多糖提取率隨溫度升高而升高，達到一定溫度時提取率最高，隨后溫度再升高則呈現(xiàn)下降趨勢。溫度的升高，有助于傳質(zhì)過程，使分子擴散運動加劇，加快溶質(zhì)的擴散和溶劑的滲透，有利于多糖物質(zhì)的溶出；但隨著溫度的升高，也可能會導(dǎo)致部分多糖物質(zhì)的分解而使多糖提取率下降。所以莖、葉、花、果實均選擇選擇80～100℃，作為提取操作條件。

2.2.2 提取時間對多糖提取率的影響

圖2 提取時間對準噶爾鐵線蓮多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

提取時間對準噶爾鐵線蓮多糖提取率的影響如圖2所示，多糖提取率隨時間的延長而升高，達到一定時提取率最高，隨后時間再延長則呈現(xiàn)下降趨勢。時間的延長，有助于傳質(zhì)過程，使分子充分擴散，有利于多糖物質(zhì)的溶出；但隨著時間的延長，也可能會導(dǎo)致部分多糖物質(zhì)的分解或部分其他物質(zhì)的溶解而使多糖提取率下降。所以莖、葉、花、果實均選擇選擇1.5～2.5h作為提取操作條件。

2.2.3 料液比對多糖提取率的影響

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

如圖3所示，采用不同料液比進行浸提時多糖提取率有差別，料液比實際上是溶劑的用量大小，一般溶劑的用量越大提取率也越大，但是過多的溶劑用量會造成溶劑和能源的浪費，綜合考慮，準噶爾鐵線蓮葉、莖、花、果實部選擇1:40～1:60(g/mL)料液比作為操作條件。

2.2.4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

圖4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of repeated extraction number on extraction rate of polysaccharides

如圖4所示，采用不同提取次數(shù)進行浸提時多糖提取率有差別，一般當提取次數(shù)越多提取率也越大，綜合考慮，準噶爾鐵線蓮葉、莖、花、果實部選擇3～5次作為操作條件。

2.3 正交試驗設(shè)計

準噶爾鐵線蓮葉、莖、花、果實多糖提取四因素三水平試驗設(shè)計如表2所示。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal experiments

2.3.1 準噶爾鐵線蓮莖多糖提取正交試驗

表3 準噶爾鐵線蓮莖多糖提取正交試驗結(jié)果Table3 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from stem of Clematis songarica Bge.

綜合以上單因素試驗考察結(jié)果，以提取溫度A、提取時間B、料液比C、提取次數(shù)D為因素對準噶爾鐵線蓮不同部位作正交試驗，準噶爾鐵線蓮莖正交試驗因素水平見表3。

表4 準噶爾鐵線蓮莖多糖提取方差分析表Table4 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from stem of Clematis songarica Bge.

通過比較極差，判斷得到B＞A＞C＞D，4種考察因素對多糖提取率的影響順序為提取時間＞提取溫度＞料液比＞提取次數(shù)，即提取因子中時間對提取率影響最大。提取準噶爾鐵線蓮莖中多糖的最佳條件為A2B3C3D3，即提取溫度90℃、提取時間2.5h、料液比為1:60(g/mL)；提取次數(shù)5次。這4種因子對多糖提取率的影響都不顯著。在最終選取的提取工藝條件下，進行了多糖的含量測定，OD值達0.408。

2.3.2 準噶爾鐵線蓮葉多糖提取正交試驗

表5 準噶爾鐵線蓮葉多糖提取正交試驗結(jié)果Table5 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from leaves of Clematis songarica Bge.

表6 準噶爾鐵線蓮葉多糖提取方差分析表Table6 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from leaves of Clematis songarica Bge.

根據(jù)表5和表6，通過比較極差，判斷得到A＞ D＞C＞B，4種考察因素對多糖提取率的影響順序為提取溫度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時間，即提取因子中提取溫度對提取率影響最大，提取溫度90℃最適宜。方差分析表還表明，提取準噶爾鐵線蓮葉中多糖的最佳條件為A2B2C3D3，即提取溫度90℃、提取時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)5次。這4種因子對多糖提取率的影響都不顯著。在最終選取的提取工藝條件下，進行了多糖的含量測定，OD值達0.493。

2.3.3 準噶爾鐵線蓮花多糖提取正交試驗

表7 準噶爾鐵線蓮花多糖提取正交試驗結(jié)果Table7 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from flowers of Clematis songarica Bge.

表8 準噶爾鐵線蓮花多糖提取方差分析表Table8 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from flowers of Clematis songarica Bge.

根據(jù)正交試驗表，通過比較極差，4種考察因素對多糖提取率的影響順序為提取溫度＞提取時間＞料液比＞提取次數(shù)(A＞B＞C＞D)，即提取因子中提取溫度對提取率影響最大，提取溫度90℃最適宜，提取準噶爾鐵線蓮花中多糖的最佳條件為A2B2C3D2，即提取溫度90℃、提取時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)4次。這4種因子對多糖提取率的影響都不顯著。在最終選取的提取工藝條件下，進行了多糖的含量測定，OD值達0.418。

2.3.4 準噶爾鐵線蓮果實多糖提取正交試驗

根據(jù)正交試驗表，通過比較極差，判斷得到A＞C＞D＞B，4種考察因素對多糖提取率的影響順序為提取溫度＞料液比＞提取次數(shù)＞提取時間，即提取因子

中提取溫度對提取率影響最大，提取溫度90℃最適宜。方差分析表還表明，提取準噶爾鐵線蓮果實中多糖的最佳條件為A2B2C3D3，即提取溫度90℃、提取時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)5次。這4種因子對多糖提取率的影響都不顯著。在最終選取的提取工藝條件下，進行了多糖的含量測定，OD值達0.315。

表9 準噶爾鐵線蓮果實多糖提取正交試驗結(jié)果Table9 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from fruits of Clematis songarica Bge.

表10 準噶爾鐵線蓮果實多糖提取方差分析表Table10 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from fruits of Clematis songarica Bge.

2.4 準噶爾鐵線蓮不同部位多糖含量測定

表11 準噶爾鐵線蓮不同藥用部位多糖含量測定結(jié)果Table11 Content of polysaccharides extracted from different parts of Clematis songarica Bge.

在最佳工藝條件下進行提取，結(jié)果表明：準噶爾鐵線蓮不同部位中葉部多糖含量最高，花部含量較高，莖含量其次，其中果實部含量最低。

2.5 穩(wěn)定性實驗

考察最佳提取工藝條件下，所提取的鐵線蓮各部位的多糖溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果如表12所示，4h內(nèi)準噶爾鐵線蓮莖、葉、花、果實多糖溶液的O D值穩(wěn)定。

表12 多糖測定的穩(wěn)定性結(jié)果Table12 Stability of polysaccharides

3 結(jié) 論

3.1 經(jīng)兩種多糖試劑鑒定，均呈明顯的多糖反應(yīng)，現(xiàn)象分別為紫色與深藍黑色，證實有多糖成分存在。

3.2 本實驗用熱水提取法對準噶爾鐵線蓮不同部位進行了多糖提取，采用分光光度法測定總多糖含量，正交試驗結(jié)果表明，準噶爾鐵線蓮不同部位中葉部多糖含量最高，花部含量較高，莖部含量其次，果實含量最低。

3.3 本實驗采用正交試驗設(shè)計對準噶爾線蓮不同部位中總多糖提取工藝進行了最佳篩選，4種因素對不同部位總多糖含量測定均有影響，分別得到的最佳提取工藝條件為：莖：提取時間2.5h、料液比1:60(g/mL)、提取溫度90℃、提取次數(shù)為5次，OD值為0.408；葉：提取溫度90℃、提取時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)為5次，OD值為0.493；花：提取溫度90℃、提取時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)為4次，OD值為0.418；果實：提取溫度90℃、提取時間2h、料液比1:60(g/mL)、提取次數(shù)為5次，OD值為0.315。3.4本實驗采用分光光度法測定總多糖含量，結(jié)果表明4h內(nèi)樣品的吸光度穩(wěn)定，本法可作為測定準噶爾鐵線蓮中的總多糖含量的方法。

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Optimal Extraction of Polysaccharides from Different Parts of Clematis songarica Bge. in Xinjiang

GULIBAHAER Ababaikeli
(College of Life Science, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)

Polysaccharides were extracted from different parts of Clematis songarica Bge. and determined by using spectrophotometry method with glucose as the standard. The optimal extraction parameters of polysaccharides were explored by orthogonal experiments to be extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time of 2.5 h and repeated extraction number of 5 for stem; extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time of 2 h and repeated extraction number of 5 for leaves; extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time of 2 h and repeated extraction number of 5 for flowers; extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time 2 h and repeated extraction number of 5 for fruits. The absorbance of polysaccharides extracted from stem, leaves, flowers and fruits at 600 nm were 0.408, 0.493, 0.418 and 0.315, respectively.

Clematis songarica Bge.；polysaccharides；extraction processing；optimization

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0198-05

2010-08-18

古麗巴哈爾·阿巴拜克力(1969—)，女，副教授，碩士，研究方向為植物有效成分分析。E-mail：gvlbahar.a@163.com