響應(yīng)面法優(yōu)化堿法提取林蛙卵團(tuán)中粗多糖的工藝研究

劉曉丹，鄭明珠，劉景圣*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

響應(yīng)面法優(yōu)化堿法提取林蛙卵團(tuán)中粗多糖的工藝研究

劉曉丹，鄭明珠，劉景圣*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

以林蛙卵團(tuán)膠狀物為原料，采用堿法對粗多糖進(jìn)行提取，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對NaOH溶液濃度、料液比、提取溫度及提取時間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，堿法提取林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖的最佳工藝條件為NaOH溶液濃度1.2mol/L、料液比1:8(g/mL)、浸提溫度56℃、浸提時間73min。在此條件下林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量可達(dá)24.01mg/g。

林蛙；卵團(tuán)膠狀物；多糖；響應(yīng)面

中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)，又稱哈什蟆，屬兩棲綱無尾目蛙科蛙屬，為國家二級保護(hù)動物，主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、吉林3省，尤以吉林省居多，是一種珍貴的兩棲類藥用經(jīng)濟(jì)動物[1-2]。蛙類的卵子在通過輸卵管后，被輸卵管內(nèi)分泌的物質(zhì)逐層包裹，排出體外后，包裹卵子的物質(zhì)呈膠狀，無色透明，俗稱卵團(tuán)。這層卵透明帶是一種包圍在卵母細(xì)胞上的一種糖蛋白基質(zhì)，由于其有著很強(qiáng)的異種抗原性，因此它可以引起抗生育效應(yīng)[3-4]。

卵子的包裹物質(zhì)，即卵團(tuán)膠狀物質(zhì)，成分復(fù)雜，不能完全確定其中的成分，但是從目前的研究可知：輸卵管直部分泌的物質(zhì)有利于精子透過而與卵子結(jié)合，卷曲部分泌的物質(zhì)多為含糖基的蛋白質(zhì)及多糖類物質(zhì)，為受精卵的發(fā)育提供必要的營養(yǎng)[5-10]。

多糖及其糖復(fù)合物不僅在生物體內(nèi)具有重要的生物功能和較好的生物活性，而且在生命科學(xué)及醫(yī)藥領(lǐng)域上還具有巨大的應(yīng)用價值。目前研究可知多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低血糖、血脂，抗腫瘤，延緩衰老等作用[11-15]。本實驗主要對林蛙卵團(tuán)膠狀物進(jìn)行初步研究，對影響林蛙卵團(tuán)膠狀物中粗多糖提取的幾個因素進(jìn)行實驗分析，確定其最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

林蛙卵團(tuán)：通化市柳河縣。

苯酚、無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、冰醋酸、氫氧化鈉(均為國產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY220 EXP分析天平 北京賽多利斯有限公司；XMTD數(shù)顯水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LG10-2.4A高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 林蛙卵團(tuán)膠狀物多糖的提取

精確稱取卵團(tuán)膠狀物5g，按一定料液比加入NaOH溶液，水浴提取后，調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入95%乙醇4℃過夜保存，離心，30℃烘干，即為林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖。

1.3.2 單因素試驗

對粗多糖提取影響較大的NaOH濃度、料液比、提取溫度及提取時間4個因素進(jìn)行單因素試驗，分別討論其對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗設(shè)計原理，以粗多糖含量Y為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗，對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表Table1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。粗多糖含量計算式：

粗多糖含量/%=林蛙卵團(tuán)膠狀物提取液中粗多糖質(zhì)量/新鮮卵團(tuán)膠狀物質(zhì)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測定多糖含量[16]標(biāo)準(zhǔn)曲線

測得多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.0083X－0.0111，R2=0.9996。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 NaOH溶液濃度對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按料液比1:8(g/mL)分別加入濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mol/L的NaOH溶液，55℃提取30min。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入NaOH溶液4倍體積(此處為160mL)的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量。結(jié)果如圖1所示。

圖1 NaOH濃度對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

2.2.2 料液比對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按NaOH濃度0.9mol/L，分別以料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16 (g/mL)在55℃提取30min。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入NaOH溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量。結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

從圖2可以看出，粗多糖含量在料液比1:4～1:8 (g/mL)的范圍內(nèi)有顯著增加，而當(dāng)料液比在1:8后就顯著下降，1:14～1:16(g/mL)極速下降。提取液的體積越大，溶劑與卵團(tuán)膠狀物的接觸就越充分，在相同的時間內(nèi)所得的粗多糖也就越多，當(dāng)料液比達(dá)到1:10(g/mL)后溶出的粗多糖物質(zhì)趨于飽和呈現(xiàn)下降趨勢。由于堿溶液的添

加量不斷增加直至達(dá)到過飽和狀態(tài)，因此粗多糖的含量并不是隨提取液體積增大而無限增加，相反，當(dāng)達(dá)到一定極限值后反而會呈下降趨勢。

2.2.3 浸提溫度對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按NaOH濃度為0.9mol/L，料液比為1:8(g/mL)，溫度分別為15、25、35、45、55、65、75℃提取30min。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入氫氧化鈉溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 浸提溫度對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

由圖3可以看出，溫度在15～35℃范圍內(nèi)，粗多糖含量顯著提高，溫度在35～55℃范圍內(nèi)，粗多糖含量稍有降低，到65℃開始顯著下降。溫度的升高加快了卵團(tuán)膠狀物的降解速度，在一定程度上有利于粗多糖的提取，但是溫度的升高也會引起蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生副反應(yīng)，因此，當(dāng)溫度在65℃以后，提取液顏色明顯變黃，并且散發(fā)很腥的難聞氣味，因此需要對溫度行嚴(yán)格控制。

2.立足于崗位，來合理安排。學(xué)校的工作面對的對象是學(xué)生這一有生命、有思維的群體，這也就表明了教師工作的特殊性。真正的人才，應(yīng)該是在屬于自己的崗位上能夠做出一定的業(yè)績或突出貢獻(xiàn)的人。對于學(xué)習(xí)來說，崗位工作有教學(xué)崗位、管理崗位、后勤服務(wù)崗位等。所以，在學(xué)校人力資源管理工作中，必須要立足于教師的特點(diǎn)，結(jié)合學(xué)校的崗位需求，來對工作進(jìn)行細(xì)致分工，充分尊重教師的工作能力和自身素質(zhì)，給其一定的自我發(fā)展空間，這樣才能夠調(diào)動教師工作的積極性，優(yōu)化工作效果，促進(jìn)學(xué)校整體工作的有序推進(jìn)。

2.2.4 浸提時間對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按NaOH濃度為0.9mol/L，添加比為1:8(g/mL)，時間分別為15、30、45、60、75、90、105min，在55℃提取。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入氫氧化鈉溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過夜，離心，干燥，測定粗多糖含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提時間對林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

由圖4可以看出，浸提時間在15～45min范圍內(nèi)，粗多糖含量顯著提高，時間在45～75min范圍內(nèi)，粗多糖含量趨于最高，到75min開始顯著下降。隨著浸提時間的提高，使卵團(tuán)膠狀物有了更充分溶出的可能，從而在一定程度上提高了粗多糖的含量，但并不是隨著時間延長，粗多糖含量也呈正比的相應(yīng)增高，而是達(dá)到一定極限值反而會下降。當(dāng)時間達(dá)到75min后，提取液顏色明顯變黃，偏橘色并伴隨強(qiáng)烈的異味。

2.3 響應(yīng)面分析試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到林蛙卵團(tuán)膠狀物多糖含量Y對X1、X2、X3、X4的回歸方程為：

表2 Box-Beknhen試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Design and results of Box-Beknhen experiments

表3 響應(yīng)面試驗方差分析Table3 Variance analysis of response surface experiments

從表3可以看出，方程一次項中X4極顯著，X1、X3顯著，X2不顯著，方程二次項均為極顯著，X2與X3、X3和X4交互作用極顯著，X1與X3交互作用顯著，其余交互項均不顯著，表明試驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。還可以看出影響林蛙卵團(tuán)膠狀物中多糖得率的因素按影響的大小排序依次為浸提時間X4、浸提溫度X3、NaOH溶液的濃度X1、料液比X2，其中浸提時間對多糖得率的影響達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)。

表4 模型可信度分析Table4 Reliability analysis for the model

表4模型可信度分析表明，多元回歸關(guān)系顯著，R2和R2Adj分別達(dá)到96.08%、91.50%，說明方程擬合充分，回歸方程顯著，可用上述回歸方程描述個因子與響應(yīng)值的關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)面的圖形是響應(yīng)值對各試驗因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，圖5為運(yùn)用SAS軟件分析得到的響應(yīng)面圖和等高線圖，可以直接反應(yīng)各因素對響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，從響應(yīng)面的最高的和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值。將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖5所示。

如圖5a所示，在X1與X3交互作用等高線中，等高線密度沿X3軸方向略大于X1軸方向，說明X1和X3的交互作用中，X3對響應(yīng)值峰值的影響大于X1、X3的變化可引起響應(yīng)值較大幅度的變化。此外，等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，X1與X3、X4兩項的等高線呈圓形，可以知道它們間的相互作用對多糖提取率的影響很小，等高線扁平，證明因素間的相互影響較大。如圖5c所示，X3與X4交互作用等高線中，沿X3軸向等高線變化密集，而X4軸向等高線變化相對稀疏，說明X3對響應(yīng)值峰值的影響比X4大，X3、X4兩因素的影響就很明顯。

圖5 響應(yīng)面三維圖和對應(yīng)的等高線Fig.5 Response surface and contour plots of response surface experiments

為求出最佳點(diǎn)的編碼值，對回歸方程取一階偏導(dǎo)，并解得：X1=0.1404、X2=0.3089、X3=1.1344、X4=0.9129，真實值為NaOH溶液濃度(X1)1.24mol/L、料液比(X2)1:7.5 (g/mL)、浸提溫度(X3)56.34℃、浸提時間(X4)73.7min，林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量理論值可達(dá)24.07mg/g，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)設(shè)定為NaOH溶液濃度(X1)1.2mol/L、料液比(X2)1:8(g/mL)、浸提溫度(X3) 56℃、浸提時間(X4)73min，經(jīng)3次平行實驗，林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量平均值為24.01mg/g，可見，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量。

3 結(jié) 論

使用堿液對林蛙卵團(tuán)膠狀物中粗多糖的提取，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，依據(jù)回歸分析確定各因素對粗多糖含量的影響，經(jīng)過優(yōu)化后確定最佳工藝參數(shù)為NaOH溶液濃度(X1)1.2mol/L、料液比(X2)1:8(g/mL)、浸提溫度(X3)56℃、浸提時間(X4)73min，林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量平均值為24.01mg/g。

[1]李冬梅. 淺談中國林蛙長白山亞種及其相關(guān)產(chǎn)品[J]. 長春大學(xué)學(xué)報, 2006, 16(5): 74-76.

[2]李東風(fēng). 中國林蛙研究進(jìn)展[J]. 遼寧師范大學(xué)學(xué)報, 2005, 28(1): 92-94.

[3]羅榮生, 趙劍興. 中華大蟾蜍輸卵管促受精因子的實驗分析[J]. 動物學(xué)報, 1995, 41(4): 404-406.

[4]陳章寶, 楊繼虞. 鯉魚卵透明帶糖蛋白分離純化研究[J]. 四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2001, 15(2): 17-22.

[5]BONNELL B S, REINHART D, CHANDLER D E. Xenopus laevis egg jelly coats consist of small diffusible proteins bound to a complex system of structurally stable networks composed of high-molecular-weight glycoconjugates[J]. Developmental Biology, 1996, 174(1): 32-42.

[6]仲娜, 郝林華, 王小如. 糖蛋白藥物研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志, 2005 (12): 1400-1403.

[7]HEDRICK J L, KATAGIRI C. Bufo japonicus and Xenopus laevis laevis egg jellies contain structurally related antigens and cortical granule lectin ligands[J]. J Exp Zool, 1988, 245(1): 78-85.

[8]陳筠, 孟運(yùn)蓮. 輸卵管特殊蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其對女性生殖的影響[J].國外醫(yī)學(xué): 計劃生育分冊, 2005, 24(5): 222-225.

[9]KATAGIRI C. Role of oviducal secretion in mediating gamete fusion in anuran amphibians[J]. Zool Sci, 1987, 4: 1-14.

[10]周柔麗. 哺乳動物凝集素及其生物學(xué)作用[J]. 生命的化學(xué), 1995(1): 12-15.

[11]劉俊, 張燕平, 戴志遠(yuǎn), 等. 三角帆蚌多糖的提取及其抗氧化功能研究[J]. 食品科技, 2008, 33(12): 40-44.

[12]李英華, 韓冠英, 郭斌, 等. 鯊魚軟骨多糖對血脂的影響[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2006, 33(6): 760-761.

[13]欒潔, 沈先榮, 蔣定文, 等. 鯊魚軟骨粘多糖對雄性小鼠免疫及生殖器官的輻射防護(hù)作用[J]. 中國輻射衛(wèi)生, 2008, 17(2): 145-147.

[14]殷紅玲, 馬媛, 王璐, 等. 蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖的提取及清除羥基自由基作用的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007, 26(5): 255-258.

[15]孫龍, 馮影. 蠶蛹多糖的堿液提取及免疫活性初步研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2007, 20(6): 782-786.

[16]鄭必勝, 唐芳勇, 閆文娟, 等. 苯酚-硫酸法測定廣東蟲草菌絲體多糖含量的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2008, 8(8): 17-21.

Optimization of Alkaline Extraction Conditions for Crude Polysaccharides from Rana Egg Jelly by Response Surface Methodology

LIU Xiao-dan，ZHENG Ming-zhu，LIU Jing-sheng*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Rana egg jelly was used as the raw material to extract polysaccharides by an alkaline extraction method. Based on single factor experiments, NaOH concentration, material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time during extraction process were optimized by response surface methodology. Results exhibited the best extraction conditions were NaOH concentration of 1.2 mol/L, material-liquid ratio of 1: 8, extraction temperature of 56 ℃ and extraction time of 73 min. The extraction rate of crude polysaccharides can reach up to 24.01 mg/g.

Rana；egg jelly；polysaccharides；response surface methodology

Q538

A

1002-6630(2010)22-0096-05

2010-05-24

國家自然科學(xué)基金項目(30671536)

劉曉丹(1982—)，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品生物化學(xué)工程與功能性食品研究。E-mail：lxd820928@126.com

*通信作者：劉景圣(1964—)，男，教授，博士，主要從事食品資源深加工與綜合利用研究。E-mail：liujs1007@vip.sina.com