薏苡仁多糖的提取及分離純化

肖小年，曾海龍，易 醒，熊 華,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.江西中德食品工程中心，江西 南昌 330047)

薏苡仁多糖的提取及分離純化

肖小年1，曾海龍1，易 醒2，熊 華1,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.江西中德食品工程中心，江西 南昌 330047)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取料液比、提取溫度和提取時間3項為考察因素，通過正交試驗L9(33)優(yōu)化薏苡仁多糖提取的最佳工藝條件；對薏苡仁多糖進(jìn)行分離純化，考察薏苡仁多糖的SephadexG-75凝膠柱層析特性以及純度鑒定。結(jié)果表明：料液比1:15(g/mL)、提取溫度100℃、提取時間150min為最佳提取條件，在最佳條件下薏苡仁多糖得率為5.53%；紫外掃描結(jié)果顯示薏苡仁多糖中不含核酸和蛋白質(zhì)。

薏苡仁多糖；正交試驗；提取；分離純化

薏苡仁(Semen Coicis)，英文名Coix Seed，為禾本科植物薏苡(Coix Lacryma-jobi L.var.ma-yuen(Roman.) Stapf的干燥成熟種仁，又名薏米、苡仁，俗稱“藥王米”、“回回米”、“六谷米”等[1]。《本草綱目》中提及薏苡仁“健脾益胃、補肺清熱、祛風(fēng)勝溫、強筋骨”[2]。薏苡在我國大部分地區(qū)均有種植，主要產(chǎn)于福建、河北、遼寧等地。國內(nèi)對薏苡仁的開發(fā)利用極為重視，我國主要對薏苡仁酯做了大量研究工作[3-6]，并且已經(jīng)被康萊特公司研制成抗腫瘤的注射液[7]等產(chǎn)品，在臨床上以得到廣泛應(yīng)用，提取薏苡仁油以后的殘渣常棄之不用或用作飼料。薏苡仁中含有較多的多糖，目前對薏苡仁多糖提取分離純化研究較少且多糖的得率不高[8-9]。其多糖已被證實具有降血糖[10]、提高免疫力[11]等作用。本實驗以提油后的薏苡仁渣為原料進(jìn)行多糖的提取和分離純化的初步研究，一方面旨在提高薏苡仁的綜合利用，另一方面為薏苡仁多糖的進(jìn)一步研究開發(fā)提供更多的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏苡仁(產(chǎn)地：浙江) 南昌匯仁集團有限公司。

石油醚(60～90℃)、丙酮、乙醚、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、氯仿、正丁醇、30%雙氧水、N a O H、濃H C l、淀粉酶、糖化酶、D E A E-5 2、

SephadexG-75等(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

B-260恒溫水浴鍋 上海亞龍生化儀器廠；電子天平 上海良平儀器儀表有限公司； KQ5200超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞龍生化儀器廠；GZX-DH-40X-45S電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；T6新世紀(jì)紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JB-3磁力攪拌器上海電磁新涇儀器有限公司。

1.3 薏苡仁多糖提取工藝的優(yōu)化

1.3.1 薏苡仁多糖提取工藝流程

薏苡仁→篩選→粉碎→脫脂→熱水提取→離心→上清液→濃縮→醇沉→干燥→薏苡仁粗多糖

1.3.2 提取方法

挑選籽粒飽滿、色澤潔白、無蟲蛀、無霉斑的薏苡仁充分干燥后置于超微粉碎機中，粉碎過篩。每份稱取5g，用石油醚脫脂后，置于三角瓶中，加蒸餾水調(diào)節(jié)pH5.2，于100℃水浴鍋中提取。按20IU/g加淀粉酶到提取液中，直到碘檢不變色；接著按18IU/g加糖化酶，水浴溫度50～60℃，pH6.5處理1h，以去除淀粉。100℃水浴條件下滅酶10min，然后在3000r/min下離心1 0 m i n，上清液經(jīng)減壓濃縮，加入4倍濃縮液體積的9 5%乙醇醇沉過夜，干燥沉淀得薏苡仁粗多糖。

1.3.3 薏苡仁多糖含量的測定(改進(jìn)的苯酚-硫酸法[12])

1.3.3.15 %苯酚溶液的配制

取苯酚100g，加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g，常壓蒸餾，收集182℃餾分。稱取該餾分5g，置100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻后，置棕色試劑瓶中，冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取80℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖10mg于100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻即為質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密量取葡萄糖對照品溶液(0.1mg/mL)0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL分別置于干燥試管中，各加水至1.00mL，再分別加苯酚試劑0.50mL，搖勻，在冷水浴中迅速滴加硫酸2.50mL，即刻搖勻后放置10min，然后放置沸水浴加熱10min，迅速冷卻到室溫。以1.0mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，于488nm波長處測定A值，以橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量、縱坐標(biāo)為吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 換算因子測定[13]

精確稱取60℃干燥至質(zhì)量恒定的實驗室精制薏苡仁多糖10mg，水溶解后定容到100mL容量瓶中，搖勻，作為多糖儲備液。精確量取多糖儲備液1mL，定容至l0mL，取0.5mL加水至1mL，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測其吸光度。按下式計算換算因子：

式中：m為多糖質(zhì)量/mg；C為多糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；D為多糖的稀釋因子。

1.3.3.4 薏苡仁多糖得率的計算

提取液按上述操作顯色，測得吸光度，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得多糖質(zhì)量，并換算多糖得率。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

在全面考察提取溫度、時間、pH值、提取次數(shù)、料液比、原料粉碎度的基礎(chǔ)上，選擇提取時間、提取溫度、料液比3項為考察因素，各取3個水平，正交因素水平表(表1)，進(jìn)行L9(33)正交試驗設(shè)計[14-16]。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels in orthogonal array design

1.4 薏苡仁多糖的分離純化

1.4.1 純化工藝流程

薏苡仁粗多糖→脫脂→Sevag法脫蛋白→H2O2脫色→透析→DEAE-52柱層析→SephadexG-75凝膠柱層析→精制薏苡仁多糖

1.4.2 脫脂

精確稱取粗多糖5g，溶于30mL蒸餾水中配成粗多糖溶液，在粗多糖液中加入(4倍體積)120mL的無水石油醚，振蕩后，靜置1 h，溶液分為上下兩層，除去上層石油醚層，下層水溶液按上述步驟重復(fù)3次，最后得到脫脂的薏苡仁多糖液。

1.4.3 Sevag法脫蛋白[17]

在粗多糖液中加入1/5體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)，劇烈振蕩30min，3000r/min離心20min取上清液，除去水與有機相間的變性蛋白層，上清液再按上述步驟重復(fù)處理5次，至氯仿與水層之間無白色膠狀物

產(chǎn)生。最后得到脫蛋白的薏苡仁多糖液，減壓濃縮至一定體積，加入4倍體積95%乙醇醇沉，靜置澄清后傾去上清液，然后再加少量蒸餾水溶解，再醇沉，如此重復(fù)3次，以除去Sevag試劑。

1.4.4 脫色[18]

脫蛋白后的薏苡仁多糖水溶液以濃氨水(或NaOH溶液)調(diào)至pH8.0，滴加30% H2O2至淺黃色，于50℃水浴保溫2 h。

1.4.5 透析

用截留相對分子質(zhì)量為7000～14000的透析袋，流水透析2d，再以蒸餾水透析1d。單糖、雙糖及無機鹽等小分子物質(zhì)可以透出膜外，而所要的薏苡仁多糖被截留在膜內(nèi)，從而達(dá)到對多糖純化的目的。將多糖溶液濃縮，并定容至25mL備用。

1.4.6 DEAE-52纖維素離子交換柱層析工藝流程[19]

DEAE-52纖維素粉→充分溶漲→漂洗3次→1mol/L NaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→1mol/L HCl溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→1mol/L NaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→裝柱→平衡→加樣1mL→以蒸餾水洗脫(5mL/管，收集30管)→苯酚-硫酸法檢測得洗脫曲線

1.4.7 SephadexG-75凝膠柱層析工藝流程[19-20]

SephadexG-75粉→充分溶漲→漂洗3次→1mol/L NaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→裝柱→平衡→加樣1mL→分別以蒸餾水、0.1mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液為洗脫液洗脫(5mL/管，收集30管)→苯酚-硫酸法檢測，得到三條洗脫曲線→分別合并高峰部分備用

1.5 紫外分光光度法鑒定純度[21]

分別取5mL上述純化后的薏苡仁多糖溶液，于200～400nm區(qū)間進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察在260、280nm處是否有吸收。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)實驗得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 0.0177X－0.0151(相關(guān)系數(shù)R2=0.9993)。回歸分析表明，在10～50μg/mL范圍內(nèi)葡萄糖的質(zhì)量與吸光度呈良好線性關(guān)系。將薏苡仁粗多糖樣品溶解到水中，稀釋至合適濃度，按此方法測定多糖含量。實驗測得換算因子f=0.1236。

2.2 正交試驗

如表2所示，試驗中各影響因素的主次順序如下：B(提取溫度)＞C(料液比)＞A(提取時間)。正交試驗所得最佳工藝為A3B3C1，按此工藝提取薏苡仁多糖，多糖得率為5.53%(n=3)。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Orthogonal array design layout and experimental results

2.3 薏苡仁多糖的分離純化

2.3.1 DEAE-52柱層析分離

圖1 薏苡仁多糖蒸餾水洗脫曲線Fig.1 DEAE-52 column separation of polysaccharides from adlay seeds eluted with distilled water

以蒸餾水為洗脫液，得薏苡仁多糖的DEAE-52柱層析洗脫曲線，如圖1所示，只有一個單一的主峰。經(jīng)DEAE-52柱層析，既可以進(jìn)一步除去色素，又能除去其他雜質(zhì)，干燥得到的薏苡仁多糖為白色固體。

2.3.2 SephadexG-75凝膠柱層析分離

圖2 薏苡仁多糖的不同洗脫劑洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-75 column separation of polysaccharides from adlay seeds eluted with different solvents

薏苡仁多糖的SephadexG-75凝膠柱層析特性的考察，分別以蒸餾水、0.1mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液為洗脫液洗脫(5mL/管，收集30管)，苯酚-硫酸法檢測，得到以上3條洗脫曲線，結(jié)果如圖2所示。3個峰形圖大致相同，以0.1mol/L NaCl溶液作為洗脫液的洗脫效果最佳。該洗脫曲線型特征為薏苡仁多糖研究提供了初步質(zhì)量指標(biāo)之一。

2.4 紫外光譜檢測

圖3 不同洗脫劑洗脫薏苡仁多糖的紫外光譜掃描圖Fig.3 UV scanning spectra of polysaccharides from adlay seeds eluted on Sephadex G-75 column with different solvents

由不同洗脫液得到的薏苡仁多糖的紫外光譜掃描結(jié)果(圖3)可以看出，在260nm和280nm處均無吸收峰，證明純化后的薏苡仁多糖中不含核酸和蛋白質(zhì)。

3 結(jié) 論

3.1 薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果表明，其最佳工藝條件為料液比1:15、提取溫度100℃、提取時間150min。提取溫度是影響多糖得率的最主要因素，薏苡仁多糖主要存在于胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁中，在一定的溫度范圍內(nèi)，較高的提取溫度利于胚乳細(xì)胞壁破碎而使多糖溶出。隨著溫度的提高，多糖得率也逐漸增加，溫度100℃時多糖得率最高。料液比影響次之，提取時間在3個因素中對多糖得率影響最小，故在工業(yè)化生產(chǎn)中，考慮成本及工序問題，可適當(dāng)縮短提取時間。在最佳條件下多糖得率為5.53%，與以往的報道相比條件適宜且多糖的得率有所提高[8-9]。

3.2 經(jīng)粉碎之后的薏苡仁粉在高溫蒸煮下易糊化黏稠，給提取液的分離帶來不便，因此本研究在提取過程中加入了淀粉酶和糖化酶，以去除淀粉、降低黏度，使提取液澄清，易于分離。

3.3 SephadexG-75凝膠柱層析結(jié)果表明，以0.1mol/L NaCl溶液作為洗脫液的洗脫效果最佳，該洗脫曲線型特征為薏苡仁多糖研究提供了初步質(zhì)量指標(biāo)之一。

3.4 紫外光譜掃描結(jié)果表明，純化后的薏苡仁多糖中不含核酸和蛋白質(zhì)。

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Isolation and Purification of Polysaccharides from Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf

XIAO Xiao-nian1，ZENG Hai-long1，YI Xing2，XIONG Hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Sino-German Food Engineering Center, Nanchang 330047, China)

In order to maximize the extraction yield of polysaccharides from the seeds of adlay (Coix lachryma-jobi L. var. mayuen Stapf), an orthogonal array design L9(33) was applied to optimize the extraction conditions including raw material/ water as well as extraction temperature and duration, of which the effects on polysaccharide extraction yield were initially dealt with by single factor method. Finally, the extracted polysaccharides were purified on Sephadex G-75 gel column, and the chromatographic characteristics were investigated and purity identification was carried out. Material/water ratio of 1:15 (g/mL), extraction temperature of 100 ℃ and extraction time of 150 min were found optimal, and the extraction yield of polysaccharides was 5.53% under these optimal extraction conditions. The purified polysaccharides were analyzed by UV spectroscopy to contain neither protein nor nucleic acids.

coixan；orthogonal array design；extraction；isolation and purification

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0001-05

2010-06-28

國家“863”計劃項目(2008AA10Z332)；江西省科技廳2008年重點項目(2008S00594)

肖小年(1968—)，女，教授，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物與保鍵食品研發(fā)。E-mail：xiaonc@hotmail.com

*通信作者：熊華(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物與保健食品研發(fā)。E-mail：huaxiong100@hotmail.com