日本血吸蟲Sj Cyclophilin B基因的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)效果分析

彭金彪，韓宏曉，洪煬，王艷，郭凡吉，石耀軍，傅志強(qiáng)，劉金明，程國鋒，林矯矯

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241

血吸蟲 (Schistosome) 感染引起的血吸蟲病(Schistosomiasis) 是一種嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病，目前該病仍在全球74個國家和地區(qū)流行，有2億人受感染，6億人受威脅。截止2007年，我國尚有449個血吸蟲病流行縣 (市、區(qū)) 和3563個流行鄉(xiāng)鎮(zhèn)，估計患者50多萬人[1]。近年來我國加大血吸蟲病防治工作力度，血吸蟲病流行態(tài)勢得到有效控制，但是傳染源控制措施很難落實(shí)到位，家畜作為傳染源的威脅依然嚴(yán)峻。目前血吸蟲病防治仍以吡喹酮化療為主，但化療可能誘導(dǎo)抗藥性產(chǎn)生，具有潛在產(chǎn)生耐藥性的危險，且藥物治療無法控制重復(fù)感染，因此血吸蟲病新型疫苗及新藥相關(guān)研究已成為目前血吸蟲病防治研究的重大需求。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，利用相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)尋找潛在疫苗候選分子和藥物靶標(biāo)逐漸成為研究的熱點(diǎn)[2]。

日本血吸蟲生活史繁雜，經(jīng)過多個宿主和不同發(fā)育階段，血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體具有不同的生理病理特征。童蟲是血吸蟲在終末宿主的早期發(fā)育階段蟲體，在血吸蟲生生長發(fā)育中具有重要意義，童蟲蟲體脆弱，侵入皮膚內(nèi)早期的血吸蟲童蟲是宿主免疫系統(tǒng)攻擊的重要靶標(biāo)，尋找日本血吸蟲童蟲期特異性信號分子作為疫苗候選分子或藥物靶標(biāo)，以疫苗或藥物阻斷血吸蟲的生活史不失為防控血吸蟲病的理想途徑[3]。本課題組構(gòu)建的日本血吸蟲童蟲cDNA文庫，為童蟲期差異表達(dá)基因的深入系統(tǒng)研究提供了良好的平臺。CyPB參與的蛋白加工、修飾、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能相關(guān)，在多個物種中有著廣泛研究[4]。本研究以童蟲期高表達(dá)基因 Sj CyPB為研究對象，克隆、表達(dá)了該基因，驗(yàn)證了該基因在日本血吸蟲童蟲期高表達(dá)，同時評估該基因重組抗原在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的抗血吸蟲病的保護(hù)效果，為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和酶

Trizol和superscripTMII反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、SalⅠ、RNA inhibitor、DNAse、熒光實(shí)時定量PCR (SYBR Green法) 檢測試劑盒和隨機(jī)引物購自TaKaRa生物工程 (大連) 有限公司；DNA Marker DL2000、DL5000，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海天根生物科技有限公司；QIAquick?Gel Extraction Kit購自 Qiagen公司；Agrose、DEPC購自上海生工生物工程公司；硝酸纖維素膜 (Whatman) 購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；Bacto-yeast extract、bacto-tryptone為Oxoid公司產(chǎn)品；GST Bind Resin (Merck-Novagen) 購自中新生命科技有限公司；3,3,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP均購自Sigma公司。

1.2 菌種、實(shí)驗(yàn)動物和血清

感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21購自天根生化科技 (北京) 有限公司，pET28a(+) 表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。新西蘭白兔 (雄性，2.5~3.0 kg) 購自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場，BALB/c小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。新西蘭白兔以腹部貼片法分別感染15 000、8000、5 000、2000條血吸蟲尾蚴，在感染后7、13、18、23、32、42 d分別剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，用PBS充分洗滌去除粘附的宿主組織后，凍存液氮備用。日本血吸蟲成蟲抗原免疫兔血清由本室金亞美老師惠贈。

1.3 RNA的提取

取液氮凍存的日本血吸蟲童蟲和成蟲，按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取及純化。

1.4 含ORF cDNA片段擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

從本課題組構(gòu)建的童蟲cDNA文庫中獲得一段童蟲差異表達(dá)EST，長436 bp，通過NCBI中Blast分析，發(fā)現(xiàn)該序列與Schistosoma mansoni Cyclophilin B同源。以Schistosoma mansoni Cyclophilin B序列設(shè)計引物 (上游引物P1和下游引物P2)，以日本血吸蟲童蟲cDNA為模板，PCR擴(kuò)增含ORF的cDNA片段序列片段。引物P1(5′?3′)：ATGGCCGTGTTAAG AGTGTT，P2(5′?3′)：TCATTCAGCAGCGTCAGTGT，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。將測序得到的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對 (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用 DNAStar軟件分析該基因的ORF，并對其氨基酸殘基數(shù)、組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量等進(jìn)行分析；利用Clustalw軟件對不同物種的 CyPB蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對；利用GeneDoc軟件對比對結(jié)果進(jìn)行編輯。

1.5 熒光實(shí)時定量RT-PCR檢測

分別提取日本血吸蟲7、13、18、23、32日齡及42日齡的蟲體總RNA，定量，反轉(zhuǎn)錄，消化基因組DNA，純化回收。以日本血吸蟲NADH基因?yàn)閮?nèi)參，以純化的不同期別的日本血吸蟲 cDNA為模板，以SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測Sj CyPB基因的表達(dá)量。擴(kuò)增Sj CyPB的引物：Sense primer(5′?3′): ATGGCTAATGCTGGTCCTAAC，Antisense primer (5′?3′): GTCCACAGTTTGCTATCTTCAC，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增基因片段長度為250 bp左右，引物使用濃度為10 pmol。NADH引物，Sense primer(5′?3′): CGAGGACCTAAC AGCAGAGG，Antisense primer(5′?3′): TCCGAACGA ACTTTGAATCC，引物序列由Dr Goffrey Gobert提供，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增基因片段長度為250 bp左右，引物使用濃度為10 pmol。反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Premix Taq 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，EASY Dilution Butter 8.2 μL，模板1 μL；反應(yīng)條件為：95℃10 s，然后95℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)，其中72℃ 15 s結(jié)束時間為熒光信號檢測點(diǎn)，每個反應(yīng)均做3孔重復(fù)。采用cobert公司rotogene6.0軟件進(jìn)行計算分析，以NADH作為內(nèi)參，得出相對于每百萬持家基因的目的基因含量。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

1.6.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

在該基因ORF擴(kuò)增序列的5′端和3′端分別引入EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增得到含完整ORF的Sj CyPB基因序列，將該序列定向亞克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-Sj CyPB。

1.6.2 在大腸桿菌中的表達(dá)

將以PCR、酶切和測序3種方法鑒定為陽性的pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21接種于LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600=1.0時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后不同時間點(diǎn)分別收集菌液，確定最佳誘導(dǎo)時間和相關(guān)誘導(dǎo)表達(dá)條件；同時以SDS-PAGE電泳分析經(jīng)超聲波裂解后的菌體蛋白，判定其表達(dá)狀況。將以包涵體形式存在的重組蛋白溶解于8 mol/L尿素，然后以濃度梯度降低的溶解尿素的PBS逐漸透析至PBS中，完成復(fù)性，隨后以GST Bind Resin純化出重組蛋白。

1.6.3 Western blotting檢測

將純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC) 膜上，用經(jīng)pGEX-6P-1/BL21空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌蛋白吸附的日本血吸蟲全蟲抗原免疫兔血清作一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，以沉淀型TMB作為底物進(jìn)行顯色。

1.7 小鼠免疫保護(hù)性試驗(yàn)

1.7.1 動物分組

選擇6~8周齡 (SPF級) BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為免疫組、佐劑對照組和空白對照組。免疫組每次每只注射含206佐劑和20 μg純化的Sj CyPB重組蛋白的乳化液；佐劑對照組每次每只注射相同體積的206佐劑和PBS的乳化液；空白對照組每次每只注射相同體積的 PBS。免疫間隔時間為2周，共免疫3次。第3次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染 (30±2) 條日本血吸蟲尾蚴。

1.7.2 蟲體計數(shù)

攻蟲42 d后，剖殺小鼠，收集血清，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，計數(shù)蟲體，計算減蟲率。

1.7.3 肝組織蟲卵計數(shù)

解剖小鼠時采集肝臟，稱取1 g，加入5 mL PBS，用勻漿機(jī)混勻后，加入5 mL 10% NaOH (W/V)，56℃水浴鍋中消化2 h，消化完全后混勻取4份50 μL樣品，鏡檢計算蟲卵數(shù) (EPG為平均每克肝組織中蟲卵數(shù))，計算減卵率[5]。

1.7.4 ELISA檢測抗體水平

試驗(yàn)小鼠分別于免疫前、一免、二免和三免后第7天尾部采血，剖殺時收集血液分離血清，1∶100稀釋后按常規(guī)ELISA方法檢測抗體效價[6]。

1.7.5 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(Duncan法)。

2 結(jié)果

2.1 Sj CyPB基因的克隆及生物信息學(xué)分析

在本課題組構(gòu)建的童蟲文庫中篩選得到日本血吸蟲Sj CyPB基因，核苷酸和氨基酸序列分析比較結(jié)果顯示：該序列編碼的氨基酸與曼氏血吸蟲CyPB具有較高相似性，同時具有典型的CyP家族功能結(jié)構(gòu)域，故命名為日本血吸蟲Cyclophilin B基因 (Sj CyPB)，將該基因序列提交到 NCBI，登錄號為GQ403665。

以日本血吸蟲童蟲cDNA為模板，PCR克隆獲得含完整開放閱讀框的編碼基因，其開放閱讀框?yàn)?72 bp (圖1)。分析表明，該基因編碼243 個氨基酸，推測蛋白分子量為23.5 kDa。選擇分別來自曼氏血吸蟲、果蠅、雞、硬蜱、爪蟾、斑馬魚、小鼠、牛、人、秀麗桿線蟲、球蟲、家蠶、馬來絲蟲、?？?、錐蟲15個物種的CyPB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果顯示：該基因所編碼氨基酸序列與曼氏血吸蟲的CyPB相似性為84℅，與CyPB其他物種相似性在54%~64℅之間。這也與CyPB基因在不同物種中較為保守，其遺傳距離遠(yuǎn)近與物種的遺傳距離遠(yuǎn)近基本吻合。

2.2 Sj CyPB基因的期別差異表達(dá)分析

Real-time PCR分析結(jié)果表明，Sj CyPB在日本血吸蟲童蟲和成蟲中均有較高表達(dá) (圖 2)，其中以18 d童蟲基因表達(dá)量最高，7 d童蟲的基因表達(dá)量相對較低 (圖2)。

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-6P-1-Sj CyPB/ BL21的構(gòu)建與原核表達(dá)及蛋白純化

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 PCR products of Sj CyPB gene. M: DL2000 DNA ladder; A: PCR products of Sj CyPB gene.

圖2 熒光實(shí)時定量PCR分析Sj CyPB基因在日本血吸蟲不同階段蟲體的表達(dá)情況Fig. 2 Stage differential expression of Sj CyPB in different stages of Schistosoma japonicum by real-time PCR. 7 d: 7 days schistosomula; 13 d: 13 days schistosomula; 18 d: 18 days schistosomula; 23 d: 23 days worms; 32 d: 32 days worms; 42 d: 42 days adult worms.

經(jīng)PCR、雙酶切鑒定和測序，證實(shí)pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21在大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)，重組蛋白分子量約為49.5 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符。改變誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時間以優(yōu)化表達(dá)條件，結(jié)果顯示終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，蛋白達(dá)到最大表達(dá)量?？扇苄苑治鲲@示：重組蛋白以包涵體形式存在 (圖3)。將重組蛋白溶解于8 mol/L尿素，以尿素濃度梯度降低的PBS逐漸透析至PBS中。完成復(fù)性，經(jīng)過GST Bind Resin純化重組蛋白 (圖4)。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析

表達(dá)的重組蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用經(jīng)pGEX-6P-1/BL21載體和大腸桿菌菌體蛋白吸附的日本血吸蟲全蟲抗原免疫兔血清作一抗，Western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一明顯的識別條帶，大小與已知目的條帶一致 (圖5)，表明重組表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。

圖3 SDS-PAGE分析pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21重組蛋白的表達(dá)Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the expression products of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 in E. coli. M: low-molecular protein marker; A: pGEX-6P-1 uninduced with IPTG for 6 h; B: pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 induced with 1 mmol/L IPTG.

圖4 SDS-PAGE分析pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21純化的重組蛋白Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 in E. coli. M: low-molecular protein marker; A&B: purified recombinant protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 in E. coli.

2.5 動物免疫試驗(yàn)結(jié)果

動物試驗(yàn)結(jié)果 (表 1) 表明空白對照組平均每只小鼠載蟲數(shù)為21.9條，佐劑對照組為20.91條，而免疫組為 15.0條，與空白對照組相比，重組蛋白Sj CyPB在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)了31.50%的減蟲率，t檢驗(yàn)分析表明免疫組和空白對照組差異極顯著(P＜0.01)；與佐劑對照組相比，重組蛋白 Sj CyPB在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)了28.26%的減蟲率，t檢驗(yàn)分析表明免疫組和佐劑對照組差異顯著 (P＜0.05)。肝臟經(jīng)消化處理后，顯微鏡下進(jìn)行蟲卵計數(shù)，空白對照組平均每克小鼠肝臟蟲卵數(shù)為70.768個，佐劑對照組為69.866個，而免疫組為41740.7個，與空白對照組相比，肝臟蟲卵數(shù)減少41.01%，t檢驗(yàn)分析顯示差異極顯著 (P＜0.01)；與佐劑對照組相比，肝臟蟲卵數(shù)減少40.25%，t檢驗(yàn)分析顯示差異顯著(P＜0.05) (表1)。

2.6 血清抗體水平

各組小鼠血清中Sj CyPB特異性IgG抗體的變化見圖6。第2次免疫后7 d重組抗原免疫組的抗Sj CyPB特異性IgG抗體滴度達(dá)到較高水平，三免后又略有升高，攻蟲6 周后剖殺動物時抗體水平達(dá)到更高水平，而空白對照組和佐劑對照組Sj CyPB特異性 IgG抗體水平在攻擊前后一直維持在較低水平，無明顯變化 (圖6)。

圖5 pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21重組蛋白的 Western blotting分析Fig. 5 Western blotting analysis of Sj CyPB recombinant protein. M: protein marker; A: protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 induced with IPTG; B: purified protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 uninduced with IPTG.

表1 BALB/c小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab1e 1 Worm and egg counting reduction rate induced by Sj CyPB in Balb/c mice

圖6 Balb/c小鼠血清抗Sj CyPB抗原特異性IgG抗體水平檢測結(jié)果Fig. 6 Specific IgG level against Sj CyPB by ELISA.

3 討論

血吸蟲生活史繁雜，血吸蟲在生活史不同階段的個體形態(tài)、發(fā)育等有著很大差異，就其原因，可能源于日本血吸蟲不同發(fā)育階段基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)水平差異。信號通路相關(guān)分子在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，加強(qiáng)日本血吸蟲信號分子的研究，可為研究寄生蟲與宿主相互作用關(guān)系和高效的抗日本血吸蟲疫苗提供基礎(chǔ)[7-8]。

Cyclophilin (CyP) 廣泛存在，在不同物種中較為保守。CyP可結(jié)合相關(guān)蛋白，并催化加速其折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)；特別是可催化富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，起著分子伴侶的作用；同時在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要調(diào)節(jié)作用[9]。本研究克隆的Sj CyPB基因?yàn)镃yP家族的主要成員，CyPB存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也存在于高爾基復(fù)合體、細(xì)胞表面和基質(zhì)中，研究表明其在多個物種生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，包括加速蛋白結(jié)合及輔助折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)的功能等[10-11]，但在血吸蟲中未見有對其功能的詳細(xì)研究報道。

本研究以Sj CyPB為研究對象，克隆了該基因，將其序列與Sm CyPB比對，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲該基因所編碼氨基酸序列與曼氏血吸蟲編碼氨基酸序列的相似性為84℅，與其余物種CyPB基因的相似性在54%~64℅之間。該基因編碼氨基酸序列與日本血吸蟲終末宿主如人、牛 CyPB的編碼氨基酸序列差異較大，說明有作為潛在疫苗候選分子何藥物靶標(biāo)進(jìn)行深入研究的可能性。

本研究發(fā)現(xiàn)，Sj CyPB在日本血吸蟲各個發(fā)育階段發(fā)育中均有表達(dá)，其中以18 d童蟲基因表達(dá)量最高，7 d童蟲的基因表達(dá)量相對較低。18 d童蟲及隨后階段蟲體在終末宿主體內(nèi)生長發(fā)育較快，代謝旺盛，蟲體細(xì)胞分化迅速，CyPB基因在該階段的大量表達(dá)，可能與 CyPB參與的蛋白加工、修飾、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能相關(guān)，CyPB基因可能在日本血吸蟲生活和生長發(fā)育中有著重要的生物學(xué)意義。

本研究以日本血吸蟲全蟲抗原免疫兔血清作為一抗，Western blotting證實(shí)Sj CyPB重組蛋白具有良好的免疫原性。以Sj CyPB重組抗原進(jìn)行小鼠抗原免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明Sj CyPB重組抗原在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生部分免疫保護(hù)效果，小鼠成蟲荷蟲量減少了31.5%，肝臟蟲卵數(shù)減少了41.01%。以上研究表明，Sj CyPB基因可作為潛在的日本血吸蟲疫苗候選分子深入研究。同時，應(yīng)用ELISA方法檢測了試驗(yàn)鼠Sj CyPB重組抗原特異性IgG抗體消長情況，結(jié)果顯示重組抗原免疫小鼠產(chǎn)生了特異性 IgG抗體，而空白對照組和佐劑對照組特異性IgG抗體水平一直維持在較低水平，基本上沒有變化，提示Sj CyPB重組抗原免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答可能在抗血吸蟲感染中發(fā)揮一定的作用。

本研究克隆了日本血吸蟲Sj CyPB基因，分析Sj CyPB在日本血吸蟲不同期別的表達(dá)情況，隨后在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并進(jìn)行動物免疫保護(hù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該基因重組抗原可在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)作用?？傊?，本研究對Sj CyPB基因進(jìn)行了初步研究，該基因在血吸蟲性別發(fā)育中的生物學(xué)功能以及其作為抗血吸蟲病候選疫苗或藥物靶標(biāo)的潛力仍需進(jìn)一步深入研究。

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