芽胞桿菌BSD-8肌氨酸氧化酶的純化與性質(zhì)

劉輝，孫桂琴，馬曉航，孫玲艷，盧向鋒，張鵬程

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058

芽胞桿菌BSD-8肌氨酸氧化酶的純化與性質(zhì)

劉輝，孫桂琴，馬曉航，孫玲艷，盧向鋒，張鵬程

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058

對一株從土壤中分離到的芽胞桿菌Bacillussp.BSD-8菌株所產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性較高的肌氨酸氧化酶進行純化，并對該酶的特性進行了研究。通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素離子交換柱、Toyopearl疏水層析柱和Sephadex G-75分子篩層析，使酶提純25倍，比活力達到5.3 U/mg。研究了純化后的酶的生化特性，確定了該酶的主要特性：該酶為黃素蛋白，與黃素以非共價鍵的方式結(jié)合，由單一亞基組成，其亞基分子量為51 kDa。酶的最適反應(yīng)溫度及pH分別為60℃與8.5。該酶在60℃及pH 8.0~10.0條件下穩(wěn)定。以Lineveaver-Burk作圖法求得該酶米氏常數(shù)Km值為3.1 mmol/L。Ag+、Hg2+、SDS及 Tween 80對該酶有強抑制作用，而Tween 20和Triton X-100對酶活性無影響。該肌氨酸氧化酶在耐熱性質(zhì)上比以前所報道的肌氨酸氧化酶有很大的提高，在酶法肌酐測定應(yīng)用中有明顯的優(yōu)勢。

肌酸，肌氨酸氧化酶，熱穩(wěn)定性

Abstract:We purified a sarcosine oxidase fromBacillussp.strain BSD-8 isolated from soil.We purified the enzyme by ammonium sulfate precipitation, DEAE-cellulose, Toyopearl hydrophobic and Sephadex G-75 molecular sieve chromatography and characterized the purified sarcosine oxidase.This sarcosine oxidase was a flavin enzyme containing a noncovalently bound flavin with the subunit molecular mass of 51 kDa.The optimal temperature for this enzyme was 60°C and it showed its highest activity at pH 8.5.It was stable in the pH range of 8.0–10.0 and at the temperature of 60°C.Estimated by Lineveaver-Burk plots, theKmof the enzyme was 3.1 mmol/L.Ag+, Hg2+, SDS and Tween 80 dramatically inhibted the enzyme activity, whereas Tween 20 and Triton X-100 had no effect on enzyme activity.The thermostability of this enzyme was better than reported sarcosine oxidases, and it could be applied in enzymatic measuring of creatinine.

Keywords:creatine, sarcosine oxidase, thermostability

磷酸肌酸是人體內(nèi)肌肉、腦、神經(jīng)等易興奮組織唯一起能量暫時儲存作用的物質(zhì)。它在肌酸激酶的作用下將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，同時生成肌酸(Creatine)。生成的肌酸能被轉(zhuǎn)化成肌酐(Creatinine)，而肌酐經(jīng)過腎臟的腎小球濾過由血液進入尿液從而排出體外。血清肌酐正常值為44~106 μmol/L。但當(dāng)腎臟功能出現(xiàn)問題時，血肌酐濃度可達到 141.4~176.8 μmol/L，嚴(yán)重時甚至?xí)_到 1000 μmol/L[1-2]。為此，臨床上將血液和尿液中的肌酐含量作為反映腎小球濾過功能的常用指標(biāo)。

長期以來臨床上對于肌酐的測定都是利用一種稱之為Jaffe反應(yīng)的化學(xué)方法進行測定。由于化學(xué)反應(yīng)缺少專一性，許多物質(zhì)的存在均能影響反應(yīng)的檢測結(jié)果。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們研究出利用酶進行肌酐測定的方法。由于酶催化專一性強，樣品不經(jīng)處理就可進行測定。因而在抗干擾方面酶法測定比化學(xué)測定法有無可比擬的優(yōu)越性。2007年，Ramanavicius等[3]利用SOX制成一種電流生物傳感器來檢測人體血液和尿液中的肌酐，使SOX在臨床上的應(yīng)用更加方便。

在酶法的肌酐測定系統(tǒng)中，肌酐在各種酶的催化作用下被分解生成各種小分子物質(zhì)及過氧化氫。產(chǎn)生的過氧化氫可在過氧化物酶催化作用下與酚類及4-氨基反應(yīng)生成紅色化合物。其原理如下：

其中的肌氨酸氧化酶是測定系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一。該酶的穩(wěn)定性對試劑的性能有重要的影響。

該酶主要由微生物所產(chǎn)生，已從多種微生物中分離到了肌氨酸氧化酶。目前已知的產(chǎn)肌氨酸氧化酶的微生物主要有銨鐠柱胞霉菌 Cylindrocarpon didymium[4]、變青鏈霉菌 Streptomyces lividans[5]、芽胞桿菌Bacillus sp.[6-7]、節(jié)桿菌Arthrobacter sp.[8-9]、棒狀桿菌 Corynebacterium sp.[10]、反硝化產(chǎn)堿菌Alcaligenes denitrificans[11]等。但以上報道的微生物所產(chǎn)生的肌氨酸氧化酶的熱穩(wěn)定性不是很好，僅在40℃以下時較為穩(wěn)定，在試劑的運輸及保存過程中都帶來許多問題，影響了酶法測定的普及。

本研究從土壤中篩選出一株產(chǎn)熱穩(wěn)定性優(yōu)良的肌氨酸氧化酶的Bacillus sp.菌株，并對其所產(chǎn)的肌氨酸氧化酶的純化和性質(zhì)進行了研究。其所產(chǎn)的肌氨酸氧化酶的熱穩(wěn)定性較好，最適反應(yīng)溫度為60℃，在60℃條件下酶活力依然穩(wěn)定，為目前所知的熱穩(wěn)定性最高的肌氨酸氧化酶。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

DEAE-Cellulose離子交換層析柱填料購自上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Toyopearl HW-65C疏水層析柱填料購自日本TOSOH公司；Sephadex G-75層析柱填料為進口分裝；SDS-聚丙烯酰氨電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自上海博亞生物技術(shù)有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)、肌氨酸(Sarcosine)均為分析純；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

DEAE-Cellulose離子交換層析柱、Toyopearl HW-65C疏水層析柱和Sephadex G-75層析柱的規(guī)格均為50 mm×550 mm；JY92-II型超聲波細胞粉碎機為寧波新芝科器研究所生產(chǎn)；電泳儀及 DYY-III型垂直電泳槽購自北京市六一儀器廠。

1.2 產(chǎn)酶菌株

BSD-8菌株從土壤中分離，本實驗室保存。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA鑒定，該菌株屬于Bacillus sp.。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(產(chǎn)SOX培養(yǎng)基)：肌酸，5 g；酵母膏，8 g；磷酸二氫鉀，0.5 g；磷酸氫二鉀，2.0 g；硫酸鎂，0.5 g；pH 7.0；加水至1000 mL。

1.3 粗酶液的制備

將 BSD-8菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，取產(chǎn)酶發(fā)酵液，5000 r/min冷凍離心，收集菌體，用50 mmol/L，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液洗細胞2次后，將其懸浮于2倍體積的緩沖液中。將細胞破碎后，5000 r/min離心50 min去除細胞碎片，得到粗酶液。

1.4 肌氨酸氧化酶酶活力的測定

取酶液0.1 mL加入到0.9 mL含有0.01 mol/L肌氨酸的焦磷酸鈉緩沖液(pH 8.0，0.1 mol/L)中，于37℃反應(yīng)10 min后，加入0.25 mL濃度為1.0 mol/L的醋酸終止反應(yīng)，再加入1.5 mL含有0.04%乙酰丙酮的20%乙酸銨溶液，于37℃保溫40 min后，在410 nm處測定OD值。酶活的定義為：37℃每分鐘分解1 μmol肌氨酸的酶量為一個酶活單位。

1.5 蛋白濃度測定

蛋白濃度的測定用Folin-酚法[12]。

1.6 酶的純度及分子量測定

酶的純度及分子量通過電泳的方法測定[13]，用 PAGE顯示一條蛋白條帶后，再用 SDS-PAGE測定酶的分子量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白及分子量為：兔磷酸化酶B 97.4 kDa，牛血清白蛋白66.2 kDa，兔肌動蛋白43.0 kDa，牛碳酸酐酶 31.0 kDa，胰蛋白酶抑制劑 20.1 kDa，雞蛋清溶菌酶 14.4 kDa。PAGE用10%的分離膠，SDS-PAGE用10%的分離膠，濃縮膠的濃度為4%；染色與脫色用考馬斯亮藍法。

1.7 酶的最佳反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性試驗

在25℃~80℃的溫度范圍內(nèi)，每隔5℃測定酶活力，以確定酶的最佳反應(yīng)溫度。將酶液在不同溫度下處理10~30 min后，再測定酶活力，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.8 酶的最佳反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性試驗

在 pH 4.0~11.0的緩沖液中測定酶活力(其中pH 4.0~6.0為0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6.0~8.5為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液；pH 8.5~9.5為 0.05 mol/L硼砂-硼酸緩沖液；pH 9.5~11.0為0.05 mol/L硼砂-NaOH緩沖液)，以確定酶的最佳反應(yīng)pH。在上述不同pH值的緩沖液中加入酶液，于25℃保溫18 h，pH 8.0下測定酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定范圍。

1.9 酶促反應(yīng)動力學(xué)

在37℃、pH 8.0下，以不同濃度的肌酸為底物測定酶活力。以Lineweaver-Burk作圖法[14]，求出肌氨酸氧化酶對肌氨酸的Km值。同時求得該酶的轉(zhuǎn)化數(shù)Kcat，其定義為每個分子酶在單位時間內(nèi)能催化的底物分子數(shù)。

1.10 不同化學(xué)物質(zhì)對酶活力的影響

將酶液加入到含不同化學(xué)物質(zhì)的溶液中于25℃處理30 min，然后在含相同濃度化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)體系中測定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOX的純化

2.1.1 SOX的純化過程

粗酶液首先以 20%~80%的硫酸銨進行分級沉淀。并分別測定沉淀的蛋白含量及酶活力，計算比活力。結(jié)果表明該酶的最佳分離濃度區(qū)間為60%~70%。

收集的酶液在pH 7.0、10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中透析后上樣至預(yù)先平衡好的DEAE-纖維素層析柱，用含0~1.5 mol/L KCl的緩沖液進行線性梯度洗脫，分管收集。經(jīng)該步純化后，酶活達到25.3 U/mL。

之后，在收集的酶液中加入硫酸銨至45%的飽和度，上樣到經(jīng)含 45%硫酸銨的緩沖液平衡好的Toyopearl HW-65C疏水層析柱，用含45%~0%硫酸銨的緩沖液反向梯度洗脫，分別收集。該步驟純化效果明顯，合并的酶活力達到了60.78 U/mL。

收集的酶液經(jīng)濃縮，透析后上樣到預(yù)先用10 mmol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液平衡好的Sephadex G-75分子篩層析柱，用含有100 mmol/L KCl的上述相同緩沖液洗脫，分管收集，合并比活力最高的部分。經(jīng)該步純化后，酶比活力達到5.3 U/mg。

2.1.2 SOX提純結(jié)果

肌氨酸氧化酶經(jīng)過上述提純后，結(jié)果見表 1。各步提取的酶樣品用 PAGE檢測，結(jié)果見圖1。純化后SOX比活力達到5.3 U/mg，提純25倍，得率為22.3%。

2.2 BSD-8 SOX的理化性質(zhì)

2.2.1 SOX的分子量

純化后的SOX在10%的PAGE中顯示單一的條帶，在SDS-PAGE中也顯示為單一條帶，表明SOX由單一亞基組成。通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比較計算，得到其亞基分子量為51 kDa(圖2)。

表1 肌氨酸氧化酶的提純總結(jié)Table 1 Summary of the purification of SOX

圖1 各步提純樣品的PAGE圖譜Fig.1 PAGE pattern of SOX samples from different steps of purification.A: crude extract; B: ammonium sulfate precipitationfraction; C: DEAE-cellulose fraction; D: Toyopearl HW-65 fraction; E: Sephdax G-75 fraction.

圖2 SDS-PAGE測定SOX亞基分子量結(jié)果，經(jīng)過計算得出分子量為51 kDaFig.2 Molecular weight of SOX subunit was 51 kDa which was determined by the calculation from the result of SDS-PAGE.

2.2.2 SOX的最適作用溫度與熱穩(wěn)定性

在不同溫度下測定SOX酶活力，結(jié)果見圖3，酶作用的最適溫度為60℃。在pH 8.0磷酸鹽緩沖液中不同溫度分別處理 10 min、30 min后測定酶活力，結(jié)果見圖4。該酶在60℃處理10 min還可保留94%的酶活。

2.2.3 SOX的最適pH與pH穩(wěn)定性

在pH 4.0~11.0的緩沖液中測定酶活力，結(jié)果見圖5，SOX作用的最適 pH為 8.5。在上述不同 pH值的緩沖液中加入酶液，于室溫保溫18 h，測定酶活力。結(jié)果顯示該酶在pH 7.0~10.0穩(wěn)定(圖6)。

2.2.4 酶促反應(yīng)動力學(xué)

以不同濃度肌氨酸為底物，于37℃測定酶活力。Lineweaver-Burk作圖法求得肌氨酸氧化酶的米氏常數(shù)Km值為3.1 mmol/L。根據(jù)所測定的SOX的比活和分子量，計算出該酶的Kcat為4.5/s。

圖3 不同反應(yīng)溫度對SOX活力的影響Fig.3 Effects of temperature on SOX activity.

圖4 溫度對SOX穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperature on the stability of SOX.

圖5 不同pH對酶活力的影響Fig.5 Effects of pH on SOX activity.pH 4.0?6.0: 0.1 mol/L citrate buffer solution; pH 6.0?8.5: 0.1 mol/L phosphate buffer solution; pH 8.5?9.5: 0.05 mol/L borate buffer solution;pH 9.5?11.0: 0.05 mol/L borax-NaOH buffer solution.

2.2.5 不同化學(xué)物質(zhì)對酶活性的影響

由表2、表3可以看出，Ag+、Hg2+、SDS能使該酶幾乎完全失活，Zn2+、Fe3+、Li+、Cr3+、Cu2+和 NaN3對酶活性幾乎沒有影響， Ba2+、Mn2+、Ca2+對酶活性有一定促進作用，表面活性劑Tween 20和Triton X-100對酶活性沒有影響，而Tween 80可使50%酶活喪失。

圖6 不同pH對酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of pH on the stability of SOX.pH 4.0?6.0:0.1 mol/L citrate buffer solution; pH 6.0?8.5: 0.1 mol/L phosphate buffer solution; pH 8.5?9.5: 0.05 mol/L borate buffer solution; pH 9.5?11.0: 0.05 mol/L borax-NaOH buffer solution.

表2 不同金屬離子對酶活性的影響Table 2 Effects of metal ions on SOX activity

表3 不同化學(xué)物質(zhì)對酶活性的影響Table 3 Effects of chemicals on SOX activity

2.2.6 BSD-8 SOX與黃素的結(jié)合

據(jù)報道肌氨酸氧化酶為一種黃素蛋白，輔基黃素(FAD或FMN)與其的結(jié)合方式前文已有敘述，共分兩種，一種結(jié)合方式為共價結(jié)合，另一種結(jié)合方式為非共價結(jié)合。將BSD-8 SOX純酶的酶液加入5%或10%的三氯乙酸，沸水處理10 min，發(fā)現(xiàn)上清均呈現(xiàn)黃色。而 Mori等[4]和 Matsuda等[6]報道的單聚體肌氨酸氧化酶經(jīng)相同處理之后，上清無任何色素，也即酶蛋白沒有釋放任何色素，則認(rèn)為黃素與酶以共價鍵結(jié)合。此外，Ogushi等[9]報道產(chǎn)脲節(jié)桿菌 Arthrobacter ureafaciens四亞基 SOX經(jīng)10%三氯乙酸沸水處理15 min，上清液呈現(xiàn)黃色，表明有非共價鍵結(jié)合的黃素存在。根據(jù)上述結(jié)果，初步推測BSD-8的SOX與黃素以非共價鍵的方式結(jié)合。

3 討論

目前所報道的SOX根據(jù)其來源的不同，酶的性質(zhì)變化很大。如 Cylindrocarpon didymium M-1、Corynebacterium sp.U-96[10]、Athrobacter ureafaciens和Bacillus sp.B-0618的SOX分子量分別為 48 kDa、174 kDa、185 kDa和42 kDa。根據(jù)SOX亞基的組成可分為四亞基(α，β，γ，δ)、雙亞基(α，β)和單亞基酶。即使是相同屬的不同菌株產(chǎn)生的SOX，其結(jié)構(gòu)也不一定相同。如 Arthrobacter中不同菌株能產(chǎn)生四亞基和單亞基兩種不同的SOX。BSD-8菌株所產(chǎn)生的SOX純化后經(jīng)PAGE和SDS-PAGE均顯示出單一的條帶。根據(jù)電泳結(jié)果分析該酶由單一亞基組成，亞基分子量應(yīng)為51 kDa。

該酶在pH 8.5，溫度60℃時反應(yīng)活性最高；其在60℃以下，pH 7.0~10.0范圍內(nèi)可穩(wěn)定存在。已報道的熱穩(wěn)定性較好的肌氨酸氧化酶是由Bacillus sp.KS-11A[15]和Bacillus sp.NS-129[16]所產(chǎn)生的，其熱穩(wěn)定溫度在與本實驗相同的條件下測定(熱處理時間 10 min)分別為 50℃和 55℃。而由菌株 BSD-8所產(chǎn)的SOX其熱穩(wěn)定性溫度為60℃，相比而言該酶的熱穩(wěn)定性更好一些。

除此之外研究還發(fā)現(xiàn) p-CMB和 Cu2+對酶活性的影響與已報道的SOX有所不同。除了Bacillus sp.B-0618外，p-CMB可使其他的SOX完全失活，而BSD-8菌株的SOX與B-0618相似，p-CMB對酶活的影響不如其他的 SOX顯著；Cu2+對 BSD-8 SOX活性也無明顯抑制作用，而其他所有的SOX 經(jīng)Cu2+處理后即完全失活。

Mori等[4]和 Matsuda等[6]報道的單聚體肌氨酸氧化酶加入三氯乙酸經(jīng)沸水處理，結(jié)果表明黃素與SOX以共價鍵結(jié)合。而 Ogushi等[9]和 Mukouyama等[17]報道的四亞基SOX酶液經(jīng)處理后，結(jié)果表明有非共價的黃素存在。BSD-8 SOX經(jīng)三氯乙酸處理得到的結(jié)果結(jié)合上述報道的試驗結(jié)果，初步推測BSD-8的SOX與黃素以非共價鍵的形式結(jié)合。

根據(jù)本研究結(jié)果，該酶的特性適合于酶法肌酐測定，其熱穩(wěn)定性優(yōu)良，作為測定用酶有明顯的優(yōu)勢。其次，如上所述，該酶除了熱穩(wěn)定性較好外，在其他特性方面與已報道的SOX也有明顯差異，它們之間是否存在必然的聯(lián)系？值得今后進一步的研究。

REFERENCES

[1]Khan GF, Wernet W.A highly sensitive amperometric creatinine sensor.Anal Chim Acta, 1997, 351: 151?158.

[2]Kim EJ, Haruyama T, Yanagida Y,et al.Disposable creatinine sensor based on thick-film hydrogen peroxide electrode system.Anal Chim Acta, 1999, 394: 225?231.

[3]Ramanavicius A.Amperometric biosensor for the determination of creatine.Anal Bioanal Chem, 2007, 387:1899?1906.

[4]Mori N, Sano M, Tani Y,et al.Purification and properties of sarcosine oxidase fromCylindrocarpon didymiumM-1.Agric Biol Chem, 1980, 44(6): 1391?1397.

[5]Suzuki K, Ogishima M, Sugiyama M,et al.Molecular cloning and expression of aStreptomycessarcosine oxidase gene inStreptomyces lividans.Biosci BiotechnolBiochem, 1992, 56(3): 432?436.

[6]Matsuda Y, Hoshika H, Inouye Y,et al.Purification and characterization of sarcosine oxidase ofBacillusorigin.Chem Pharm Bull, 1987, 35(2): 711?717.

[7]Ichikawa T, Sasaki H, Koike H,et al.Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the sarcosine oxidase fromBacillussp.NS-129.J Struct Biol, 1997,120(1): 109?111.

[8]Nishiya Y, Imanaka T.Cloning and sequencing of the sarcosine oxidase gene fromArthrobactersp.TE1826.J Ferment Bioeng, 1993, 75: 239?244.

[9]Ogushi S, Nagao K, Emi S,et al.Sarcosine oxidase fromAthrobacter ureafaciens: purification and some properties.Chem Pharm Bull, 1988, 36(4): 1445?1450.

[10]Suzuki M.Purification and some properties of sarcosine oxidase fromCorynebacteriumsp.U-96.J Biol Chem,1981, 89: 599?607.

[11]Kim JM, Shimizu S, Yamada H.Crystallization and characterization of sarcosine oxidase fromAlcaligenes denitrificanssubsp.denitrificans.Agric Biol Chem, 1987,51(4): 1167?1168.

[12]Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL,et al.Protein measurement with the Folin Phenol reagent.J Biol Chem,1951, 193: 265?275.

[13]Wang JZ, Fan M.Manual of Protein Technology.Beijing:Science Press, 2000: 77.汪家政, 范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊.北京: 科學(xué)出版社,2000: 77.

[14]Lineweaver H, Burk D.The determination of enzyme dissociation constants.J Am Chem Soc, 1934, 56:658?666.

[15]Toshio I, Masaru S, Taiji K,et al.New sarcosine oxidase M of specified aminoacid sequence-used for enzymatic assay of creatinine or creatine: JP, 5115281-A.1993-05-14.

[16]Suzuki M.New heat-stable sarcosine oxidase-N -for use in creatine and creatinine enzymatic determination, produced e.g.byBacillussp.NS-129 ferm BP-671: JP, 89034035-B.1989-07-17.

[17]Mukouyama E, Ohsawa H, Suzuki H.Cofactors in sarcosine oxidase fromCorynebacteriumsp.U-96.J Protein Chem, 2002, 21: 59?64.

Purification and characterization of a sarcosine oxidase from Bacillus sp.BSD-8

Hui Liu, Guiqin Sun, Xiaohang Ma, Lingyan Sun, Xiangfeng Lu, and Pengcheng Zhang
College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Received:July 31, 2009;Accepted:January 7, 2010

Corresponding author:Xiaohang Ma.Tel: +86-571-88206725; Fax: +86-571-88206725; E-mail: maxiaohong@zju.edu.cn