溫度對超高濃度酒精生料發(fā)酵體系的影響

許宏賢，段鋼

杰能科(中國)生物工程有限公司亞太谷物加工酶應(yīng)用中心，無錫 214028

溫度對超高濃度酒精生料發(fā)酵體系的影響

許宏賢，段鋼

杰能科(中國)生物工程有限公司亞太谷物加工酶應(yīng)用中心，無錫 214028

通過對超高底物濃度生料發(fā)酵中溫度的影響研究發(fā)現(xiàn)，采用溫度梯度的方法可大幅提高酵母的生產(chǎn)效率。以高粱為例，采用35%絕對干物濃度，在新型生料水解酶的配合下，通過合適的逐級降溫培養(yǎng)方式，使用普通酒精干酵母，在90 h內(nèi)發(fā)酵醪液酒精濃度可達(dá)20%(V/V)以上。

生料發(fā)酵，生料水解酶，溫度梯度控制，濃醪發(fā)酵，酒精

Abstract:The effect of temperature on a very high gravity ethanol fermentation using no cook process was investigated.We found that a gradient temperature control strategy could improve the fermentation efficiency significantly.With the assistance of a new raw starch hydrolyzing enzyme and a gradient temperature control strategy, the ethanol concentration could reach up to 20%(V/V)within 90 h using commercially available dry yeast, when sorghum was used as the raw material and the dry substrate concentration was controlled at 35%.

Keywords:no cooking fermentation, granular starch hydrolyzing enzyme, temperature staging strategy, very high gravity fermentation, ethanol

由于能源價格上漲，酒精作為可再生能源之一，生料制酒過程引起更廣泛注意，近期的研究增多[1-2]，商業(yè)化過程進(jìn)展也加快[3]。但相對而言，生料發(fā)酵周期偏長，生料濃醪發(fā)酵的研究并不多。而濃醪發(fā)酵技術(shù)是針對“三農(nóng)問題”、能源問題、環(huán)保問題等社會各種矛盾而產(chǎn)生的酒精生產(chǎn)技術(shù)，符合科學(xué)發(fā)展觀[4-5]。但若采取傳統(tǒng)的蒸煮工藝進(jìn)行超高濃度酒精發(fā)酵，即便不考慮粘度問題，往往需要特別耐高酒精度的酵母[6-7]。生料過程除了可以節(jié)約能量外，由于整個系統(tǒng)中溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于淀粉的糊化溫度，體系粘度比傳統(tǒng)過程低得多[8-9]，因此可以提高發(fā)酵濃度而不必?fù)?dān)心粘度問題。同時由于生料過程中，葡萄糖是逐步緩慢釋放的，因此可以進(jìn)行濃醪發(fā)酵而不必?fù)?dān)心高初糖濃度和高滲透壓對酵母的生長抑制。

傳統(tǒng)濃醪發(fā)酵的相關(guān)研究表明，發(fā)酵溫度對酵母的生長和發(fā)酵效率非常重要[10-13]，但未見采用溫度梯度培養(yǎng)方式進(jìn)行的研究，而針對生料濃醪發(fā)酵過程中溫度影響的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以高粱為原料來研究生料發(fā)酵中體系溫度的選擇及變化對發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全磨30目高粱(本地產(chǎn)白高粱，實(shí)驗(yàn)室粉碎之后過篩，淀粉含量對干基 73.67%)。酵母采用安琪牌釀酒高活性干酵母(耐高溫型)。無水乙醇、葡萄糖、麥芽糖、甘油、乳酸、乙酸均購自北京色譜中心，為色譜級。純水由Millipore制備，純水電阻18.2 M?。主要酶制劑由杰能科國際公司提供，具體為顆粒淀粉水解酶：GC004 酶活力：443 GAU/g GC004的酶活力用顆粒淀粉水解單位(GAU)來表示，GAU是由水解生淀粉的酶活力和水解可溶性糊精的糖化酶活力在規(guī)定條件下經(jīng)過計(jì)算得到的。酶活力的高低顯示了淀粉預(yù)期水解速率的快慢。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓液相色譜為 Agilent 1100系列。天平為Sartorius 系列。移液槍購自熱電(上海)儀器有限公司。酸度計(jì)為Mettler Toledo Delta 320系列。培養(yǎng)箱購自Blue Electric Company。冷卻電熱恒溫水浴鍋由常州澳華儀器有限公司特制。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵醪組成的測定

HP1100 高效液相色譜儀，HP Chemstations 色譜工作站，色譜柱Bio-rad 87H。色譜分離操作條件(常溫下進(jìn)行)流動相：0.01 mol/L H2SO4；流速：0.6 mL/min；柱溫60℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)測定

采用蒸餾-比重法測定[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度對生料濃醪發(fā)酵的影響

取一定量全磨高粱粉，以每個發(fā)酵三角瓶含200 g醪計(jì)，加入一定量的水，配制成一定濃度的醪液，調(diào)pH至4.2，醪液分別在32℃、28℃、25℃、20℃恒溫水浴鍋中培養(yǎng)，添加顆粒淀粉水解酶GC004，添加量為1.0 GAU/g原料，然后接入酵母，接種量為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.04%，不同時間取樣用 HPLC測定發(fā)酵醪組成，發(fā)酵結(jié)束后采樣測定蒸餾醪液在標(biāo)準(zhǔn)條件下的酒精含量。結(jié)果如圖所示：

圖1和圖2分別顯示了絕干濃度為 35%和38%生料濃醪酒精發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在不同恒定發(fā)酵溫度下的變化。由圖可知，在發(fā)酵初期24 h料液中的葡萄糖濃度全部低于0.2 g/dL，表明在該階段，酵母的代謝非常旺盛，生料酶水解出的葡萄糖幾乎全部被酵母利用，然而隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵醪液中的葡萄糖逐漸積累，發(fā)酵溫度越高，未被利用的葡萄糖積累越多；同時配料濃度越高，相同條件下未被利用的葡萄糖積累越早，數(shù)值也越高。這說明在超高濃度發(fā)酵條件下，盡管生料酶依然能有效地水解顆粒淀粉緩釋出葡萄糖，然而酵母由于衰老、高溫、酒精中毒，已經(jīng)不能夠有效地將葡萄糖轉(zhuǎn)換成酒精。研究表明酒精濃度≤3.8%時，其抑制作用可忽略不計(jì)；酒精濃度≥5%時，酵母出芽受到影響，隨著酒精濃度的繼續(xù)增加，它對酵母的生長和發(fā)酵能力的抑制作用急劇增加；酒精濃度≥15%時，一般的酵母不再會生長和發(fā)酵[15]。從圖1和圖2中容易看出，醪液中未被利用的葡萄糖濃度與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，發(fā)酵溫度越高，殘余的葡萄糖濃度愈高。

圖1 35%干物濃度不同發(fā)酵溫度對應(yīng)醪液葡萄糖濃度Fig.1 Temperature effect on glucose concentration with 35% DS fermentation.■: 32°C; ●: 28°C; ▲: 25°C; ×: 20°C.

圖2 38%干物濃度不同發(fā)酵溫度對應(yīng)醪液葡萄糖濃度Fig.2 Temperature effect on glucose concentration with 38% DS fermentation.■: 32°C; ●: 28°C; ▲: 25°C; ×: 20°C.

圖3 35%干物濃度不同發(fā)酵溫度對應(yīng)醪液酒精濃度Fig.3 Temperature effect on ethanol concentration with 35% DS fermentation.■: 32°C; ●: 28°C; ▲: 25°C; ×: 20°C.

圖4 38%干物濃度不同發(fā)酵溫度對應(yīng)醪液酒精濃度Fig.4 Temperature effect on ethanol concentration with 38% DS fermentation.■: 32°C; ●: 28°C; ▲: 25°C; ×: 20°C.

圖3和圖4則分別顯示了濃度為35%和38%生料濃醪酒精發(fā)酵過程中酒精濃度在不同恒定發(fā)酵溫度下的變化。由圖可知，在35%和38%料液發(fā)酵前48 h，發(fā)酵溫度越高，料液中的酒精濃度也越高，表明在發(fā)酵前期，較高的反應(yīng)溫度對酶水解和酵母生產(chǎn)酒精都較為有利；然而隨著發(fā)酵時間的延長，低溫發(fā)酵逐步顯示出其優(yōu)勢，表現(xiàn)為料液中酒精濃度隨著發(fā)酵時間延長逐步增長，在發(fā)酵終點(diǎn) 237 h時，在相同條件下，20℃發(fā)酵的酒精產(chǎn)量明顯高于其他發(fā)酵溫度的酒精產(chǎn)量；而高溫發(fā)酵則明顯對后期發(fā)酵不利，表現(xiàn)為隨著發(fā)酵時間延長料液中酒精濃度沒有增長或增長緩慢，并且隨著發(fā)酵溫度的升高或/和料液濃度的增加，這一現(xiàn)象出現(xiàn)得越早。

綜上所述，對于超高濃度生料酒精發(fā)酵，在恒定培養(yǎng)溫度條件下，發(fā)酵溫度越高前期酒精的生產(chǎn)速率越高，但酵母衰老也越早，酒精的產(chǎn)物抑制也越嚴(yán)重；低溫發(fā)酵雖然非常有利于發(fā)酵后期酒精的生產(chǎn)，但前期產(chǎn)酒較慢，發(fā)酵周期偏長。

2.2 不同梯度降溫過程對生料濃醪發(fā)酵的影響

圖5 不同方式溫度梯度控制Fig.5 Different temperature staging ways.

取一定量全磨高粱粉，以每個發(fā)酵三角瓶含200 g醪計(jì)，加入一定量的水，配制成 35%濃度的醪液，調(diào)節(jié)pH至4.2，添加顆粒淀粉水解酶GC004，添加量為1.0 GAU/g原料，接入酵母，接種量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04%，發(fā)酵過程中對醪液分別在32℃、28℃、25℃、20℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行溫度梯度控制(圖5)，不同時間取樣用HPLC 測定發(fā)酵醪組成，發(fā)酵結(jié)束采樣進(jìn)行蒸餾測定醪液在標(biāo)準(zhǔn)條件下的酒精含量(圖6)。

圖5顯示了不同溫度梯度控制的方式，其中方式一和方式三為一次降溫，方式二和方式四為兩次降溫。

圖6 35%干物濃度不同溫度梯度控制對發(fā)酵液中葡萄糖和酒度的影響Fig.6 Different temperature staging ways effect on glucose and ethanol concentration with 35% DS fermentation.

圖6顯示了濃度為35%生料濃醪酒精發(fā)酵采取不同方式溫度梯度控制過程中葡萄糖濃度和酒精的變化。由圖可知，采取方式一(0~25 h 32℃，25~90 h 20℃)的培養(yǎng)方式，由于在25 h及早降溫，整個過程中殘余葡萄糖濃度維持在較低水平，但是由于發(fā)酵溫度偏低，酶反應(yīng)速度和酵母代謝速度都較慢，發(fā)酵 90 h的酒度僅為 19.32%(V/V)；若采取方式三(0~52 h 32℃，52~90 h 20℃)的培養(yǎng)方式，在發(fā)酵進(jìn)行到52 h時降溫，由于高溫持續(xù)的時間較長，酵母已經(jīng)表現(xiàn)出中毒癥狀，即殘余葡萄糖持續(xù)升高，酒度不再增長，90 h的酒度僅為18.08%(V/V)，這說明52 h降溫太遲了；方式二(0~25 h 32℃，25~77 h 25℃，77~90 h 20℃)和方式四(0~25 h 32℃，25~52 h 28℃，52~90 h 20℃)都采取了兩次降溫的培養(yǎng)過程，整個過程中殘余葡萄糖濃度維持在較低水平，同時發(fā)酵取得了較好的效果，90 h酒度分別達(dá)到 20.73%(V/V)和 20.28%(V/V)；其中又以方式二(0~25 h 32℃，25~77 h 25℃，77~90 h 20℃)優(yōu)于方式四(0~25 h 32℃，25~52 h 28℃，52~90 h 20℃)，由此可見，對于超高濃度酒精生料發(fā)酵，及時合理調(diào)整發(fā)酵溫度至關(guān)重要。

2.3 發(fā)酵強(qiáng)度和染菌

發(fā)酵強(qiáng)度是考核發(fā)酵企業(yè)生產(chǎn)能力的一個重要指標(biāo)。在相同的研究條件下比較了超高濃度生料酒精發(fā)酵和常規(guī)濃度生料酒精發(fā)酵的平均發(fā)酵強(qiáng)度，干物濃度為 35%實(shí)驗(yàn)組的平均發(fā)酵強(qiáng)度為2.26 g/(L·h)，常規(guī)濃度 25%的平均發(fā)酵強(qiáng)度僅為1.58 g/(L·h)，生料超高濃度的平均發(fā)酵強(qiáng)度明顯高于常規(guī)濃度，從而達(dá)到了采用普通市售酵母進(jìn)行高密度、高強(qiáng)度發(fā)酵的目的，這無疑可以使得企業(yè)生產(chǎn)效率最大化，從而提高企業(yè)的生產(chǎn)能力，降低了生產(chǎn)成本。

染菌是酒精工業(yè)發(fā)酵控制的一個難題，對生料過程也不例外。筆者認(rèn)為采取生料無蒸煮工藝，由于葡萄糖逐步緩慢釋放，如果發(fā)酵初期采用合適的酵母接種量，使酵母在料液中占絕對優(yōu)勢，那么緩慢釋放出來的葡萄糖將被酵母充分利用，這樣幾乎不給雜菌的生長留機(jī)會，從而達(dá)到克服染菌的目的；同時可以采取與傳統(tǒng)工藝相似的方法，適當(dāng)添加抑菌劑(如抗生素等)控制雜菌的生長；另外低pH值發(fā)酵也是控制染菌的有效手段，在歐洲酒精發(fā)酵過程中是不允許添加任何抗生素的。自2005年起，以麥類為原料(包括小麥、黑麥、黑小麥、大麥等)的生料酒精生產(chǎn)在歐洲得到大規(guī)模的推廣和應(yīng)用，并取得了比傳統(tǒng)工藝更高的原料出酒率，這充分說明采用生料過程生產(chǎn)酒精，染菌是可防、可控的。

3 總結(jié)與展望

發(fā)酵強(qiáng)度與細(xì)胞的生存環(huán)境有關(guān)。溫度是超高濃度酒精發(fā)酵過程中影響菌體生長的重要因素。利用溫度控制策略是實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度酒精發(fā)酵的重要途徑。本研究通過溫度梯度控制策略，采取生料無蒸煮工藝使用普通市售酒用干酵母，在90 h內(nèi)發(fā)酵醪液酒精濃度可達(dá)20%(V/V)以上。筆者認(rèn)為該工藝可行的原因之一是由于采取生料無蒸煮工藝，葡萄糖逐步緩慢釋放，淀粉未溶出，整個體系的滲透壓非常低；同時采取適當(dāng)?shù)臏囟忍荻瓤刂撇呗?，使酵母?xì)胞的活力得以長久維持，增強(qiáng)了酵母生產(chǎn)乙醇的能力和對酒精的耐受性。這為進(jìn)一步深入研究超高濃度酒精發(fā)酵提供了新的方向。

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Effect of temperature on the no cook, very high gravity ethanol fermentation process

Hongxian Xu, and Gang Duan
Genencor(China)Bio-products Co., Ltd.Application and Technical Service Center, Asia Pacific Grain Processing Enzymes, Wuxi 214028, China

Received:October 12, 2009;Accepted:January 4, 2010

Corresponding author:Gang Duan.Tel: +86-21-23079562; E-mail: gang.duan@danisco.com