昆蟲(chóng)來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

劉明艷，張洪斌，胡雪芹，魏青麗

合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，合肥 230009

昆蟲(chóng)來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

劉明艷，張洪斌，胡雪芹，魏青麗

合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，合肥 230009

幾丁質(zhì)酶在真菌和昆蟲(chóng)的生理和發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，該酶本身及其酶抑制劑是獲取生物農(nóng)藥的重要途徑。本研究從蠶蛹體內(nèi)提取幾丁質(zhì)粗酶，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀和Sephadex G-150分離得到幾丁質(zhì)酶。用SDS-PAGE測(cè)得該酶的分子量為88 kDa。水解膠體幾丁質(zhì)的Km值為22.3 μmol/L。酶反應(yīng)的最適溫度為45℃，最適pH值為6.0，金屬離子和有機(jī)試劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活性都有影響，其中高濃度的Mn2+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用，而Cu2+、SDS則有較強(qiáng)的抑制作用。研究結(jié)果為基于幾丁質(zhì)酶的生物農(nóng)藥篩選研究奠定了基礎(chǔ)。

幾丁質(zhì)酶，分離純化，酶學(xué)性質(zhì)

Abstract:The importance of chitinases in the physiological and developmental processes of fungi and insects makes themselves and their inhibitors important targets for biological pesticides.A chitinase was isolated fromBombyx moriand purified to electrophoretic homogeneity by ammonium sulfate precipitation and Sephadex G-150 column chromatography.The molecular mass was estimated to be about 88 kDa by SDS-PAGE, while theKmwas calculated to be 22.3 μmol/L.Moveover, the optimal reaction temperature was 45°C, and the optimum pH was 6.0.The effect of metal ions and organic reagents on chitinase activity was investigated.The activity was enhanced by high concentration of Mn2+, while was strongly inhibited by Cu2+and SDS.These results provide a basis for screening the chitinase-based biological pesticide.

Keywords:chitinase, isolation and purification, enzyme properties

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，是構(gòu)成大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)也廣泛存在于軟體動(dòng)物以及節(jié)肢動(dòng)物的外殼中。如在真菌、線蟲(chóng)、軟體動(dòng)物的表皮、昆蟲(chóng)的外骨骼和圍食膜、甲殼動(dòng)物的外殼和一些藻類的細(xì)胞壁中均含有幾丁質(zhì)[1-2]。幾丁質(zhì)不僅是昆蟲(chóng)的重要結(jié)構(gòu)組分，而且也是昆蟲(chóng)防止機(jī)械損傷和生物危害的屏障，而包括人類在內(nèi)的脊椎動(dòng)物體內(nèi)無(wú)幾丁質(zhì)成分。幾丁質(zhì)酶是一類能把幾丁質(zhì)降解為 N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚 N-乙酰胺基葡萄糖的水解酶，可以降解幾丁質(zhì)為低分子量、可溶或不可溶的寡糖[3]。該酶廣泛存在于各種真菌、植物、昆蟲(chóng)和魚(yú)類等生物中，催化水解昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的酶主要是幾丁質(zhì)酶，因此，研究獲取昆蟲(chóng)來(lái)源的幾丁質(zhì)酶可以作為生物殺蟲(chóng)劑來(lái)控制昆蟲(chóng)和真菌病害。另外，幾丁質(zhì)代謝是真菌、昆蟲(chóng)等農(nóng)作物病蟲(chóng)害生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶在其胚后發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色，尤其是在幼蟲(chóng)蛻皮和化蛾階段；為了生長(zhǎng)和發(fā)育，昆蟲(chóng)必須周期性地強(qiáng)行通過(guò)蛻皮來(lái)形成一個(gè)新且松弛的角質(zhì)層來(lái)取代舊的；脫皮前，昆蟲(chóng)通過(guò)分泌包含幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的蛻皮液，來(lái)分別消化舊內(nèi)表皮的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)，使表皮細(xì)胞從舊角質(zhì)層分離，引發(fā)蛻皮[4]。因此，以在昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)降解中的關(guān)鍵酶——幾丁質(zhì)酶為靶標(biāo)，是理想的新型生物農(nóng)藥篩選模型。通過(guò)阻斷幾丁質(zhì)酶，阻止昆蟲(chóng)蛻皮、化蛾和圍食膜的再生，以達(dá)到殺滅昆蟲(chóng)的目的。綜上可知，研究獲取幾丁質(zhì)酶及其特性對(duì)于生物農(nóng)藥的創(chuàng)制具有重要意義。本論文從鱗翅目昆蟲(chóng)蠶蛹的化蛾后期中提取幾丁質(zhì)酶，對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)具有新型高效的生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶蛹購(gòu)于安慶市潛山;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自大連TaKaRa公司；Sephadex G-150為Sigma公司產(chǎn)品，其他常用試劑均為分析純。WFZ800-D38紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；KDC-160H高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；SPX-150B生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的配置[5]

稱取2 g幾丁質(zhì)，加入20 mL 85%濃度的濃磷酸溶解，常溫下放置 2 d后，加蒸餾水稀釋，反復(fù)沖洗(采用離心分離)至pH 5.0以上。離心后的幾丁質(zhì)沉淀用蒸餾水調(diào)整終濃度至1%。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶的分離純化

以下若無(wú)具體說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)操作均在0℃~4℃進(jìn)行。

1)粗提?。簩⒂蓟蟮男Q繭于 25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8~10 d后至蠶繭中的蛹化蛾前，收集蠶蛹于0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液中均質(zhì)，冰水浴中超聲1 s，間歇 2 s，150 W 破碎 16 min，4℃、10 000 r/min離心30 min收集上清。

2)硫酸銨分級(jí)沉降：將固體硫酸銨研細(xì)加入粗酶液中，調(diào)至不同的飽和度(10%~80%)，每次加入硫酸銨均需充分溶解，靜置過(guò)夜，10 000 r/min離心15 min分離沉淀與可溶成分[6]，每階段沉淀用后測(cè)定酶活，確定最優(yōu)沉降比例。

3)Sephadex G-150凝膠過(guò)濾層析：將經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉降后的沉淀用0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液溶解，過(guò)夜透析，濃縮后加樣到已平衡的 Sephadex G-150凝膠過(guò)濾柱(3.0 cm×40 cm)，用pH 6.0的磷酸緩沖液洗脫，流速 30 mL/h，收集洗脫液后經(jīng)15% SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定純化蛋白。

1.2.3 酶活力測(cè)定

以 N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生成速度測(cè)定酶活性大小。45℃下，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，每小時(shí)產(chǎn)生 1 μmol/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量為一個(gè)活力單位(U)[7-8]。

酶活力測(cè)定的原理：膠體幾丁質(zhì)＋幾丁質(zhì)酶→N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

在裝有預(yù)熱至45℃的0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)和0.5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)比色管中，加入0.5 mL酶液，于45℃溫育1 h，沸水浴保持20 min中止反應(yīng)，將沸水浴后的酶液置于冰浴冷卻，冷卻后加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴20 min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容到 25 mL，搖勻，離心后取上清，以滅活的等量酶液做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)500 nm下測(cè)吸光度，折算成酶活。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

280 nm處的紫外吸收值用于色譜過(guò)程檢測(cè)蛋白質(zhì)洗脫峰。純化各步驟的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定[9]。

1.2.5 SDS-PAGE分析

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析蛋白質(zhì)的分子量，分離膠濃度為15%，染色使用考馬斯亮藍(lán)R-250[10]。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

1)酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性：在pH 6.0，0.1 mol/L磷酸緩沖液中，酶分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃不同溫度下測(cè)定酶活，考察酶的最適反應(yīng)溫度。將酶在不同溫度下保溫1 h，然后檢測(cè)殘余酶活力，以酶活最高者為100%，考察酶的溫度穩(wěn)定性。并將該酶在45℃、30℃和低溫4℃保藏，取樣測(cè)量保藏過(guò)程中酶活力的變化。

2)酶的最適反應(yīng) pH及 pH穩(wěn)定性：在不同pH(5~9)的反應(yīng)體系中測(cè)定酶活力，研究酶促反應(yīng)的最適pH。將酶液分別置于不同pH的緩沖體系中45℃放置1 h，每個(gè)梯度相差一個(gè)1個(gè)pH，測(cè)定其對(duì)應(yīng)的剩余酶活力，并以酶活最高者為 100%，研究酶的pH穩(wěn)定性。將酶液置于最佳pH，最佳溫度體系中保藏，取樣測(cè)量保藏過(guò)程中酶活力的變化。

3)動(dòng)力學(xué)常數(shù) Km的測(cè)定：將酶液與不同濃度的膠體幾丁質(zhì)底物作用，測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出以1%膠體幾丁質(zhì)為底物的酶的Km值。

4)金屬離子和其他試劑對(duì)酶活力的影響：在不同體系中分別加入各種金屬離子和試劑，觀察金屬離子和試劑對(duì)酶活力的影響。

2 結(jié)果

2.1 幾丁質(zhì)酶的分離和純化

幾丁質(zhì)酶在 25%~60%飽和度下沉淀出來(lái)(圖1)，幾丁質(zhì)酶的分離純化結(jié)果見(jiàn)表1，以50 mL發(fā)酵液開(kāi)始，幾丁質(zhì)酶從粗酶液到最后純化產(chǎn)物共純化了6.253倍，回收率為8.1%，純化后酶的比活力為0.1901 U/mg(表 1)。圖2為純化過(guò)程中 Sephadex G-150凝膠過(guò)濾層析的色譜圖。最后純化結(jié)果達(dá)到了電泳純，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 幾丁質(zhì)酶在不同飽和度硫酸銨中的溶解曲線Fig.1 Dissolution curve of chitinase in different(NH4)2SO4saturation.

表1 幾丁質(zhì)酶的純化Table 1 Purification of chitinase

圖2 Sephadex G-150凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatography of chitinase by Sephadex G-150.

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)幾丁質(zhì)酶的純化Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified chitinase.M:protein marker; 1: crude chitinase; 2: chitinase of(NH4)2SO4; 3:purified chitinase.

2.2 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

酶在不同溫度下測(cè)定的酶活結(jié)果見(jiàn)圖4，該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃左右，在50℃以上酶活急劇下降。酶在 30℃保溫 1 h后剩余活力為原來(lái)的95.31%，45℃以上保溫1 h后酶活大幅下降，達(dá)到60℃保溫1 h后酶幾乎全部失活，表明該酶對(duì)熱較敏感(圖4)。將酶置于4℃、30℃、45℃保藏并取樣測(cè)量酶的剩余酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。酶在4℃下保藏17 h剩余活力為93.70%，8 d后剩余活力仍有原來(lái)的68.37%，說(shuō)明酶在4℃低溫下熱穩(wěn)定性好；45℃保溫3 h活力僅剩34.28%，說(shuō)明該酶在45℃以上熱穩(wěn)定性差。

2.2.2 酶的最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)，該酶催化合成反應(yīng)的最適pH值為6.0，在pH 5~7之間活力較好，當(dāng)反應(yīng)pH升到7.0以上，酶活下降比較快。酶的pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該酶在pH值為5.0~7.0的條件下，穩(wěn)定性相對(duì)較好，一旦高于這個(gè)范圍，酶活降低較快。

圖4 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of chitinase.1: enzyme activity; 2: relative stability.

表2 溫度、時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of temperature and time on the stability of chitinase

2.2.3 動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km的測(cè)定

分別以0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%的膠體幾丁質(zhì)為底物，測(cè)定底物反應(yīng)速率，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求得 Km值為22.3 μmol/L(圖6)。

2.2.4 金屬離子和其他試劑對(duì)酶活力的影響

金屬離子和其他試劑對(duì)酶活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，較高濃度的Mn2+有對(duì)酶活有促進(jìn)作用，0.1 mol/L Mn2+能提高酶活達(dá)132.53%，但0.01 mol/L的Mn2+對(duì)酶活有抑制作用。實(shí)驗(yàn)中所選用其他離子對(duì)酶催化活力均有不同程度的抑制作用，其中 Cu2+對(duì)酶活有較強(qiáng)的抑制作用，Mg2+、Ca2+、Al3+、Zn2+有微弱的抑制作用。SDS對(duì)酶活力抑制最強(qiáng)，0.01 mol/L的SDS抑制了74%左右的活力，Urea只有較弱的抑制作用。

圖5 pH對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of chitinase.1:enzyme activity; 2: relative stablity.

圖6 幾丁質(zhì)酶的Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk polts of chitinase.

表3 金屬離子和其他試劑對(duì)酶活力的影響Table 3 Effect of some compounds and metal ions on activity

3 討論

幾丁質(zhì)酶是一類差異較大的水解酶類，按照水解幾丁質(zhì)鏈的方式不同可分為 3種，包括外切酶、內(nèi)切酶和N-乙酰氨基葡萄糖水解酶。內(nèi)切酶隨機(jī)地切開(kāi)幾丁質(zhì)的β-1,4糖苷鍵，而外切酶從鏈的非還原端開(kāi)始切割幾丁質(zhì)，形成(GlcNAc)2，N-乙酰氨基葡萄糖水解酶水解(GlcNAc)2成GlcNAc或是從N-乙酰殼寡糖的非還原端產(chǎn)生GlcNAc[11]。根據(jù)催化區(qū)域氨基酸序列的相似度，幾丁質(zhì)酶又分為18家族或19家族的氨基水解酶[12]。18家族幾丁質(zhì)酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、病毒、動(dòng)物和一些植物的體內(nèi)，19家族幾丁質(zhì)酶只存在于高等植物體內(nèi)，但是近來(lái)在灰色鏈霉菌Streptomyces griseus中也有發(fā)現(xiàn)[13]。

許多文獻(xiàn)已報(bào)道了不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的分離純化及性質(zhì)研究，但有關(guān)從鱗翅目昆蟲(chóng)蠶蛹體內(nèi)分離到的幾丁質(zhì)酶的分離純化及性質(zhì)研究少有報(bào)道。本研究從家蠶體內(nèi)提取到分子量為88 kDa的幾丁質(zhì)酶，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行一系列的研究。該酶以膠體幾丁質(zhì)為底物，水解膠體幾丁質(zhì)為N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，屬于18家族幾丁質(zhì)酶中的一種酶，為外切酶。該酶的最適溫度為45℃；該酶的最適pH值為 6.0；較高濃度的 Mn2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，除此之外實(shí)驗(yàn)中所選用的其他離子對(duì)酶催化活力均有不同程度的抑制作用，其中 Cu2+對(duì)酶活的抑制作用較強(qiáng)，Mg2+、Ca2+、Al3+、Zn2+有微弱的抑制作用，SDS對(duì)酶活抑制最強(qiáng)，0.01 mol/L的SDS抑制了74%左右的活力。與已有的報(bào)道相比較，在酶的分子量、最適溫度、最適pH值以及金屬離子對(duì)酶活力的影響等方面均有差異。Lee 等從青霉菌 Penicillium sp.LYG 0704中提取的幾丁質(zhì)酶的分子量為47 kDa，其最適pH為5.0左右[14]；Van-Nam Nguyen等從擬青霉屬變曲霉Paecilomyces variotii DG-3中純化后的幾丁質(zhì)酶有2種，其分子量分別為32 kDa和46 kDa[15]；Crispinus等從綠色木霉 Trichoderma viride中純化幾丁質(zhì)酶最適 pH為 3.5，pH值在3.5~6.0范圍內(nèi)，酶的活性較為穩(wěn)定[16]。這些差異的產(chǎn)生，可能與因不同來(lái)源所產(chǎn)酶的性質(zhì)有所不同，也可能與分離純化條件不盡相同等相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，幾丁質(zhì)酶的最適 pH與所用底物的分子量有關(guān)，如以羥乙基幾丁質(zhì)為底物的酶的最適pH為4.0左右，以GlcNAc5為底物的酶的最適pH為10.0左右。實(shí)驗(yàn)中酶的最適溫度為 45℃，Babiker等[18]報(bào)道54 kDa和65 kDa的幾丁質(zhì)酶的最適溫度分別為20℃和30℃。因此，同工酶中分子量越大的幾丁質(zhì)酶在高溫下越穩(wěn)定。金屬離子對(duì)酶的活力起到了促進(jìn)或抑制的作用，如 Cu2+對(duì)酶的抑制作用明顯，這主要是因?yàn)?Cu2+能直接作用于酶活性位點(diǎn)中的組氨酸，與巰基形成復(fù)合物并能與咪唑環(huán)結(jié)合[19]。

本實(shí)驗(yàn)確定了蠶蛹提取液硫酸銨分級(jí)沉淀的范圍，達(dá)到了濃縮與初步純化幾丁質(zhì)酶的目的，為進(jìn)一步使用凝膠層析純化該酶打下了基礎(chǔ)。幾丁質(zhì)酶從粗酶液到最后純化產(chǎn)物共純化了 6.253倍，回收率為8.1%?；盍^低可能是由于粗酶中不同亞型的協(xié)同作用，也可能是在純化過(guò)程中Sephadex G-150凝膠過(guò)濾層析一步中損失較多。

以上關(guān)于昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的分離純化及其特性的研究結(jié)果，為利用該酶進(jìn)行生物防治以及以此酶為靶標(biāo)進(jìn)行酶抑制劑的篩選提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)而為新型高效的生物農(nóng)藥創(chuàng)制打下基礎(chǔ)。

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Purification and characterization of a chitinase from Bombyx mori

Mingyan Liu, Hongbin Zhang, Xueqin Hu, and Qingli Wei
Department of Pharmaceutical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

Received:October 26, 2009;Accepted:January 22, 2010

Supported by:International Science & Technology Cooperation Plan of Anhui Province(No.08080703017), National Innovative Experimental Design of Hefei University of Technology(Nos.2009CXSY131, 091035945).

Corresponding author:Hongbin Zhang.Tel/Fax: +86-551-2901968; E-mail: zhb5678@163.com安徽省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(No.08080703017)，國(guó)家及合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(Nos.2009CXSY131, 091035945)資助。