牛病毒性腹瀉病毒NS3基因的序列分析、表達(dá)與抗原性鑒定

李巖，聶明非，魏偉，溫凱，賈瑩，霍慧，王君偉

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030

牛病毒性腹瀉病毒NS3基因的序列分析、表達(dá)與抗原性鑒定

李巖，聶明非，魏偉，溫凱，賈瑩，霍慧，王君偉

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030

本研究應(yīng)用套式RT-PCR方法擴(kuò)增出牛病毒性腹瀉病毒VEDEVAC株編碼NS3蛋白的基因，克隆至表達(dá)載體pET-30a(+)，并進(jìn)行測序。對(duì)瘟病毒屬病毒NS3基因進(jìn)行氨基酸差異性分析，顯示平均P-distance為0.07，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明VEDEVAC株隸屬于BVDV 1型。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌Rosetta(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)NS3重組蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析純化和尿素梯度透析后進(jìn)行反應(yīng)原性鑒定。Western blotting結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白可以與牛病毒性腹瀉病毒陽性血清反應(yīng)，并與豬瘟陽性血清有交叉反應(yīng)，ELISA結(jié)果顯示該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。所獲得的蛋白為建立針對(duì)NS3抗體的ELISA檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

牛病毒性腹瀉病毒，NS3蛋白，差異性分析，進(jìn)化樹，抗原性

Abstract:In this study, we cloned the NS3 gene from bovine viral diarrhea virus(BVDV)VEDEVAC strain.The result showed that the average P-distance of Pestivirus NS3 amino acid sequence was 0.07 and the VEDEVAC strain was classified to BVDV type 1.Using pET-30a(+)as vector andEscherichia coliRosetta(DE3)as host, we obtained purified recombinant NS3 protein by Ni-NTA affinity chromatography.Western blotting analysis demonstrated that both BVDV positive serum and classical swine fever virus(CSFV)positive serum were able to recognize the recombinant NS3 protein.Indirect-ELISA assay indicated that the protein could be used as detection antigen.

Keywords:bovine viral diarrhea virus, NS3 protein, divergence analysis, phylogenetic tree, antigenicity

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus)隸屬于黃病毒科(Flaviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)。該病毒可以造成牛只的持續(xù)性感染，并且不表現(xiàn)出顯著的癥狀，也可引發(fā)牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)，臨床表現(xiàn)為白細(xì)胞減少、黏膜糜爛潰瘍、腹瀉及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎。該病的流行已經(jīng)給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

BVDV為單股正鏈 RNA病毒，全長約 12.3~12.5 kb，除 5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)和 3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)外，由一個(gè)開放閱讀框編碼C、Erns、E1、E2四種結(jié)構(gòu)蛋白和Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B八種非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。與大多數(shù)RNA病毒相同，BVDV各毒株之間存在廣泛的基因多樣性和致病性差異。根據(jù)BVDV基因組的差異，BVDV分為BVDV 1型和BVDV 2型，根據(jù)其是否能夠產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變分為致細(xì)胞病變(CP)和非致細(xì)胞病變(NCP)兩種生物型[3-4]。

編碼NS3蛋白的基因在瘟病毒屬內(nèi)保守，行使相似的功能，在病毒增殖過程中，NS3蛋白出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，直接參與病毒蛋白的加工過程。該蛋白具有蛋白酶活性(Protease)和解旋酶活性(Helicase)。其絲氨酸蛋白酶活性及其核苷三磷酸酶/解旋酶(NTPase/helicase)活性分別位于其 N端的1/3區(qū)和C端的2/3區(qū)，二者位于NS3蛋白多肽上兩個(gè)獨(dú)立的功能結(jié)構(gòu)區(qū)。作為絲氨酸蛋白酶，NS3蛋白酶活性中心由N端的3個(gè)不連續(xù)的氨基酸殘基(His、Asp、Ser)組成，活性依賴于其蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，其活性部位主要在NS3編碼區(qū)的N端，但C端缺失也可使酶活性喪失。絲氨酸蛋白酶的關(guān)鍵催化殘基 Ser的突變可致絲氨酸蛋白酶活性喪失，但仍具有ATPase活性，前者主要負(fù)責(zé)病毒多聚蛋白的翻譯后加工，產(chǎn)生成熟的病毒蛋白，是病毒自我復(fù)制的前提條件，而NTPase/helicase則主要參與病毒RNA的復(fù)制過程[5-8]。

同時(shí)NS3蛋白具有較高的免疫原性，在病毒感染過程中，免疫系統(tǒng)的CD4+ T細(xì)胞主要識(shí)別NS3和E2兩種蛋白，并可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)該蛋白的抗體。因此檢測NS3蛋白抗體水平可以作為檢測牛病毒性腹瀉病毒感染的有效指標(biāo)之一。鑒于此，本研究擴(kuò)增VEDEVAC株NS3基因后進(jìn)行序列分析并表達(dá)完整NS3蛋白進(jìn)行了抗原性鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和血清

牛病毒性腹瀉病毒VEDEVAC株、E.coli TG1和E.coli Rosetta(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。pET-30a(+)購自Novagen公司。BVDV檢測用標(biāo)準(zhǔn)陽性參考血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。豬瘟病毒(CSFV)陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。HRP標(biāo)兔抗牛 IgG購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。HRP標(biāo)兔抗豬IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 酶、試劑

Ex Taq? DNA聚合酶、T4 DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。DNA純化試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。VRfast100病毒基因組提取試劑盒購自上海飛捷生物公司。Ni-NTA離子柱親和層析純化試劑盒購自德國QIAGEN公司。測序由上海生物工程有限公司完成。

1.1.3 引物

根據(jù) GenBank公布的 BVDV VEDEVA株(Accession No.AJ585412)，利用 Primer Premier軟件設(shè)計(jì)3條引物(表1)。NS3RT用于反轉(zhuǎn)錄獲得BVDV cDNA和擴(kuò)增NS3基因。NS3sense和NS3antisense引入限制性酶切位點(diǎn)。

表1 用于擴(kuò)增NS3基因的引物Table 1 Oligonucleotides employed to amplify NS3 coding regions

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組RNA的提取

取MDBK細(xì)胞培養(yǎng)的BVDV上清，參照RNA提取試劑盒進(jìn)行。

1.2.2 NS3基因的RT-PCR擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建

以提取得到的病毒基因組為模板，NS3RT為特異性引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。第一步PCR擴(kuò)增模板采用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，NS3sense和NS3RT為上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后進(jìn)行回收純化。第二步PCR以回收純化的片段為模板，NS3sense和NS3antisense為引物，回收目的片段以標(biāo)準(zhǔn)程序構(gòu)建表達(dá)載體pET-30a(+)-NS3。

1.2.3 瘟病毒屬NS3基因差異性分析

將GenBank中20組瘟病毒屬序列的NS3基因以正確的開放閱讀框翻譯為氨基酸后，應(yīng)用MEGA4.1軟件對(duì)序列進(jìn)行P-distance分析。

1.2.4 基于NS3部分基因的進(jìn)化樹的構(gòu)建

經(jīng)過序列對(duì)比分析后截取部分區(qū)域，應(yīng)用MEGA4.1，采用臨近法(Neighbor-joining method)，設(shè)置1000次bootstrap檢測支持度。

其中 NADL(Accession No.AJ133738)為BVDV 1a型參考序列，Osloss(Accession No.M96687)為BVDV 1b型參考序列，New York` 93(Accession No.AF502399)為BVDV 2型參考序列。

1.2.5 NS3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將提取的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌 E.coli Rosetta(DE3)，接種5 mL LB(Kan+)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600為1.0左右，加入IPTG至終濃度1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)2 h，取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液進(jìn)行表達(dá)分析。

大量表達(dá)獲得重組蛋白包涵體，將包涵體以8 mol/L尿素復(fù)溶后加入樹脂柱中，并參照QIAGEN蛋白純化手冊進(jìn)行操作，純化的蛋白進(jìn)一步進(jìn)行透析復(fù)性。

1.2.6 Western blotting檢測

將純化得到的蛋白經(jīng) SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以5%的脫脂乳4℃封閉過夜。以BVDV陽性血清(1:2000稀釋)37℃孵育2 h，HRP標(biāo)記兔抗牛IgG抗體(1:10 000稀釋)37℃孵育1 h，ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，膠片曝光，曝光后的PVDF膜以 Stripping Buffer 50℃ 洗膜 15 min，重新以5%的脫脂乳 4℃封閉過夜，以 CSFV陽性血清(1:1000稀釋)37℃孵育2 h，HRP標(biāo)記兔抗豬 IgG(1:5000血清)37℃孵育1 h，ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，膠片曝光。陰性對(duì)照為純化的pET-32a(+)空載體蛋白。

1.2.7 間接ELISA檢測

純化透析復(fù)性后的重組蛋白和 pET-32a(+)空載體蛋白經(jīng)稀釋后(50 μg/mL)每孔包被100 μL，4℃過夜，0.5% PVA+1%明膠37℃封閉2 h，每孔加入6份經(jīng)Prionics?BVDV NS3 Antibody Detection Kit檢測的BVDV NS3抗體陽性血清和4份BVDV NS3抗體陰性血清(1:2000稀釋)，室溫作用30 min。加入HRP標(biāo)記兔抗牛IgG抗體(1:10 000稀釋)，室溫作用30 min。各步驟之間用PBST洗滌4次，每次5 min。加入100 μL TMB底物顯色液室溫顯色10 min，1 mol/L 硫酸終止，酶標(biāo)儀讀取OD450。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-30a(+)-NS3重組質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)載體 pET-30a(+)-NS3用 BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切，可見雙酶切得到約為 5900 bp和2000 bp的兩個(gè)片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。陽性克隆測序并分析后證實(shí)基因插入位置、方向、讀碼框均正確。

2.2 瘟病毒屬NS3基因差異性分析

氨基酸序列的 P-distance分析為不同氨基酸數(shù)與參比氨基酸的比值，該分析表明NS3蛋白的氨基酸序列在同種但不同株病毒中差異很小，并且在瘟病毒屬病毒中也較為保守，平均P-distance為0.07，最大P-distance值僅為0.10(表2)。

圖1 重組質(zhì)粒pET-30a(+)-NS3的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-30a(+)-NS3 by enzyme digestion.M: DL2000 plusⅡ mar ker, 1:pET-30a(+)-NS3 digested withBamH I, 2: pET-30a(+)-NS3 digested withBamH I andXhoI.

表2 NS3基因差異性分析Table 2 Estimates of evolutionary divergence pestivirus

2.3 進(jìn)化樹的構(gòu)建

NS3部分基因進(jìn)化樹分析可知，VEDEVAC株與Osloss株親緣關(guān)系較近，隸屬于BVDV 1型(圖2)。

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis.Bootstrap test is shown.

2.4 重組蛋白的表達(dá)分析及純化

將含有重組質(zhì)粒 pET-30a(+)-NS3的 E.coli Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)(1 mmol/L IPTG)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，顯示誘導(dǎo)后的重組菌有一條約為80 kDa左右的特異性蛋白條帶，表達(dá)形式分析表明該蛋白以包涵體形式表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。提取的包涵體經(jīng)過Ni-NTA柱純化系統(tǒng)以pH值和咪唑濃度梯度洗脫(圖3)。

圖3 SDS-PAGE檢測NS3重組蛋白的表達(dá)Fig.3 Identification of recombinant protein by SDS-PAGE.M:protein marker; 1:E.coliRosetta(DE3)/pET-30a(+)-NS3 culture without IPTG induction; 2:E.coliRosetta(DE3)/pET-30a(+)-NS3 culture with IPTG induction; 3: purification of NS3 protein.

2.5 Western blotting檢測

Western blotting結(jié)果顯示，表達(dá)的NS3重組蛋白可以與BVDV陽性血清及CSFV陽性血清分別反應(yīng)(圖4)。

2.6 間接ELISA檢測

間接ELISA結(jié)果顯示表達(dá)的重組NS3蛋白可與BVDV NS3抗體陽性血清反應(yīng)，OD450均大于0.8，所設(shè)立的陰性血清組及空載體對(duì)照組測得的 OD450均小于0.2，說明牛病毒性腹瀉病毒陽性血清可以與所得的重組NS3蛋白發(fā)生反應(yīng)(表3)。

3 討論

本研究利用套式PCR直接獲得帶有酶切位點(diǎn)的編碼BVDV VEDEVAC株NS3蛋白的全長基因并將該基因直接克隆至 pET-30a(+)載體中進(jìn)行原核表達(dá)。序列分析表明，該蛋白的氨基酸序列在同種但不同株病毒中差異很小，并且在瘟病毒屬病毒中也較為保守，最大P-distance值僅為0.10。這種極小的差異也造成了血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)出的重組蛋白不僅可以與BVDV陽性血清反應(yīng)而且可以與同屬的CSFV陽性血清反應(yīng)。

圖4 NS3重組蛋白的Western blotting檢測Fig.4 Identification of recombinant protein by Western blotting.(A)BVDV positive serum.(B)CSFV positive serum.M: ECL protein marker; 1: negative control; 2: recombinant NS3 protein.

表3 純化的重組NS3蛋白的間接ELISA結(jié)果Table 3 I-ELISA assay using purified recombinant NS3 protein

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析是研究病毒的遺傳進(jìn)化，追蹤其發(fā)生發(fā)展規(guī)律的一種有效手段[9]，Nagai等[10]采用BVDV不同基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析比較，結(jié)果表明都能夠準(zhǔn)確反映出BVDV進(jìn)化特征。實(shí)驗(yàn)進(jìn)化樹分析采用的BVDV部分NS3基因區(qū)段，bootstrap值顯示具有較高的可信度。

在BVDV病毒感染增值過程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)的CD4+ T細(xì)胞可識(shí)別NS3蛋白，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NS3蛋白的特異性抗體，且NS3抗體持續(xù)時(shí)間較長，因此配合結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測如E2或E0蛋白，同時(shí)檢測非結(jié)構(gòu)蛋白NS3抗體水平可以作為區(qū)分滅活疫苗免疫或病毒感染的有效指標(biāo)之一。

近些年來，牛病毒性腹瀉病毒NS3基因的研究一直是牛病毒性腹瀉病毒研究的熱點(diǎn)，國內(nèi)均報(bào)道過利用大腸桿菌系統(tǒng)分段表達(dá)NS3蛋白及利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NS3蛋白。但本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了BVDV VEDEVAC株NS3全長重組蛋白。與眾多的蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成本最為低廉，尤其適合大量獲得重組蛋白，但有些基因因含有較多的大腸桿菌稀有密碼子對(duì)或疏水區(qū)而造成表達(dá)困難，本實(shí)驗(yàn)選擇含有編碼稀有密碼子對(duì)tRNA的表達(dá)宿主菌E.coli Rosetta(DE3)有利于蛋白的表達(dá)。但NS3蛋白較大，原核表達(dá)系統(tǒng)可能無法折疊出正確構(gòu)象，蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)透析復(fù)性后得到可溶性蛋白，雖然會(huì)損失一部分有效蛋白，但包涵體形式存在的蛋白較為穩(wěn)定，且易于富集，一定程度上降低了純化的難度。為了提高蛋白和Ni-NTA離子柱的結(jié)合能力，表達(dá)的重組蛋白在羧基端和氨基端各融合一個(gè)6×His標(biāo)簽，也可以防止出現(xiàn)單一融合His標(biāo)簽被蛋白包裹在內(nèi)部，不易于與Ni-NTA離子柱結(jié)合的現(xiàn)象。

ELISA方法由于其檢測快速、靈敏、成本低廉而廣泛應(yīng)用于疫病血清學(xué)檢測。很多商品化的ELISA診斷抗原是通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大量獲得。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示獲得的重組抗原可以與BVDV陽性血清反應(yīng)，序列分析表明，該區(qū)段高度保守，不易出現(xiàn)變異，可以作為檢測BVDV NS3抗體ELISA檢測方法的包被抗原，因此，可為日后建立針對(duì)NS3抗體的ELISA檢測方法奠定基礎(chǔ)。

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Sequence analysis, expression and antigenicity detection of bovine viral diarrhea virus NS3 gene

Yan Li, Mingfei Nie, Wei Wei, Kai Wen, Ying Jia, Hui Huo, and Junwei Wang
College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Received:July 8, 2009;Accepted:January 11, 2010

Supported by:The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System(No.NYCYTX-0303).

Corresponding author:Junwei Wang.Tel: +86-451-55191244; Fax: +86-451-55191672; E-mail: jwwang@neau.edu.cn現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(No.NYCYTX-0303)資助。