植物重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P1B-ATPase結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展

張玉秀，張媛雅，孫濤，柴團(tuán)耀

1 中國礦業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院研究生院生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

植物重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P1B-ATPase結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展

張玉秀1，張媛雅1，孫濤2，柴團(tuán)耀2

1 中國礦業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院研究生院生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

植物調(diào)節(jié)體內(nèi)重金屬的累積量以維持自身生存，其中，金屬陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵作用。P1B-ATPase是在生物中廣泛存在的P-ATPase中的一個(gè)亞族，也是P-ATPase多個(gè)亞族中唯一參與重金屬穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。擬南芥中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)P1B-ATPase。研究表明，P1B-ATPase在植物體內(nèi)具有維持金屬的穩(wěn)態(tài)、轉(zhuǎn)運(yùn)以及金屬解毒的功能；與金屬離子在根部區(qū)域的活化、吸收、地上部分的運(yùn)輸、貯存，以及植物對重金屬的耐受性均相關(guān)。以下綜述了 P1B-ATPase的進(jìn)化分類、結(jié)構(gòu)特征以及功能方面的最新研究進(jìn)展，并展望了其在植物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

P1B-ATPase，功能，重金屬

土壤中的金屬首先與植物的根毛接觸，通過跨膜運(yùn)載蛋白系統(tǒng)進(jìn)入根表皮細(xì)胞中。在根部金屬離子通過共質(zhì)體和質(zhì)外體兩條途徑，進(jìn)入維管系統(tǒng)，并運(yùn)輸?shù)降厣喜?，質(zhì)外體途徑主要發(fā)生在根尖。多數(shù)金屬離子是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，跨膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，經(jīng)由胞間連絲形成的共質(zhì)體系統(tǒng)內(nèi)運(yùn)輸；少數(shù)金屬離子通過質(zhì)外體途徑運(yùn)輸，進(jìn)入維管系統(tǒng)。金屬離子通過維管束到達(dá)葉片，釋放到外質(zhì)體中的金屬離子通過質(zhì)膜金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入葉片不同組織細(xì)胞中。在細(xì)胞內(nèi)的金屬離子通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和螯合蛋白在亞細(xì)胞區(qū)域重新分配，定位在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、液泡或細(xì)胞壁中，從而降低重金屬離子的毒害作用[4-5]。由此可見，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在金屬陽離子的吸收、運(yùn)輸和分配等方面起關(guān)鍵作用。金屬陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為金屬陽離子輸入蛋白和金屬陽離子輸出蛋白兩類，P1B-ATPase (P1B-type ATPase，或P1B型ATPase) 屬于金屬陽離子輸出蛋白[2]。P-ATPase (P-type ATPase) 是一種通過水解ATP跨膜運(yùn)送陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，最初曾被定義為通過水解ATP特異轉(zhuǎn)運(yùn)多種小陽離子和磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因其涉及磷酸化過程 (Phosphorylated intermediate)，所以被命名為 P-ATPase[6-7]。一般來說，植物中的P-ATPase具有高親和性的吸收和泵出重金屬的功能。推測其潛在的功能包括：細(xì)胞對質(zhì)外體中必需重金屬的吸收、細(xì)胞質(zhì)中毒性金屬的泵出以及必需金屬的區(qū)室化作用以進(jìn)行特殊的生化途徑[6]。P1B-ATPase除選擇性地運(yùn)輸必需的金屬離子(Cu+、Cu2+、Zn2+和Co2+) 外，還能轉(zhuǎn)運(yùn)一些重金屬離子 (Cu2+、Cd2+和Pb2+)，所以P1B-ATPase又稱為重金屬 ATP酶(Heavy metal transporting ATPase，HMA)[8]。又因?yàn)镻1B-ATPase含有一個(gè)保守的內(nèi)膜基序 (CPx：Cys-Pro-Cys/His/Ser) (圖1)，所以又稱為CPx-ATPase[9-10]。植物P1B-ATPase除參與金屬離子的穩(wěn)態(tài)外，還涉及在植物對重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒和富集作用等方面[1,11]。以下主要綜述植物P1B-ATPase的進(jìn)化分類、結(jié)構(gòu)、功能以及在重金屬累積植物中的作用的研究進(jìn)展。

圖1 P1B-ATPase結(jié)構(gòu)示意圖[8]Fig. 1 Topological model of a P1B-ATPase.

1 P1B-ATPase的結(jié)構(gòu)特征和分類

1.1 P1B-ATPase的廣泛分布

P1B-ATPase廣泛存在于從極端的古細(xì)菌到人類的所有生物中。P1B-ATPase運(yùn)輸Cu和Fe的功能最早在原核生物中被鑒定，如在金黃色葡萄球菌質(zhì)粒Staphylococcus aureous plasmid pI258和根瘤菌Rhizobium meliloti中，該基因敲除導(dǎo)致細(xì)菌對金屬敏感性提高。利用功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定了多種生物P1B-ATPase的功能和底物特異性。耐Cu古細(xì)菌Ferroplasma acidarmanus中Cu+-ATPase轉(zhuǎn)錄水平的提高與其 Cu耐性相關(guān)，閃爍古生球菌Archaeoglobus fulgidus含有運(yùn)輸 Cu+和 Cu2+的兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 CopA和 CopB。動(dòng)物基因組中的兩個(gè)Cu+-ATPase基因較為有名，人ATP7A和ATP7B的突變，導(dǎo)致Menkes癥和Wilson病 (肝豆?fàn)詈俗冃圆?等Cu代謝遺傳疾病[8]。P1B-ATPase基因廣泛存在于低等和高等植物中，如綠藻 Chlamydomonas reinhardtii基因組中有3個(gè)基因 (CrHMA1~3)，紅藻Cyanidioschizon merolae中存在2個(gè)基因 (CmHMA1，CmHMA2)。單子葉植物水稻Oryza sativa基因組中發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因 (OsHMA1~9)，大麥Hordei vulgaris中有10個(gè)基因 (HvHMA1-HvHMA10)[11-13]。在擬南芥中克隆出8個(gè)基因(AtHMA1~8)[12,14]，在大豆Glycine max基因組中發(fā)現(xiàn)9個(gè) (GmHMA1~GmHMA9)[15]，此外，研究者還從甘藍(lán)型油菜Brassica napus、重金屬Zn/Cd超富集植物鼠耳芥Arabidopsis haller和遏藍(lán)菜 Thlaspi caerulescens中分別克隆到了 P1B-ATPase基因BnRAN1 (HMA7)[16-17]、AhHMA4[18]和TcHMA4基因[9,19]。植物基因組中存在多個(gè)P1B-ATPase基因，其蛋白在植物的根莖葉和細(xì)胞中的葉綠體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡及質(zhì)膜上的定位均有報(bào)道 (表1)。

P1B-ATPase在細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物中均有發(fā)現(xiàn)，表明其可能參與了早期生命形式細(xì)胞質(zhì)中過渡金屬元素的解毒。隨著細(xì)胞區(qū)域化的出現(xiàn)和對多種金屬酶的需求，高等植物基因組中P1B-ATPase的數(shù)量增加，且功能也出現(xiàn)了多樣化，由單細(xì)胞外排金屬的單一功能進(jìn)化出更多特異性的功能，如木質(zhì)部微量元素的裝載以進(jìn)行長距離運(yùn)輸，而這一過程對于植物營養(yǎng)至關(guān)重要[3,8,11]。在擬南芥中存在多個(gè)P-ATPase，一個(gè)原因可能是在大約1.5億年前，在一種植物祖先中可能發(fā)生了多倍化事件和若干局部基因重復(fù)導(dǎo)致串聯(lián)基因陣列 (Tandem gene arrays) 產(chǎn)生；另外一個(gè)原因是多數(shù)擬南芥 P-ATPase可能缺乏植物中發(fā)生的選擇性拼接，而動(dòng)物可以通過同一基因的選擇性拼接獲得蛋白質(zhì)的多樣性。有趣的是，只有原核生物和具有光合作用的真核生物擁有Zn/Cd/Co/Pb P1B-ATPase，推測植物中存在的這些基因也許是原核內(nèi)共生體的水平基因轉(zhuǎn)移進(jìn)化的結(jié)果[11,19]。

1.2 P1B-ATPase的分類

由于生物體存在多個(gè)P1B-ATPase基因，為了研究結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，有必要對其進(jìn)行歸類。根據(jù)金屬底物特異性可以將P1B-ATPase分為兩個(gè)亞類：Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+P1B-ATPase (Zn 亞 類 ) 和Cu+/Ag+P1B-ATPase (Cu亞類)，其中動(dòng)物只有Cu亞類[7,11]。通過氨基酸多序列比對分析，將目前鑒定的植物P1B-ATPase分為兩個(gè)亞類，如擬南芥AtHMA1-4屬于Zn亞類，而AtHMA5-8屬于Cu亞類[7]；水稻OsHMA1-OsHMA3屬于Zn亞類，OsHMA4-OsHMA9屬于Cu亞類[13]。隨著基因克隆技術(shù)的進(jìn)步，人們在基因組中鑒定出了大量的P1B-ATPase基因序列，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生分析，用相似性尺度衡量氨基酸序列之間的親疏程度，從而可以將P1B-ATPase分成6個(gè)亞類(圖2)：亞類1 (AtHMA1)、亞類2 (AtHMA2-4)、亞類3 (AtHMA5)、亞類4 (AtHMA7)、亞類5 (AtHMA6)和亞類6 (AtHMA8)。在基因文庫中搜索了擬南芥、大豆和水稻等植物的 P1B-ATPase基因，ClustalW 聚類分析表明植物P1B-ATPase可以分為Cu亞類和Zn亞類，與上述根據(jù)底物專一性的分類方法相一致[8,11]。

表1 植物中的P1B-ATPasesTable 1 P1B-ATPases in plant

圖2 植物P1B-ATPases的分類Fig. 2 Classification of P1B-ATPases in plant. The dendrogram was constructed by ClustalW with multiple alignment, P1B-ATPases are divided into two groups: AtHMA1-4, OsHMA1-3, TcHMA4, AhHMA4 belong to Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+ ATPases and AtHMA5-8, OsHMA4-9, OlHMA3, GmHMA8 fall in Cu+/Ag+ ATPases. According to phylogenetic analysis, P1B-ATPases have 6 clusteres: cluster 1(AtHMA1 and OsHMA1); cluster 2 (AtHMA2-4, OsHMA2-3, TcHMA4 and AhHMA4); cluster 3 (AtHMA5, OsHMA4 and OsHMA5); cluster 4 (AtHMA7, OsHMA6 and OsHMA9); cluster 5 (AtHMA6, OsHMA3 and OsHMA7) and cluster 6 (AtHMA8, OlHMA8 and GmHMA8).

根據(jù)P1B-ATPase的氨基酸序列預(yù)測的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和金屬特異性，結(jié)合ClustalW聚類分析數(shù)據(jù)將其分成5個(gè)亞類：P1B-1(Cu+/Ag+)、P1B-2(Zn2+/Cd2+/Pb2+)、P1B-3(Cu2+/Cu+/Ag+)、P1B-4(Co2+) 和 P1B-5(無特異性)[8,20-21]。擬南芥HMA1屬于1B-4 亞類，HMA2-4屬于1B-2亞類，HMA5-8屬于1B-1亞類[21]。在真核生物中，只有植物含有1B-2和1B-4亞類，而人類和酵母中的P1B-ATPase均屬于1B-1亞類 (圖3)[8,19]。

從構(gòu)建的無根樹 (圖2) 中可以看出P1B-ATPase分成了 4大支，其中亞類 1 (AtHMA1) 和亞類 2 (AtHMA2-4) 屬于Zn簇，亞類3 (AtHMA5)、亞類4 (AtHMA7)、亞類5 (AtHMA6) 和亞類6 (AtHMA8)屬于Cu簇，該分類與其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)緊密相關(guān)。在擬南芥中AtHMA1-4屬于Zn簇，其序列中沒有重金屬相關(guān)調(diào)節(jié)功能域 (Heavy metal associated regulatory domain，HMA-RD)；另外，AtHMA1的N端只有聚His區(qū)，而AtHMA2和AtHMA4中發(fā)現(xiàn)有若干個(gè)CC二肽和富 His區(qū)域。AtHMA5-8屬 Cu簇的P1B-ATPase，同時(shí)也屬于 1B-1亞類，涉及在 Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中。AtHMA5和AtHMA7在N端有兩個(gè)HMA-RD，參與 Cu的穩(wěn)態(tài)作用；而 AtHMA6和AtHMA8在N端只有一個(gè)HMA-RD，位于植物葉綠體中，Cu離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與光合作用有關(guān)[8,11]。

1.3 P1B-ATPase的功能位點(diǎn)

與其他的P-ATPase相比，P1B-ATPase具有明顯的結(jié)構(gòu)特征：跨膜片段較少，ATP結(jié)合區(qū)(ATP-BD)小，N-和C-末端存在多個(gè)金屬結(jié)合域(Metal binding domain，MBD) 等[8]。P1B-ATPase中的ATP結(jié)合殘基是不保守的，例如 KGxxE/D基序是多數(shù) P-types的保守基序 (包括 KdpB，一種 P1A-ATPase)，該基序中的賴氨酸是組成 ATP結(jié)合穴 (ATP binding pocket) 的要素，而 P1B-ATPase中沒有該基序[22]。如圖1所示，P1B-ATPase (P1B-1-ATPase和P1B-2-ATPase)一般含有8個(gè)跨膜片段(TM)，而P1B-4-ATPase只有6個(gè)跨膜片段，金屬結(jié)合信號(hào)序列以及可調(diào)節(jié)的胞質(zhì)金屬結(jié)合域存在于跨膜片段上 (圖 1)，與其底物專一性和運(yùn)輸方向一致[8]。P1B-ATPase含有 3個(gè)功能域：P功能域 (Phosphorylation domain)，涉及酶的磷酸化；A功能域 (Actuator domain)，涉及能量轉(zhuǎn)導(dǎo)；N功能域 (Nucleotide-binding domain)，涉及核苷酸的結(jié)合作用，包含 ATP的結(jié)合位點(diǎn)[8,11]。A功能域位于H4和H5螺旋之間的小環(huán)上；具有P功能域和N功能域的保守的大胞質(zhì)環(huán)位于H6和H7螺旋之間；H6、H7和H8等3個(gè)螺旋上保守的氨基酸序列形成了跨膜金屬結(jié)合位點(diǎn) (Transmembrane metal binding sites，TM-MBS)；N-和C-末端含有MBD[8]。

一些P1B-ATPase的MBD上存在重金屬相關(guān)調(diào)節(jié)功能域(Heavy metal associated regulatory domain，HMA-RD)，其保守基序?yàn)?CxxC[8,11,23]。保守基序CxxC在原核生物ATPase中出現(xiàn)一個(gè)或兩個(gè)拷貝，而在真核生物ATPase可能達(dá)到6個(gè)拷貝，如WND和 MNK[19,21]。HMA-RD結(jié)合重金屬，也可能是重金屬的傳感器。擬南芥的Cu2+/Ag2+ATPase的N端發(fā)現(xiàn)了HMA-RD，HMA7有一個(gè)HMA-RD，HMA5和HMA6有兩個(gè)[7,11]；而其他HMA沒有HMA-RD，在HMA1-4中CC二肽和富His區(qū)起到與重金屬結(jié)合的作用，HMA1的N端有聚His區(qū)，在HMA2和HMA4的長C端有若干個(gè)CC二肽和富His區(qū)域，其中 HMA4的富 His區(qū)最為明顯[7-8]。真核生物Cu+-ATPase有多個(gè)拷貝的N-MBD，在體外MBD可結(jié)合單價(jià)和雙價(jià)陽離子，包括 Cu+、Cu2+、Zn2+和Cd2+；在體內(nèi)N-MBD從Cu分子伴侶獲得Cu+，其金屬特異性似乎取決于特異的N末端MBD與伴侶蛋白的靜電和疏水相互作用[8]。P1B-ATPase突變型分析表明，除去MBDs的金屬結(jié)合能力后，酶的轉(zhuǎn)換率下降；截?cái)郃TPase，完全除去N-MBDs部分后，酶的轉(zhuǎn)換率更高[24]。

圖3 P1B-ATPases系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of the P1B-ATPases.

CPx基序和 HP基序是 P1B-ATPase特有的基序[12]。位于第6跨膜域 (H6，sixth TM) 處的CPx (或xPC) 基序是金屬配位的定義元件 (x是 Cys、His或Ser)，AtHMA1的CPx位于H4。CPx基序是金屬易位位點(diǎn)，其完整性對于ATPase的功能是必需的，Cys突變會(huì)減弱酶的功能。CPx基序存在CPC、CPH、CPS、SPC、TPC和APC幾種形式，其中CPC最常見。根據(jù)H6、H7和H8這3個(gè)跨膜金屬結(jié)合位點(diǎn)上的保守氨基酸序列的不同，可將P1B-ATPase分為5個(gè)亞族。P1B-1亞族在H6上有CPC基序，H7和H8的保守殘基分別是Asn、Tyr和Met、Ser；P1B-2亞族的CPC基序也在H6上，H7和H8的保守殘基分別是Lys和Asp、Gly；P1B-3亞族在H6上是CPH基序，H7和H8的保守殘基分別是Asn、Tyr和Met、Ser；P1B-4亞族的SPC基序在H4上；P1B-5亞族目前還不清楚[8,11,21]。HP基序存在于大多數(shù)P1B-ATPase中，在其他P-ATPase中未見報(bào)道。在Wilson疾病蛋白ATP7B的N功能域上的HP基序被認(rèn)為對核苷酸配位很重要，但目前還不能確定HP基序是ATP的直接配體，還是通過與其他功能域的相互作用來調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的親和力。E. coli Znta突變體的研究表明HP基序中的組氨酸除了具有ATP配位作用，可能還具有催化功能[8,11]。

2 植物P1B-ATPase的功能

2.1 P1B-4-ATPase參與葉綠體Cu運(yùn)輸

目前，植物P1B-ATPase的結(jié)構(gòu)和功能研究主要在擬南芥中，AtHMA1屬于P1B-4-ATPase，有6個(gè)跨膜區(qū)，SPC基序代替經(jīng)典的 CPx保守序列，缺少HMA-RD，N端富含 His[8,12,23]。RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtHMA1主要在綠色組織中表達(dá)，綠色熒光蛋白(GFP) 顯示其定位于葉綠體被膜上，N端部分 His區(qū)缺失影響其金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)。純化的葉綠體被膜AtHMA1的ATPase活性受Cu的特異促進(jìn)，表明其可能參與Cu進(jìn)入葉綠體的運(yùn)輸過程。T-DNA缺失突變體hma1和AtHMA1過表達(dá)植株的表現(xiàn)型均與野生型相比無明顯改變，只是hma1突變體中的葉綠體Cu含量更低，葉綠體Cu/Zn超氧化物歧化酶活性的降低，而質(zhì)體藍(lán)素含量不變，推測AtHMA1主要是將Cu傳遞給Cu/Zn超氧化物歧化酶。另外，hma1缺失突變體表現(xiàn)出對強(qiáng)光的敏感性，表明 AtHMA1是植物在高光強(qiáng)下生長所必需的，其作用可能是在不良的光照條件下將 Cu傳遞給葉綠體蛋白或高活性酶分子[23-24]。AhHMA1在地上部的表達(dá)量高于根部，且在地上部的表達(dá)量受高 Zn濃度的誘導(dǎo)而升高[25]。AtHMA1是一種對毒胡蘿卜素敏感的 Ca2+/重金屬ATPase，可轉(zhuǎn)運(yùn)Ca，參與Cd、Zn和Co的解毒。在高濃度Zn2+下，表達(dá)缺失N端葉綠體靶信號(hào)(Chloroplast-targeting signal) 的 AtHMA1可改變酵母對 Zn2+的敏感性[26-27]。另外，也有證據(jù)顯示AtHMA1既可以轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)金屬Cu/Zn/Cd/Co[23,26-27]，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)一價(jià)金屬 Cu+[28]，如 Oscillatoria brevis的CPx-ATPase Bxa1可以由單價(jià)和雙價(jià)的重金屬誘導(dǎo)表達(dá)[29]。

2.2 P1B-1-ATPase參與Cu穩(wěn)態(tài)

P1B-1-ATPase在生物界中廣泛存在，如人類的Menkes/Wilson蛋白、酵母的 Ccc2p、擬南芥AtHMA5-8、水稻OsHMA4-9和甘藍(lán)型油菜Brassica napus 的BnRAN1都屬于P1B-1-ATPase。人ATP7A和ATP7B基因突變，可導(dǎo)致Menkes癥和Wilson病。Wilson疾病蛋白(WNDP) 使肝臟、大腦和血液中的Cu過量累積，而Menkes ATPase (MNKP) 的突變可導(dǎo)致 Cu 在腸中吸收減少[8,30]。酵母 Ccc2p (Cu2+-ATPase) 將 Cu 運(yùn) 送 到 多 銅 氧 化 酶(Multicopper oxidase) Fet3p處，F(xiàn)et3p 是高親和性Fe攝取所必需的酶，因此Ccc2蛋白在Cu和Fe的穩(wěn)態(tài)中起作用，其他真核生物如線蟲和人的P1B-ATPases 也具有同樣的作用[16,31]。

AtHMA5-8在H6的保守基序是CPC基序，N端存在HMA-RD且數(shù)量不同，氨基酸序列分析表明AtHMA5和AtHMA7同源性較高，在N端有兩個(gè)HMA-RD，而AtHMA6和AtHMA8的序列同源性較高，在N端只有一個(gè)HMA-RD。HMA5和HMA7涉及 Cu穩(wěn)態(tài)，在動(dòng)植物中均有發(fā)現(xiàn)，AtHMA6和AtHMA8則參與植物光合作用。

RT-PCR證明AtHMA5和AtHMA7主要在花和根部表達(dá)，AtHMA7在所有根組織中都很豐富，而HMA5主要在根部中柱鞘細(xì)胞表達(dá)，Cu處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)其在整個(gè)植株中特異表達(dá)。T-DNA插入AtHMA5的第二外顯子得到突變體hma5-1，插入第一內(nèi)含子得到hma5-2。hma5-1和hma5-2對Cu都非常敏感，但對其他金屬如Fe、Zn或Cd都不敏感。hma5突變體幼苗根尖在早期表現(xiàn)出波浪形 (Wave-like) 表型，之后主根生長完全被抑制，側(cè)根出現(xiàn)在根冠附近，Cu含量分析顯示在Cu過量的條件下hma5突變體根部富集的 Cu多于野生型，表明 P1B-ATPase缺失導(dǎo)致根部Cu的過量累積。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明AtHMA5金屬結(jié)合域能與擬南芥類ATX1樣Cu伴侶相互作用，推測Cu伴侶蛋白CCH對植物特異功能域具有調(diào)節(jié)作用[32]。TM-MBS對于酶的磷酸化和隨后的運(yùn)輸是必需的，然而，Cu+不能以水合的形式結(jié)合到 Cu+-ATPases上，而是結(jié)合到伴侶蛋白上。如Archaeoglobus fulgidus的Cu伴侶蛋白CopZ可將Cu+運(yùn)送到CopA(Cu+-ATPases) 的MBDs上；CopA缺失MBDs后，CopZ則把Cu+運(yùn)送到TM-MBS上[33]。在酵母中Cu是通過金屬伴侶Atx1和Ccc2的N端相互作用運(yùn)送到反面高爾基網(wǎng)上。Ccc2的N端具有雙重作用，從Atx1上獲取Cu和運(yùn)送Cu到Ccc2的其他結(jié)合域，從而激活A(yù)TPase。與原核生物同源基因不同的是Atx1不能激活缺失N端的Ccc2[34]。為什么一些轉(zhuǎn)運(yùn)需要金屬伴侶蛋白而另一些不需要？一種解釋是金屬伴侶蛋白可以克服細(xì)胞的高金屬離子螯合能力。例如ATX1的功能是通過蛋白-蛋白的相互作用將Cu運(yùn)送到HMA5和HMA7，這兩個(gè)蛋白的Cu的結(jié)合常數(shù)很低。另一種是金屬伴侶蛋白給細(xì)胞提供一種機(jī)制從而控制金屬離子供應(yīng)的特異運(yùn)輸途徑。最后，金屬伴侶蛋白能夠防止不適當(dāng)?shù)南嗷プ饔?，對這一功能的最好解釋是藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞膜上的3個(gè)P-Type ATPases可以吸收Cu(CtaA)，或排出Zn(ZiaA) 和Co(CoaT)[28]。

RAN1 (Responsive to Agonist1) 是HMA7，是從具有乙烯拮抗性、可引起乙烯三重反應(yīng)的幼苗中分離出來的基因。RT-PCR技術(shù)顯示 HMA7/RAN1與HMA5有相似的表達(dá)模式，主要在根部和花粉中表達(dá)，且受Cu誘導(dǎo)[32]。HMA7/RAN1隱性突變具有蓮座葉致死 (Rosette-lethal) 表型。擬南芥ran1-3突變體葉片上表皮細(xì)胞比野生型小，且更圓，葉片表面絨毛減少[30]。AtHMA7突變體對Cu超敏感，RAN1等位基因的功能缺失突變影響細(xì)胞延長等多個(gè)過程，而加入Cu后能部分緩解細(xì)胞延伸的抑制作用，因此說明RAN1具有運(yùn)送Cu到乙烯受體的作用，也可能是把Cu運(yùn)送給分泌途經(jīng)中的Cu蛋白分子[12]。AtHMA7/RAN1定位在高爾基體上，油菜 Brassica napus的BnRAN1和AtHMA7基因序列有88%的一致性，氨基酸序列有 91%的一致性。BnRAN1的cDNA能和酵母ccc2突變體互補(bǔ)，而Ccc2蛋白定位于分泌途徑中的后高爾基體 (Late Golgi) 或前高爾基體 (Post Golgi) 區(qū)室[35]，經(jīng)過酵母互補(bǔ)試驗(yàn)證明CCC2基因可能是一個(gè) Cu2+-ATPase[31]。因此，BnRAN1 cDNA編碼的產(chǎn)物具有Cu轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并可能位于分泌區(qū)域 (Secretory compartment)[16]。

AtHMA6曾被命名為PAA1 (P-type ATPase of Arabidopsis)，存在于植物的芽和根部，可能在綠色和非綠色質(zhì)體中都起作用[12]。AtHMA6定位在葉綠體外膜上，調(diào)節(jié)質(zhì)體Cu的輸入，是葉綠體Cu轉(zhuǎn)運(yùn)體系的關(guān)鍵部件。AtHMA6是葉綠體Cu轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵組分，主要是為質(zhì)體藍(lán)素和Cu/Zn超氧化物岐化酶提供Cu離子，可見AtHMA6對維持葉綠體銅蛋白的正常功能非常重要[12]。擬南芥有6個(gè)paa1插入突變體，其中paa1-1是發(fā)生在第8外顯子上的無義突變體，導(dǎo)致離子轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸化和ATP結(jié)合位點(diǎn)的C端區(qū)域的截短，因此paa1-1可能是缺少PAA1活性的無效等位基因；paa1-4突變體是在第15外顯子上的無義突變體，導(dǎo)致最后兩個(gè)跨膜區(qū)的缺失；paa1-3在保守GMxCxxC基序附近的金屬結(jié)合區(qū)3個(gè)氨基酸產(chǎn)生缺失；paa1-2和paa1-6在金屬結(jié)合區(qū)附近的氨基酸有所改變；paa1-5造成了第4跨膜區(qū)的極其保守的 Gly殘基的改變。6個(gè)突變體的株型都非常小，表明這些突變位點(diǎn)對PAA1的功能非常重要。Cu向基質(zhì)的運(yùn)輸由 PAA1抑制，而不是 AtHMA8 (PAA2)[36]。

PAA2和AtHMA1存在非常相似的表達(dá)模式，因此認(rèn)為這兩種酶的重要作用是可以為葉綠體光合作用中提供銅。PAA2和PAA1運(yùn)送銅到質(zhì)體藍(lán)素中。PAA2基因突變體導(dǎo)致光合作用電子傳遞受影響，其中 paa2-1 (第二外顯子的無義突變) 受到的影響比paa2-2 (第二內(nèi)含子和第三外顯子之間的核苷酸替換突變) 更嚴(yán)重[12,36]。而 paa1和 paa2雙突變幼苗致死，顯示出銅對于光合作用的重要性[36]。PAA2主要在地上部分中表達(dá)，免疫熒光標(biāo)記和膠體金免疫電鏡標(biāo)記技術(shù)證明大豆 GmHMA8定位于類囊體膜上[15]。

OsHMA9是第一個(gè)進(jìn)行功能研究的單子葉植物的 P1B-ATPase，具有輸出 Cu、Zn和 Pb的功能。OsHMA6和OsHMA9序列高度相似，但它們的表達(dá)模式不同，前者主要在葉片中表達(dá)，后者在根部強(qiáng)烈表達(dá)。Cu處理后的OsHMA9表達(dá)比OsHMA6更強(qiáng)烈。OsHMA9突變體比野生型在地上部分累積更多的Cu、Zn、Pb和Cd。GFP定位顯示OsHMA9定位于質(zhì)膜上，GUS報(bào)告基因分析證明OsHMA9主要在維管束和花藥中表達(dá)[13]。

2.3 P1B-2-ATPase參與毒性重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)

擬南芥的HMA2、HMA3和HMA4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被歸為 P1B-2-ATPase，是參與重金屬運(yùn)輸?shù)牡鞍?。AtHMA2-4在第6跨膜域處的保守基序是CPC基序，都具有CC二肽，在AtHMA2和AtHMA4的長C端有富His區(qū)域與重金屬結(jié)合。AtHMA3的N端有一個(gè)退化的 HMA-RD，由 GICCxxx代替了一般的GMxCxxC基序。AtHMA2、AtHMA3和AtHMA4具有相似的序列，似乎是在擬南芥進(jìn)化歷史過程中由復(fù)制產(chǎn)生的。AtHMA2和AtHMA3在第4染色體上串聯(lián)，而這一區(qū)域被復(fù)制在了第 2染色體上，其中含有 AtHMA4[14]。啟動(dòng)子活性研究表明 AtHMA2和AtHMA4主要在根莖葉的維管組織中表達(dá)[14,37-38]，GFP定位和蛋白質(zhì)凝膠斑點(diǎn)分析顯示AtHMA2定位在質(zhì)膜上，與AtHMA2運(yùn)輸Zn進(jìn)出細(xì)胞的功能一致，說明AtHMA2在植物中具有運(yùn)輸Zn的作用。AtHMA2在木質(zhì)部中可能具有裝載或卸載Zn的功能，在韌皮部具有從地上部向根部轉(zhuǎn)運(yùn) Zn的作用[4,14]，敲除AtHMA2導(dǎo)致植株中Zn2+濃度增加。T-DNA插入hma4突變體和hma2/ hma4雙突變體中Zn的累積降低，且hma2/ hma4雙突變體具有Zn營養(yǎng)缺乏的表型，而在施加外源Zn后，Zn缺陷表型有所改善[14]。HMA2的N端和C端結(jié)構(gòu)域可高親和性地結(jié)合Zn2＋，C端244個(gè)氨基酸缺失的突變HMA2可以拯救大部分hma2/hma4的Zn缺乏表現(xiàn)型，而GFP定位表明C端244個(gè)氨基酸缺失的HMA2部分導(dǎo)致其錯(cuò)誤地在根的中柱鞘細(xì)胞中表達(dá)；缺失 C端 121個(gè)氨基酸和21個(gè)氨基酸的突變HMA2可以拯救所有表現(xiàn)型并正確定位。N端結(jié)構(gòu)域突變的HMA2定位正常，但是不能與hma2/hma4表現(xiàn)型互補(bǔ)。表明在植物中HMA2的N端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠δ苁潜匦璧?，而C端結(jié)構(gòu)域雖然對金屬轉(zhuǎn)運(yùn)功能不是必需的，但也許包含對HMA2蛋白亞細(xì)胞定位的重要信號(hào)[39]。

AtHMA3屬于Zn/Cd/Pb/Co P1B-ATPase，其表達(dá)可與Cd/Pb敏感酵母菌株vycf1互補(bǔ)，但對Zn敏感突變型菌株vzrc1無影響。AtHMA3的mRNA主要在根部、老蓮座葉和莖葉中表達(dá)，表達(dá)水平不受Cd或Zn處理的影響。AtHMA3定位于液泡，將Cd運(yùn)進(jìn)液泡，在細(xì)胞內(nèi)具有封閉Cd的功能。與AtHMA4相比，AtHMA3的mRNA在植物中的表達(dá)非常低，在不同組織都有分布[34]。最新研究表明AtHMA3定位于液泡膜，在保衛(wèi)細(xì)胞、水孔、維管組織和根尖中表達(dá)量高。過量表達(dá)AtHMA3可增強(qiáng)植物對Cd、Co、Pb和Zn的耐性，Cd的富集量較野生型增加了2~3倍。AtHMA3可能具有封閉重金屬在液泡中的原始功能，在必需重金屬 (Zn) 和非必需重金屬(Cd、Co和Pb) 的解毒過程中具有重要作用[40]。利用擬南芥基因芯片在鼠耳芥克隆了AhHMA3，實(shí)時(shí)RT-PCR顯示AhHMA3在地上部的表達(dá)量高于根部，且Zn可誘導(dǎo)AhHMA3的表達(dá)，且在低Zn和高Zn處理下AhHMA3的表達(dá)量均高于AtHMA3[25]。

AtHMA4是植物P1B-ATPase中第一個(gè)被克隆和表征的Zn/Co/Cd/Pb P1B-ATPase，HMA4也是目前植物中研究得比較深入的基因。AtHMA4的T-DNA插入突變體對Cd和Zn濃度的升高敏感。AtHMA4在野生型酵母中的異源表達(dá)可提高其Cd抗性，還可使Zn敏感大腸桿菌 zntA突變體存活下來[3]。AtHMA4可增加酵母對Zn、Cd和Pb的抗性，并能與超敏感型酵母突變體表型互補(bǔ)。過表達(dá)AtHMA4可增加擬南芥葉片的Zn和Cd水平[32]。AtHMA4在野生型酵母和Co超敏感突變體cot1中的表達(dá)提高了酵母對Co的敏感性[41]。RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明AtHMA4在多種組織中表達(dá)，根中的表達(dá)量最高；AtHMA4在根部的表達(dá)受Zn和Mn上調(diào)，但受Cd下調(diào)。GUS定位分析表明AtHMA4主要在維管組織中表達(dá)。在正常的金屬離子水平下AtHMA4在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)[3-4,41]；EGFP熒光定位分析顯示AtHMA4位于酵母細(xì)胞的質(zhì)膜上[41]。因此，推測AtHMA4在植物中可能具有雙重功能：在Zn低于正常水平時(shí)，AtHMA4能有效地將Zn從根部共質(zhì)體泵到木質(zhì)部，為地上部提供必需元素；而在高水平的 Cd和 Zn存在時(shí)，AtHMA4將根部的Cd和Zn運(yùn)輸?shù)降厣喜炕蛲寥廊芤褐衃4]。

遏藍(lán)菜是重金屬 Zn/Cd超富集模式植物，TcHMA4序列與AtHMA4具有71%的一致性，具有長的C端有金屬結(jié)合功能區(qū)，其中包括一個(gè)長的His區(qū) (9個(gè)His殘基)、13個(gè)Cys對和許多單個(gè)的His殘基。TcHMA4蛋白在轉(zhuǎn)譯后修飾，分成60 kDa和50 kDa兩個(gè)特異性條帶[42]。TcHMA4在酵母中具有提高金屬耐性和輸出運(yùn)送不同重金屬 (Cd、Zn、Pb和Cu) 的功能[17]。Northern分析表明TcHMA4在根部強(qiáng)烈表達(dá)，而在地上部組織和器官中的表達(dá)水平很低[17]。AtHMA4在根部的表達(dá)受Zn、Mn脅迫上調(diào)，受Cd下調(diào)；而遏藍(lán)菜TcHMA4的表達(dá)受Cd脅迫上調(diào)。TcHMA4在根部的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于AtHMA4，說明HMA4涉及在Cd2+的運(yùn)輸過程中，且可能賦予植物的超富集特性[10,43]。非富集植物傾向于將重金屬封閉于根部，而超富集植物如遏藍(lán)菜則將大量的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部的葉表皮細(xì)胞中儲(chǔ)存[17]。推測TcHMA4在遏藍(lán)菜根部主要是將重金屬和微量元素從木質(zhì)部薄壁組織上載到木質(zhì)部導(dǎo)管中，以便長距離轉(zhuǎn)運(yùn)[10,17]。

鼠耳芥也是一種研究重金屬超富集機(jī)制的模式植物，其基因組編碼區(qū)與擬南芥有94%的序列同源性。AhHMA4在酵母Saccharomyces cerevisiae中的過量表達(dá)可降低細(xì)胞中的 Zn和 Cd含量，表明AhHMA4具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Zn和Cd作用[17]。GFP定位顯示AhHMA4定位在質(zhì)膜上[18]。AhHMA4在根部的轉(zhuǎn)錄水平高于AtHMA4，RNAi和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究表明在鼠耳芥中高水平的HMA4表達(dá)量是由于順式調(diào)節(jié)序列的改變和拷貝數(shù)的增加所致。在鼠耳芥中有3個(gè)AhHMA4的拷貝，相似性達(dá)99%，與AtHMA4相似性為88%，3個(gè)拷貝的表達(dá)水平相似。AhHMA4拷貝數(shù)的增加和單個(gè)AhHMA4基因的表達(dá)量增加是鼠耳芥中HMA4的表達(dá)量提高的原因。順式調(diào)節(jié)元件突變和基因拷貝數(shù)的增加可能是進(jìn)化中一個(gè)自然選擇的極端特性，因此，闡明了重金屬超富集植物的自然策略[43]。AhHMA4的高水平表達(dá)有利于提高Zn向木質(zhì)部導(dǎo)管的轉(zhuǎn)運(yùn)和地上部 Zn的超富集，另外，AhHMA4還承擔(dān)了上調(diào)根部Zn缺乏響應(yīng)基因表達(dá)的生理總開關(guān)的功能，如擬南芥中轉(zhuǎn)入鼠耳芥的HMA4基因后，與野生型相比，ZIP4和IRT3的表達(dá)量都有增加[43]。

3 展望

P-ATPase分為5個(gè)亞型，總共分為10種，在擬南芥基因組里共有45個(gè)基因編碼P-ATPase[7]，有8個(gè)基因是P1B-ATPase，約占18%。近20年來，雖然對P1B-ATPase的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、保守基序、金屬特異性、功能、進(jìn)化過程和組織細(xì)胞定位研究較多，但是仍然有很多方面不清楚。如HMA1作為轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的P1B-ATPase，為何也可以轉(zhuǎn)運(yùn)Ca？SPC基序的底物特異性為何會(huì)與其他 CPx基序有這么大的差別？HMA4可以轉(zhuǎn)運(yùn)多種重金屬，而Zn可以作為第一底物被優(yōu)先結(jié)合的機(jī)制是什么？目前克隆出來的P1B-ATPase有很多，但純化出來的蛋白質(zhì)只有TcHMA4，對于 P1B-ATPase蛋白質(zhì)水平的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。P1B-ATPase蛋白如何與重金屬離子結(jié)合和參與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制依然不清楚。P1B-ATPase在植物中廣泛分布，但目前的研究仍僅局限在擬南芥中，尤其是對重金屬超富集植物中的P1B-ATPase沒有進(jìn)行系統(tǒng)全面地研究。

鼠耳芥 AhHMA4的順式調(diào)節(jié)元件的突變和基因拷貝數(shù)的增加，是其響應(yīng)重金屬脅迫和重金屬超富集的自然策略之一。比較研究P1B-ATPase在非重金屬富集植物與超富集植物中的表達(dá)模式將是未來研究的重點(diǎn)之一，據(jù)此或許可以揭開植物富集重金屬的重要機(jī)制。對AhHMA4的研究也提示HMA4可能是鼠耳芥對 Zn吸收的關(guān)鍵基因，這對于開發(fā)Zn高累積作物具有重要意義?？梢灶A(yù)見，通過深入研究P1B-ATPase的作用機(jī)理，全面了解重金屬超富集植物累積重金屬的機(jī)制，必然會(huì)對開發(fā)和利用植物修復(fù)技術(shù)，改造農(nóng)作物品質(zhì)和治理環(huán)境污染提供技術(shù)支持。

REFERENCES

[1] Clemens S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta, 2001, 212: 475?486.

[2] Zhang YX, Chai TY. Isolation and Function of Heavy Metal Responsive Gene in Plant. Beijing: China Agriculture Press, 2006: 26?34.張玉秀, 柴團(tuán)耀. 植物重金屬調(diào)節(jié)基因的分離和功能.北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006: 26?34.

[3] Mills RF. Krijger GC, Baccarini PJ, et al. Functional expression of AtHMA4, a P1B-type ATPase of the Zn/Co/Cd/Pb subclass. Plant J, 2003, 35: 164?176.

[4] Mills RF, Francini A, Pedro SC, et al. The plant P1B-type ATPase AtHMA4 transports Zn and Cd and plays a role in detoxification of transition metals supplied at elevated levels. FEBS Lett, 2005, 579: 783?791.

[5] Clemens S, Palmgren MG, Kr?mer U. A long way ahead: understanding and engineering plant metal accumulation. Trends Plant Sci, 2002, 7(7): 309?315.

[6] Palmgren MG, Harper JF. Pumping with plant P-type ATPases. J Exp Bot, 1999, 50: 883?893.

[7] Axelsen KB, Palmgren MG. Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis. Plant Physiol, 2001, 126: 696?706.

[8] Argüello JM, Eren E, González-Guerrero M. The structure and function of heavy metal transport P1B-ATPases. Biometals, 2007, 20: 233?248.

[9] Bernard C, Roosens N, Czernic P, et al. A novel CPx-ATPase from the cadmium hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. FEBS Lett, 2004, 569: 140?148.

[10] Solioz M, Vulpe C. CPx-type ATPase that pump heavy metals. Trends Biochem Sci, 1996, 21 (7): 237?241.

[11] Williams LE, Mills RF. P1B-ATPases?an ancient family of transition metal pumps with diverse functions in plants. Trends Plant Sci, 2005, 10(10): 491?502.

[12] Puig S, Andrés-Colás N, García-Molina A. Copper and iron homeostasis in Arabidopsis: responses to metal deficiencies, interactions and biotechnological applications. Plant Cell Environ, 2007, 30: 271?290.

[13] Lee S, Kim YY, Lee Y, et al, Rice P1B-type heavy metal ATPase, OsHMA9, is a metal efflux protein. Plant Physiol, 2007, 145(3): 831?842.

[14] Hussein D, Haydon MJ，Wang Y, et al. P-type ATPase heavy metal transporters with roles in essential zinc homeostasis in Arabidopsis. Plant Cell, 2004, 16: 1327?1339.

[15] Bernal M, Testillano PS, Alfonso M, et al. Identification and subcellular localization of the soybean copper P1B-ATPase GmHMA8 transporter. J Struct Biol, 2007, 158: 46?58.

[16] Jennafer LS, Basu U, Gregory JT. Complementation of Saccharomyces cerevisiae ccc2 mutant by a putative P1B-ATPase from Brassica napus supports a coppertransporting function. FEBS Lett, 2004, 266: 218?222.

[17] Papoyan A, Kochian LV. Identification of Thlaspi caerulescen genes that may be involved in heavy metal hyperaccumulation and tolerance. characterization of a novel heavy metal transporting ATPase. Plant Physiol, 2004, 36(11): 3814?3823.

[18] Courbot M, Willems G, Motte P, et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol, 2007, 144(2): 1052?1065.

[19] Cobbett CS, Hussain D, Haydon MJ. Structual and functional relationships between type 1B heavy metal transporting P-type ATPases in Arabidopsis. New Phytologist, 2003, 159: 315?321.

[20] Hertogh BD, Lantin Anne-Catherine, Baret PV, et al. The archaeal P-type ATPases. J Bioenerg Biomembr, 2004, 36(1): 135?142.

[21] Argüello JM. Identification of ion-selectivity determinants in heavy-metal transport P1B-type ATPases. J Membrane Biol, 2003, 195: 93?108.

[22] Hall JL, Lorraine EW. Transition metal transporters in plants, a P-type ATPase importer that discriminates between essential and toxic transition metals. J Exp Bot, 2003, 54(393): 2601?2613.

[23] Seigneurin-Berny D, Gravot A, Auroy P, et al. HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions. J Biol Chem, 2006, 281(5): 2882?2892.

[24] Argüello JM, González-Guerrero M. Cu+-ATPases brake system. Structure, 2008, 16: 833?834.

[25] Becher M, Talke IN, Krall L. Cross-species microarray transcript profiling reveals high constitutive expression of metal homeostasis genes in shoots of the zinc hyperaccumulator Arabidopsis halleri. Plant J, 2004, 37: 251?268.

[26] Moreno I, Norambuena L, Maturana D, et al. AtHMA1 is a thapsigargin sensitive Ca2+/heavy metal pump. J Biol Chem, 2008, 283(15): 9633?9641.

[27] Kim YY, Choi H, Segami S. AtHMA1 contributes to the detoxification of excess Zn (II) in Arabidopsis. Plant J, 2009, 58: 737?753.

[28] Pilon M, Abdel-Ghany SE, Cohu CM, et al. Copper cofactor delivery in plant cells. Curr Opin Plant Biol, 2006, 9(3): 256?263.

[29] Liu T, Nakashima S, Shibasaka M, et al. A Novel histidinerich CPx-ATPase from the filamentous cyanobacterium Oscillatoria brevis related to multiple-heavy-metal cotolerance. J Bact, 2002, 184(18): 5027?5035.

[30] Woeste KE, Kieber JJ. A strong loss-of-function mutation in RAN1 results in constitutive activation of the ethylene response pathway as well as a rosette-lethal phenotype. Plant Cell, 2000, 12: 443?455.

[31] Hirayama T, Kieber JJ, Hirayama N, et al, Responsiveto-antagonist1, a menkes/wilson disease-related copper transporter, is required for ethylene signaling in Arabidopsis, Cell, 1999, 97: 383?393.

[32] Andrés-Colás N, Sancenón V, Rodríguez-Navarro S, et al. The Arabidopsis heavy metal P-type ATPase HMA5 interacts with metallochaperones and functions in copper detoxification of roots. Plant J, 2006, 45: 256?236.

[33] González-Guerrero M, Argüello JM. Mechanism of Cu-transporting ATPases: soluble Cu-chaperones directly transfer Cu+to transmembrane transport sites. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(16): 5992?5997.

[34] Morin I, Gudin S, Mintz E, et al. Dissecting the role of the N-terminal metal-binding domains in activating the yeast copper ATPase in vivo. FEBS J, 2009, 276(16): 4483?4495.

[35] Yuan DS, Dancis A, Klausner RD. Restriction of copper export in Saccharomyces cerevisiae to a late Golgi or post-Golgi compartment in the secretory pathway. J Biol Chem, 1997, 272: 25787?25793.

[36] Abdel-Ghany SE, Müller-Moulé P, Niyogi KK, et al. Two P-type ATPases are required for copper delivery in Arabidopsis thaliana chloroplasts. Plant Cell, 2005, 17: 1233?1251.

[37] Eren E, Kennedy DC, Maroney MJ. A novel regulatory metal binding domain is present in the C terminus of Arabidopsis Zn2+-ATPase HMA2. J Biol Chem, 2006, 281(45): 33881?33891.

[38] Eren E, Argüello JM. Arabidopsis HMA2, a divalent heavymetal-transporting PIB-type atpase, is involved in cytoplasmic Zn2+homeostasis. Plant Physiol, 2004, 136: 3712?3723.

[39] Wong CKE, Jarvis RS, Sherson SM, et al. Functional analysis of the heavy metal binding domains of the Zn/Cd-transporting ATPase, HMA2, in Arabidopsis thaliana. New Phytologist, 2009, 181: 79?88.

[40] Morel M, Crouzet J. AtHMA3, a P1B-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage in Arabidopsis. Plant Physiol, 2009, 149: 894?904.

[41] Verret F, Gravot A, Auroy P, et al. Heavy metal transport by AtHMA4 involves the N-terminal degenerated metal binding domain and the C-terminal His11stretch. FEBS Lett, 2005, 79: 1515?1522.

[42] Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M. A native Zn/Cd pumping P1B ATPase from natural overexpression in a hyperaccumulator plant. Biochem Biophys Res Comm, 2007, 363: 51?56.

[43] Hanikenne M, Talke IN, Haydon MJ. Evolution of metal hyperaccumulation required cis-regulatory changes and triplication of HMA4. Nature, 2008, 453: 391?396.

Structure and function of heavy metal transporter P1B-ATPase in plant: a review

Yuxiu Zhang1, Yuanya Zhang1, Tao Sun2, and Tuanyao Chai2
1 School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, Beijing 100083, China
2 College of Life Science, Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

The regulation of the heavy-metal accumulation in vivo for plant survival is very complex. The metal cation transporter plays key roles in the metabolic process. P1B-ATPases are the only subgroup of P-ATPases that contribute to heavy metal homeostasis presented in most organisms. Arabidopsis thaliana contains eight genes encoding P1B-ATPases. The current reports show that the functions of P1B-ATPases are involved in maintaining metal homeostasis, transporting and detoxification in plants. P1B-ATPases not only mediated metal ion mobilization and uptake in roots, but also contribute to the metal transport, storage and tolerance in shoots, especially in heavy metal hyperaccumulators. In this paper, we reviewed and discussed the evolution, classification, structure and function of P1B-ATPases in plants. HMAs-transgenic manipulation could be a feasible approach for phytoremediation and mineral nutrition fortification.

P1B-ATPase, function, heavy metal

Cu、Zn、Mn和Fe等是植物生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)金屬元素，主要作為輔酶參加多種生理過程，參與蛋白質(zhì)構(gòu)成和信號(hào)傳遞，缺乏或過量都會(huì)導(dǎo)致生物體的代謝紊亂[1-3]。重金屬如Cd、Hg、Ag和Pb離子具有極大的生物毒性，能與酶活性中心或蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合，取代金屬蛋白中的必需元素(Ca2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+)，導(dǎo)致生物大分子構(gòu)象改變、酶活性喪失以及必需元素缺乏等；此外，重金屬還能干擾物質(zhì)在細(xì)胞中的運(yùn)輸過程，并通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生自由基導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[1-2]，干擾細(xì)胞的正常代謝過程，最終引起植物生長發(fā)育受抑，甚至死亡。為了維持必需金屬離子在生理耐受極限濃度范圍內(nèi)，并減少其毒性對機(jī)體的損害，植物擁有的金屬穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，通過控制金屬離子的吸收、累積、運(yùn)輸和脫毒等過程，不僅能維持細(xì)胞區(qū)域中必需金屬離子的正常濃度，而且能把非必需金屬離子的傷害降到最低[1]。

December 10, 2009; Accepted: February 22, 2010

Supported by:National Major Special Project on New Varieties Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2009ZX08009-130B).

Yuxiu Zhang. Tel: +86-10-62331792; E-mail: zhangyuxiu@cumtb.edu.cn

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (No. 2009ZX08009-130B) 資助。