HPLC波長切換法同時(shí)測定淡竹葉中3種成分的含量

郭 妍， 郭晏華

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600)

淡竹葉為禾本科草本植物淡竹葉(Lophatherum gracile Brongn)的干燥莖葉［1］。主產(chǎn)于湖南，浙江，安徽，四川等省，是一味清心火，除煩熱，利小便的良藥，對(duì)治療熱病口渴，心煩不安，口糜舌瘡，牙齦腫痛，小便赤澀淋痛，頗有療效［2］。淡竹葉中含有大量的黃酮，內(nèi)酯，氨基酸和糖類等成分，其中的黃酮類化合物具有降脂，抗血栓，抗氧化，降糖等多種生理活性，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)測定了淡竹葉藥材中3種指標(biāo)性成分的含量［3］，并比較了不同來源藥材質(zhì)量優(yōu)劣，為臨床評(píng)價(jià)淡竹葉質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型四元泵高效液相色譜儀、SPD-10A紫外檢測器、SHB-3循環(huán)水多用真空泵、UV-4802型紫外-可見分光光度計(jì)、SHIMADZU AY220型電子分析天平、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 試藥 反式對(duì)香豆酸對(duì)照品由天津一方科技公司提供，香草酸對(duì)照品(批號(hào):110776-200402)，牡荊素(苷)(批號(hào):111687-200501)均購于中國藥品生物制品檢定所。本研究收集了15個(gè)不同來源的淡竹葉藥材，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定均為正品藥材。甲醇為色譜純，冰乙酸等均為分析純，水為重蒸餾水。其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

采用 AgiLent EcLipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱對(duì)流動(dòng)相的組成、配比、體積流量等因素進(jìn)行分析，對(duì)檢測波長進(jìn)行選擇，確定最佳色譜條件。

2.1.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣，分別以甲醇-3%冰乙酸水、乙腈-3%冰乙酸水、甲醇-0.5%磷酸水溶液等不同濃度、不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫，比較不同洗脫條件的色譜圖，選擇分離效果好，時(shí)間盡可能短的最佳色譜條件，最終確定以甲醇(A)-3%冰乙酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃。見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.1.2 檢測波長的選擇 取一定濃度的香草酸，反式對(duì)香豆酸，牡荊素對(duì)照品置U-3010型紫外分光光度計(jì)下掃描，香草酸在260 nm有最大吸收，反式對(duì)香豆酸在308 nm有最大吸收，牡荊素在331 nm有最大吸收，為兼顧3種成分在同一色譜圖上均有最大吸收，因此選用波長切換法。波長切換程序?yàn)?0 min→260 nm、30 min→308 nm、60 min→331 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取香草酸，反式對(duì)香豆酸，牡荊素對(duì)照品適量，分別置10 mL棕色量瓶中加甲醇溶解，制得濃度為0.276 mg/mL、0.223 mg/mL、0.231 mg/mL的對(duì)照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取淡竹葉藥材(過40目篩)1.5 g，加入60%乙醇60 mL(pH=3)，加熱回流2 h，過濾。濾液蒸干，加熱水15 mL，超聲使溶解，離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min。取處理好的大孔吸附樹脂［4］(AB-8)5 g裝入柱中(1 cm×24 cm)，離心液以2 BV/h流速上樣(BV為樹脂柱床體積)，靜吸附20 min。先用4 BV水沖至流出液無色，再用5 BV 20%乙醇沖洗至無色，然后用5 BV 40%乙醇沖洗至無色，最后用5 BV 60%乙醇沖洗至無色。最終收集40%和60%乙醇流出液，濃縮，用60%乙醇定容至10 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液，備用。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，在選定的色譜條件下香草酸，反式對(duì)香豆酸和牡荊素的理論塔板數(shù)均不少于10 000，各成分與其他峰的分離度分別為 4.8，1.7，3.2。見圖 1。

圖1 混合對(duì)照品(A)和樣品(B)HPLC譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取香草酸對(duì)照品貯備液0.1 mL，反式對(duì)香豆酸對(duì)照品0.5 mL，牡荊素對(duì)照品3 mL置同一棕色5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得對(duì)照品混合液。精密吸取 4，8，12，16，20 μL 注入高效液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得香草酸回歸方程為:Y=6 249.3X，r=0.999 3;反式對(duì)香豆酸回歸方程為Y=9043.7X，r=0.999 8;牡荊素回歸方程為Y=2 853.7X，r=0.999 9;結(jié)果表明:香草酸在0.022 08～0.110 4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;反式對(duì)香豆酸在0.089 2～0.446 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;牡荊素在0.554 4～2.772 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取淡竹葉藥材(1號(hào))供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，結(jié)果香草酸、反式對(duì)香豆酸和牡荊素峰面積的RSD分別為2.2%、2.1%和2.8%。結(jié)論:結(jié)果表明，本方法精密度較好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取淡竹葉藥材(1號(hào))供試品溶液在0、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，結(jié)果香草酸，反式對(duì)香豆酸和牡荊素峰面積的RSD分別為2.9%、2.0%和2.5%。結(jié)論:結(jié)果表明，樣品在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批淡竹葉藥材(1號(hào))樣品5份，按供試品制備方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣分析，結(jié)果RSD為香草酸2.9%，反式對(duì)香豆酸2.2%和牡荊素2.2%。結(jié)論:結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的藥材(1號(hào))5份，每份約0.75 g(香草酸含量0.040 17 mg/g，反式對(duì)香豆酸0.2084 mg/g，牡荊素1.532 mg/g)精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入香草酸對(duì)照品1 mL(濃度為0.0276 mg/mL)、反式對(duì)香豆酸7 mL(濃度為0.0223 mg/mL)和牡荊素(濃度為0.231 mg/mL)5 mL，照供試品溶液制備方法制備。求得平均回收率分別為100.3%、100.2%和99.0%;RSD分別為2.5%、2.2%、1.4%。結(jié)論:結(jié)果表明，本方法回收率較高。

2.6 淡竹葉藥材中香草酸，反式對(duì)香豆酸和牡荊素的含量測定

取不同來源的淡竹葉藥材粉末(過40目篩)各約1.5 g，精密稱定，制備供試品溶液，吸取各溶液10 μL，注入高效液相色譜儀。每個(gè)樣品平行測定5次，計(jì)算各成分含量平均值及RSD。結(jié)果見表2。

表2 不同來源淡竹葉中3種成分的含量

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)首次采用高效液相色譜法同時(shí)測定了淡竹葉藥材中香草酸、反式對(duì)香豆酸、牡荊素3種指標(biāo)性成分，更好地控制了藥材的質(zhì)量，并且實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高、重現(xiàn)性好，為淡竹葉藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有價(jià)值的參考。

3.2 通過對(duì)照品貯備液在200～400 nm進(jìn)行紫外波長掃描，得出各自的紫外吸收曲線，根據(jù)相應(yīng)的出峰時(shí)間確定波長切換梯度，使3種成分均在最大吸收波長測定，使測定結(jié)果更加靈敏、準(zhǔn)確。

3.3 本實(shí)驗(yàn)比較了超聲提取、水浴回流提取和索式提取的提取效果，最終確定水浴加熱回流是最佳提取方法。同時(shí)通過正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑，提取時(shí)間，溶劑用量和提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，以60%乙醇、60 mL、加熱回流2 h提取效果最好。驗(yàn)證了提取時(shí)間過長使牡荊素(苷)降解，提取含量并不高?？紤]到3種成分均偏酸性，因此加入鹽酸調(diào)pH=3，使3種成分充分游離出來，便于提取完全。

3.4 淡竹葉藥材中含較多如氨基酸，糖類等大極性成分，藥材提取液雜質(zhì)較多，直接測定會(huì)影響所測成分的分離度并且達(dá)不到基線，影響各成分的準(zhǔn)確測定，因此采用大孔吸附樹脂除雜。本實(shí)驗(yàn)考察了不同極性大孔吸附樹脂處理效果，比較各經(jīng)過處理的樣品色譜圖，最終選用AB-8大孔吸附樹脂。該樹脂能使淡竹葉藥材提取液中的雜質(zhì)除去，色譜圖各峰之間分離度較好，達(dá)到基線分離，并且使所測3種成分損失較少。本實(shí)驗(yàn)考察了該樹脂對(duì)淡竹葉藥材提取液的吸附與解析能力，確定了最佳上樣量、流速、所用洗脫溶劑乙醇的濃度梯度及洗脫溶劑體積。最終收集40%和60%乙醇流出液，經(jīng)處理測定含量。

3.5 從表2可以看出不同來源的淡竹葉3種指標(biāo)性成分含量差別很大，來自甘肅、上海、鞍山、沈陽的藥材與其他商品地的相比含量較低。這可能由于是受生長環(huán)境不同所致。因此，淡竹葉應(yīng)用于臨床之前應(yīng)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］宋秋燁，吳啟南.中藥淡竹葉的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(3):526-527.

［3］陳 泉，吳立軍，王 軍，等.中藥淡竹葉的化學(xué)成分研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，19(1):23-24.

［4］周 媛，程 凡.大孔樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附及分離純化研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(12):3009.