白藜蘆醇制備技術(shù)進(jìn)展

聞永舉， 梁愛軍， 申秀麗

(江西宜春學(xué)院，江西宜春336000)

白藜蘆醇(resveratrol)，化學(xué)名為(E)-3，4′，5 三羥基二苯乙烯，又名芪三酚，具有較強抗癌、抗菌、抗氧化、抗炎、抗過敏、降血脂等方面的藥理作用。廣泛地應(yīng)用藥品、食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域。1998年美國艾爾·敏德爾編撰《抗衰老圣典》，將白藜蘆醇列為“100種最熱門有效抗衰老物質(zhì)”之一［1］。白藜蘆醇作為一種貴重化合物，純度98%白藜蘆醇每公斤高達(dá)3 000多元，市場年需求量約100噸。當(dāng)前市場上能供應(yīng)白藜蘆醇的量約為20噸，尚有80噸的缺口，其市場前景較好。近年來，出現(xiàn)了不少白藜蘆醇制備的新方法、新技術(shù)。本文對其制備方法作一綜述，以便更好的開發(fā)利用白藜蘆醇。

白藜蘆醇制備技術(shù)通過3個途徑實現(xiàn)，分別是從天然植物中提取、利用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)白黎蘆醇及化學(xué)合成。

1 植物提取

隨著植化技術(shù)的提高及對各種植物成分的深入研究，目前至少己經(jīng)在21個科、31個屬的72種植物發(fā)現(xiàn)白黎蘆醇。許多常見的藥用植物，如決明、黎蘆、虎杖等，有的甚至是食物，如葡萄、花生。其中以虎杖、花生、葡萄中含量較為豐富，主要以反式存在。由于白藜蘆醇及白藜蘆醇苷在虎杖中含量最高，虎杖又比較便宜。目前，白藜蘆醇及白藜蘆醇苷主要是從虎杖中提取制備。

1.1 酶解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇

侯團章等將新鮮虎杖打漿，在10～50℃放置24～120 h，然后用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯經(jīng)過純化制得白藜蘆醇［2］。羅何生等將虎杖進(jìn)行乙醇提取，回收乙醇溶液，加入纖維素酶進(jìn)行酶解虎杖苷，酶解液用乙酸乙酯萃取，得白藜蘆醇粗品，經(jīng)進(jìn)一步精制得白藜蘆醇精品。其精品每1 kg虎杖可收白藜蘆醇在3.6～5.6 g［3］。劉庚貴等將虎杖用乙醇提取，減壓回收溶劑，經(jīng)虎杖專用酶45～50℃恒溫酶解4～5 d，升溫至85～100℃，維持2 min，濾渣為白藜蘆醇粗品，再用虎杖專用絮凝劑沉淀，過濾，清液經(jīng)氧化鋁層析，乙醇水重結(jié)晶即得白藜蘆醇，收率達(dá)0.6%以上［4］。蔣洪武以虎杖粉末為原料，用復(fù)合酶在恒溫下進(jìn)行酶解反應(yīng)48～72 h獲得酶解原料;再用溶劑萃取、濃縮獲得含白藜蘆醇的半成品，再經(jīng)精制即得［5］。楊慶利等利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇。提取條件溫和，極大的提高了白藜蘆醇得率，極大地降低了白藜蘆醇的生產(chǎn)成本，更適合大規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)［6］。宋欣等利用微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶粗酶液對白藜蘆醇苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，收率高，產(chǎn)物較單一，白藜蘆醇的分離提取步驟簡單［7］。

1.2 發(fā)酵或微生物轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇

曹庸等將虎杖在專用微生物15～45℃下培養(yǎng)24～48 h，使虎杖苷轉(zhuǎn)化白藜蘆醇，專用微生物為酵母+青霉素種或酵母+短小芽孢桿菌。然后用40%乙醇-烷基醇(95∶5)混合溶劑提取，減壓回收提取液，經(jīng)過柱層析，得純度大于95%白藜蘆醇和一定純度副產(chǎn)物的大黃素［8］。曹庸將虎杖粉末加入適量白藜蘆醇專用微生物作轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)化，采用40%乙醇-5%4-甲基-2-戊醇(95∶5)作為提取溶劑，真空濃縮，經(jīng)柱層析，得純度為95.1%白藜蘆醇及一定純度副產(chǎn)品大黃素［9］。修志龍等將原料粉碎，加入碳源和氮源制成種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基;接種米曲霉(Aspergillus oryzae)，通氣攪拌發(fā)酵;微波輔助提取發(fā)酵液。利用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，簡化了工藝和操作程序，縮短了生產(chǎn)周期，大大提高了白藜蘆醇的收率，降低了生產(chǎn)成本［10］。皺賢德等將虎杖在20～50℃溫浸發(fā)酵24～96 h，然后用溶劑萃取、濃縮獲得白藜蘆醇半成品［11］。游松等對虎杖藥材進(jìn)行醇提、液液萃取后，萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂和氧化鋁柱層析進(jìn)行純化;利用二步發(fā)酵法篩選白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化菌，并利用該菌對白藜蘆醇苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用TLC和HPLC法跟蹤檢測白藜蘆醇苷和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物白藜蘆醇，濾除轉(zhuǎn)化產(chǎn)物后，濾液上大孔吸附樹脂，乙醇洗脫，即得白藜蘆醇，建立了白藜蘆醇新的途徑［12］。

1.3 酸水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇

余淑嫻等采用熱水提取虎杖苷，通過酸催化水解，酸水解液上大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附純化處理，以乙醇-水作為洗脫劑，回收乙醇，經(jīng)過活性碳脫色處理。每500 g虎杖白藜蘆醇收率0.39～0.42 g，純度大于98%［13］。劉新榮等利用鹽酸水解反式白藜蘆醇苷制備反式白藜蘆醇，其酸水解溫度為55～75℃，水解產(chǎn)物經(jīng)硅膠層析分離反式白藜蘆醇。與現(xiàn)有的酶法技術(shù)相比，轉(zhuǎn)化率高為45%，水解時間短為1～3 h［14］。

1.4 有機溶劑萃取及柱色譜分離

成小飛將虎杖進(jìn)行有機溶劑提取，回收有機溶劑，加水溶解，上清液經(jīng)過乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，粗品經(jīng)水解，水解產(chǎn)物在經(jīng)氧化鋁高壓柱層析可制純度大于99%白藜蘆醇。［15］。蔡向源等將虎杖用乙醇提取，減壓回收溶劑，浸膏拌樣，經(jīng)硅膠進(jìn)行層析，經(jīng)乙醇-乙酸乙酯-石油醚在60～90℃的溫度洗脫，回收溶劑，經(jīng)乙醇重結(jié)晶，得白藜蘆醇［16］。孫狄等將虎杖用有機溶劑提取，經(jīng)萃取、濃縮、硅膠柱層析、結(jié)晶和重結(jié)晶，得到高達(dá)97%以上白藜蘆醇和白藜蘆醇苷。白藜蘆醇苷收率70%，白藜蘆醇60%［17］。韓笑等將虎杖用有機溶劑提取，經(jīng)硅膠柱層析，得到高達(dá)90%以上白藜蘆醇和70%以上白藜蘆醇苷。再經(jīng)高速逆流色譜分離，得到純度高于99%白藜蘆醇及其苷［18］。代光輝等采用乙醇提取，回收乙醇，通過乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，以纖維素作為固定相，以甲醇作為流動相，進(jìn)行層析制備。白藜蘆醇收率為0.4%［19］。張浩將虎杖經(jīng)過水浸泡后，進(jìn)行乙醇提取，回收乙醇溶液，經(jīng)過乙醇溶解除雜，活性碳吸附除雜，得白藜蘆醇［20］。

1.5 大孔吸附樹脂或聚酰胺純化白藜蘆醇苷及白藜蘆醇

趙金華等采用乙醇提取，回收乙醇，通過聚酰胺色譜柱，經(jīng)過20%乙醇除雜，30% ～60%乙醇洗脫虎杖苷，60% ～95%乙醇洗脫白藜蘆醇，并應(yīng)用工業(yè)化研究，結(jié)果較好［21］。許漢林等對 AB-8、H1020、D101、X-5 樹脂、HPD100、SP850、SP825型號樹脂進(jìn)行篩選，結(jié)果SP850樹脂飽和吸附量可達(dá)16.12 mg/g，吸附率為93.29%，以75%的乙醇為洗脫液，解吸量為77.44%，明顯優(yōu)于其他樹脂［22］。朱立賢等對聚酰胺、X-5、NKA-Ⅱ、D4006、AB-8、NKA、D4020、S-8、NKA-9、D3520、H1020、H103、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、DA-201、DM-301、DS-401、YPR-Ⅱ、D1300、CAD-45(1)、CAD-40、CAD-45(2)、DM-11、DM-130、ADS-7、ADS-8、ADS-17樹脂進(jìn)行研究，從中選出H103樹脂具有較大吸附量和解吸率。適合的上柱濃度為0.715 7 mg/mL，上柱液的pH為4.10，上柱液流速為2 BV/h。4倍樹脂床體積的80%乙醇以1 BV/h的流速進(jìn)行洗脫即可基本將白藜蘆醇完全從H103樹脂上解吸下來。再用聚酞胺柱色譜分離，最終得到高純度的白黎蘆醇和白黎蘆醇苷產(chǎn)品［23，24］。向海艷等對S-8、聚酰胺、NKA-9、NKA-II、AB-8、X-5、D-140、D101 樹脂進(jìn)行研究，結(jié)果從中篩選樹脂AB-8樹脂對白藜蘆醇苷有較好的吸附分離性能，適合于虎杖中白藜蘆醇苷的提純，經(jīng)該樹脂吸附解吸，飽和吸附量可達(dá)25.8 mg/g，解吸率達(dá)83.2%［25］。向海艷等對 S-8、聚酰胺、NKA-9、NKA-II、AB-8、X-5、D-140、D101 樹脂進(jìn)行研究。結(jié)果NKA-I樹脂對白黎蘆醇有較好的吸附分離效果，適合于虎杖中白黎蘆醇的提純，經(jīng)該樹脂吸附解吸，飽和吸附量可達(dá)31.6 mg/g，解吸率達(dá)91%［26］。瞿衛(wèi)林等對樹脂 D-101、DA-201、DB-301;ADS-8、ADS-21、ADS-F8、YWD-01B、YWD-03、YWD-04、YWD-06、YWD-09、YWD-12C、HPD-400、HPD-500、HPD-700、HPD-800、NKA-9、聚酰胺進(jìn)行研究。結(jié)果:HPD-500樹脂對白藜蘆醇的吸附量可達(dá)58.67 mg/g，解吸率為92.6%，經(jīng)大孔吸附樹脂的吸附與解吸，白藜蘆醇的含量由粗提物中9.25%提高至39.5%［27］。

1.6 采用超臨界CO2萃取

曹庸采用超臨界CO2作為萃取劑，加入無水乙醇和2-丙醇作為改性劑，萃取壓力35～25 Mpa、溫度60～40℃，解析釜壓力8～5 Mpa，溫度60～40℃，回收溶劑，經(jīng)過柱層析分離得純度95.1%白藜蘆醇［28］。

1.7 大孔吸附樹脂及高速逆流分配色譜

柳仁民等將虎杖用乙醇提取，減壓回收溶劑，上大孔吸附樹脂，先以5%乙醇除雜，然后以15%乙醇洗脫白藜蘆醇苷，20%乙醇洗脫白藜蘆醇。減壓回收醇提取液。白藜蘆醇粗提取物經(jīng)過石油醚-乙酸乙酯-水(1∶5∶5)高速逆流色譜分離純化白藜蘆醇苷;白藜蘆醇粗產(chǎn)物經(jīng)過石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶5∶4∶6)高速逆流色譜分離純化白藜蘆醇［29］。

1.8 大孔吸附樹脂-有機溶劑萃取-硅膠柱色譜

黃紀(jì)念等將干花生根粉碎后用有機溶劑提取，提取液抽濾、回收溶劑得初提物，用水加熱溶解，加入乙酸乙酯萃取，調(diào)pH值為7.0～11.0，靜置、抽濾、減壓濃縮，得到的白藜蘆醇粗提物用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，不同濃度乙醇洗脫，薄層色譜法跟蹤檢測，將收集的白藜蘆醇段洗脫液濃縮回收乙醇，得到含量35%以上的白藜蘆醇半成品，上硅膠層析柱，用不同體積比例的乙酸乙酯、氯仿進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法跟蹤檢測，收集的白藜蘆醇段洗脫液采用活性炭脫色、重結(jié)晶等方法精制得到含量98%以上的白藜蘆醇［30］。

2 化學(xué)合成法制備白藜蘆醇

侯建等以3，5-二羥基苯甲酸為原料，保護羥基后，經(jīng)原位生成的B2H6替代LiAlH4還原、氯化后，與亞磷酸三乙酯反應(yīng)生成中間體，中間體再與茴香醛進(jìn)行Wittig-Horner反應(yīng)，最后用吡啶鹽酸鹽替代BBr3脫保護白藜蘆醇，總收率為43.4%［31］。潘華君以3，5-二羥基苯甲酸為起始原料，經(jīng)與甲醇酯化，氯芐的羥基保護，氫化鋰鋁還原，三溴化磷嗅化，得到反應(yīng)中間產(chǎn)物3，5-二芐氧基溴芐，再與亞磷酸三乙酯經(jīng)過Arbuzov重排，生成3，5-二芐氧基節(jié)磷酸二乙酯，再與4′-甲氧基苯甲醛經(jīng)Wittig-Horner縮合反應(yīng)得到3，5-二芐氧基-4′-甲氧基-(E)-二苯乙烯，再以BBr3/CH2Cl2脫去保護基團等七步反應(yīng)成功合成了單一反式結(jié)構(gòu)的-(E)-白黎蘆醇，總收率45.4%［32］。鄒永等通過3，5-二甲氧基苯甲醛與對甲氧基苯乙腈在醇鈉催化下發(fā)生縮合反應(yīng)，形成二苯乙烯骨架結(jié)構(gòu)，經(jīng)水解反應(yīng)、脫羧反應(yīng)，得到順和反式-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯混合物，然后分離或異構(gòu)化得到順或反式3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯，最后通過脫甲基反應(yīng)得到順式白藜蘆醇或反式白藜蘆醇［33］。晏日安等將HBr氣體通入對甲氧基芐醇的苯溶液中，反應(yīng)制得對甲氧基芐基溴;所得對甲氧基芐基溴與亞磷酸三乙酯混反應(yīng)，制得對甲氧基芐基磷酸二乙酯;所得對甲氧基芐基磷酸二乙酯與氨基鈉、3，5-二甲氧基苯甲醛反應(yīng)，得(E)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯;(E)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯與AlI3得白藜蘆醇［34］。王文峰等以3，5-二甲氧基芐溴與金屬鎂反應(yīng)生成格式試劑3，5-二甲氧基芐溴化鎂，3，5-二甲氧基芐溴化鎂與茴香醛進(jìn)行親核加成反應(yīng)生成 3，5，4′-三甲氧基二苯乙醇，3，5，4′-三甲氧基二苯乙醇脫水生成 3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯 3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯脫甲基得到白藜蘆醇［35］。陳新以3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯為原料，以三甲苯為溶劑，氫醌為抗氧化劑，用三氯化鋁/吡啶為催化劑的去甲基工藝合成白藜蘆醇，同時采用市售便宜的對甲氧基氯芐與3，5-二甲氧基苯甲醛進(jìn)行Wittig反應(yīng)，制備中間體 3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯［36］。龔祝南等以3，5-甲氧基苯甲醇在DMF-三乙胺混合溶劑中進(jìn)行氯代反應(yīng)后得到3，5-甲氧基氯芐，經(jīng)過與亞磷酸三乙酯反應(yīng)后得到3，5-甲氧基芐基磷酸二乙酯，反應(yīng)產(chǎn)物與大茴香醛進(jìn)行Witting反應(yīng)后得到3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯，在 N-甲基苯胺與三氯化鋁的催化下脫甲氧基反應(yīng)生成反式白藜蘆醇［37］。都建立等以3，5-二甲氧基苯甲醛為起始原料，在無水三氯化鋁的作用下經(jīng)脫甲基反應(yīng)得到3，5-二羥基苯甲醛，然后與對羥基苯乙酸在乙酸酐和三乙胺的作用下發(fā)生Perkin 縮合得到(E)-2-(4′-羥基苯基)-3-(3′，5′-二羥基苯基)丙烯酸，最后經(jīng)同步的脫羧-異構(gòu)化反應(yīng)得到目標(biāo)化合物白藜蘆醇，總收率41.9%。在合成過程中，羥基無需保護和去保護、無需昂貴的脫甲基試劑，且脫羧和異構(gòu)化一步完成，僅3步反應(yīng)就成功合成了白藜蘆醇［38］。

3 生物工程

尉亞輝將含有白藜蘆醇植物體材料通過愈傷組織誘導(dǎo)、單細(xì)胞分離、高產(chǎn)細(xì)胞株的誘導(dǎo)篩選、擴大培養(yǎng)及大量細(xì)胞的生產(chǎn)培養(yǎng)，最終得到含有白藜蘆醇的細(xì)胞產(chǎn)品［39］。其工藝路線為材料外植體，經(jīng)誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生單細(xì)胞，對單細(xì)胞進(jìn)行分離，篩選出高產(chǎn)細(xì)胞株，再經(jīng)細(xì)胞固體培養(yǎng)，得到大量克隆細(xì)胞;或高產(chǎn)細(xì)胞株經(jīng)分離獲得高產(chǎn)單細(xì)胞，高產(chǎn)單細(xì)胞再經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，即可得到大量克隆細(xì)胞。最后對克隆細(xì)胞進(jìn)行提取，分離，可以得到白藜蘆醇。以實例說明該生物工程技術(shù):(1)材料外植體:篩選成熟的葡萄果穗，在流水中沖洗4 h后，用雙氧水浸泡10 min，用無菌水沖洗。配制MS或B5固體培養(yǎng)基附加10 ml/L葡萄汁，0.6 mg/L的NAA、4.5 mg/L的6-BA，分裝滅菌。(2)誘導(dǎo)愈傷組織:將葡萄材料切成0.5 cm大小的塊，滅菌后接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)36 h，然后光照下培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織。3周后分割愈傷組織，并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基傷繼續(xù)培養(yǎng)。繼代繁殖每2～3周進(jìn)行一次。(3)獲取單細(xì)胞:取10 g新鮮幼嫩的愈傷組織，置入100 mL培養(yǎng)液中，經(jīng)25℃黑暗14 h。低速攪拌6 min，用100目尼龍網(wǎng)過濾，經(jīng)清洗后得到分離的單細(xì)胞。(4)高產(chǎn)細(xì)胞的篩選:將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，其培養(yǎng)基內(nèi)增加三氯化鋁1 mg/L和半乳糖二酸300 mg/L的誘導(dǎo)劑，再通過物理和化學(xué)手段對其進(jìn)行誘變，篩選出白藜蘆醇含量高的細(xì)胞株。經(jīng)分離后再進(jìn)行誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)，重復(fù)2～5次，最終確定高產(chǎn)細(xì)胞株。(5)細(xì)胞固體培養(yǎng):高產(chǎn)細(xì)胞株分割多塊，轉(zhuǎn)移含有誘導(dǎo)劑的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴大培養(yǎng)，3～5周為一個周期，可以不斷重復(fù)擴大。(6)大量克隆細(xì)胞:將擴大培養(yǎng)細(xì)胞團分割，轉(zhuǎn)移至含有誘導(dǎo)劑的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行大量細(xì)胞的生產(chǎn)，其培養(yǎng)基內(nèi)NAA的含量為4 mg/L、6-BA的含量為2 mg/L;經(jīng)30℃條件下培養(yǎng)3～5周，收集細(xì)胞團為細(xì)胞產(chǎn)品，可用于白藜蘆醇的提取或直接制成產(chǎn)品。

4 討論

白藜蘆醇通過化學(xué)合成，每公斤成本3 000多元，合成過程產(chǎn)生較多廢渣、廢液，對環(huán)境多有污染，這方面還有待于進(jìn)一步的研究。虎杖中白藜蘆醇苷含量可高達(dá)3%，我國大部分地區(qū)均產(chǎn)虎杖，虎杖資源非常豐富?；⒄溶胀耆D(zhuǎn)化白藜蘆醇比例為1∶0.57。因此，國內(nèi)多對虎杖進(jìn)行酶解，使白藜蘆醇苷酶解白藜蘆醇。然后再進(jìn)行分離提純?；⒄戎泻卸喾N酶，在白藜蘆醇苷酶解白藜蘆醇時，其他苷類也被酶解成苷元。由于白藜蘆醇苷遠(yuǎn)較白藜蘆醇穩(wěn)定，而且酶解之后產(chǎn)物較為復(fù)雜，分離成本偏高。白藜蘆醇苷極性較大，很容易通過樹脂或聚酰胺分離出純品，能否對白藜蘆醇苷純品進(jìn)行酶解或轉(zhuǎn)化，這方面的文獻(xiàn)報道很少，不失為研究的一個方向。其次，白藜蘆醇或白藜蘆醇苷的提取純化有傳統(tǒng)的溶劑萃取，將逐漸被樹脂、聚酰胺富集、純化所代替，而且出現(xiàn)了樹脂-樹脂或樹脂-聚酰胺串聯(lián)富集白藜蘆醇苷，其分離純化效果更好。相比單一樹脂純化，樹脂-樹脂串聯(lián)富集文獻(xiàn)少，而且公開技術(shù)參數(shù)不全，這方面也需要進(jìn)一步研究。

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