單鈉尿酸鹽晶體在不同pH值環(huán)境中的形態(tài)變化與意義*

蘇厚恒 ,孫 欣,崔佳佳，3 ,李光文

(1. 青島市市立醫(yī)院免疫風(fēng)濕科, 山東 青島 266071; 2.青島大學(xué),山東 青島 266003; 3.泰山醫(yī)學(xué)院,山東 泰安 271000)

痛風(fēng)(Gout)是臨床常見(jiàn)的代謝相關(guān)性風(fēng)濕病, 痛風(fēng)發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì)是組織中的沉積單鈉尿酸鹽晶體(monosodium urate)，從而造成一組臨床癥候群，包括多種組織和器官中出現(xiàn)尿酸鈉晶體析出誘導(dǎo)的急慢性炎癥，如痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病、痛風(fēng)結(jié)石等。正常體內(nèi)尿酸池平均為1200 mg，每天產(chǎn)生750 mg，排出500～1000 mg。在正常情況下，約2/3經(jīng)腎臟排泄。長(zhǎng)期以來(lái)，堿化尿液，是高尿酸血癥和痛風(fēng)的一種治療措施之一。然而，尿酸結(jié)晶在不同的pH值環(huán)境下的形態(tài)如何，在何種pH值最適合體內(nèi)尿酸排泄，對(duì)防止尿酸腎結(jié)石和痛風(fēng)結(jié)節(jié)的形成，預(yù)防痛風(fēng)發(fā)作極為重要。

1 材料與方法

1.1晶體的選擇 尿酸鹽晶體取自我院免疫風(fēng)濕科1例住院的典型痛風(fēng)患者，該患者符合美國(guó)1977年ACR痛風(fēng)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[1]，在偏振光顯微鏡下，尿酸鹽晶體在鏡下分別依其與偏振光不同的方向，顯示出亮藍(lán)色或黃色，證實(shí)了關(guān)節(jié)尿酸鹽結(jié)晶的存在[2-5](見(jiàn)圖1)。

圖1 關(guān)節(jié)液尿酸鹽晶體(×400)

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與材料 LEICA DM2500偏振光顯微鏡，德國(guó)產(chǎn)；3K30 Sigma 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)產(chǎn)；Sartorius超純水系統(tǒng)，德國(guó)產(chǎn)；Sartorius pH計(jì)，德國(guó)產(chǎn)；ZDJ-4A型自動(dòng)電位滴定儀，上海產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的處理與試劑配制

取200 μl 痛風(fēng)結(jié)節(jié)尿酸晶體于試管中，加入2 ml pH7.2 PBS緩沖液，室溫1500 r/min離心5分鐘，棄上清雜質(zhì)，粗純化處理。偏振光顯微鏡驗(yàn)證沉淀物尿酸結(jié)晶存在，室溫存放。

1.3.2試劑的配置

用0.2 mol/L NaH2PO4和0.2 mol/L Na2HPO4溶液，滴定儀調(diào)整，配制pH值分別為5.5、5.7、6.1、6.5、7.2、7.6、8.0不同pH的7組PBS緩沖液，并用電子pH計(jì)標(biāo)定緩沖液的pH值，室溫存放，備用。

1.4晶體檢測(cè)

1.4.1將粗純化的晶體200 μl加入pH值5.5的PBS2 ml，混勻，置于37℃恒溫水浴箱30分鐘，取出后即刻各吸取混懸液200 μl滴片，蓋蓋玻片，偏振光顯微鏡下觀察[2,3]。尿酸鹽晶體在鏡下分別依其與偏振光不同的方向，顯示出亮藍(lán)色或黃色，證實(shí)晶體存在，并觀察晶體此時(shí)×100、×200和×400的不同放大倍數(shù)，尿酸晶體在偏振光顯微鏡下的形態(tài)。應(yīng)用Leica Application Suite軟件采圖，保存。樣本室溫1500 r/min離心5分鐘，棄上清，晶體沉渣備用。

1.4.2將配備的不同pH 值PBS緩沖液，從酸到堿分次加入每次留置的晶體沉渣中，如上同樣的方法，觀察晶體并采圖。

1.5應(yīng)用Leica Application Suite軟件分析采集圖片，對(duì)每一pH值環(huán)境下，在×400視野的鏡下，選擇3～5個(gè)視野；在每一視野中，選擇10～20個(gè)晶體，觀察到晶體形態(tài)，并對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1尿酸鹽晶體在pH值為5.5、5.7、6.1 PBS緩沖液中的形態(tài) 在pH值為5.5、5.7、6.1的PBS緩沖液中，部分尿酸鹽晶體有明顯的聚集現(xiàn)象(如圖2,3,4)。

2.2尿酸鹽晶體在pH值為6.5、7.2、7.5、8.0 PBS緩沖液中形態(tài) 尿酸鹽晶體在pH值為6.5、7.2、7.5、8.0 PBS緩沖液中，尿酸鹽晶體聚集現(xiàn)象消失，晶體分散在液體中，隨著pH值的提高，尿酸鹽晶體長(zhǎng)度不斷縮短，晶體在視野中的數(shù)量不斷減少(如圖5,6,7,8)。

圖2 尿酸鹽晶體在pH值為5.5 PBS緩沖液中的聚集現(xiàn)象

圖3 尿酸鹽晶體在pH值為5.7 PBS緩沖液中的聚集現(xiàn)象

圖4 尿酸鹽晶體在pH值為6.1 PBS緩沖液中的聚集現(xiàn)象

圖5 尿酸鹽晶體在pH值為6.5 PBS緩沖液中形態(tài)

圖6 尿酸鹽晶體在pH值為7.2 PBS緩沖液中形態(tài)

圖7 尿酸鹽晶體在pH值為7.6 PBS緩沖液中形態(tài)

圖8 尿酸鹽晶體在pH值為8.0 PBS緩沖液中形態(tài)

2.3偏振光顯微鏡下晶體性形態(tài)分析 在pH值為5.5、5.7、6.1的PBS緩沖液中，部分尿酸鹽晶體有明顯的聚集現(xiàn)象。用Application Suite軟件，在×400視野的鏡下，對(duì)在pH值為6.5、7.2、7.6、8.0 PBS緩沖液中的晶體計(jì)數(shù)并測(cè)量長(zhǎng)度，觀察到尿酸鹽晶體在趨于堿性和弱堿性的不同PBS緩沖液中，數(shù)量逐漸減少，其形態(tài)雖然呈針狀，但有所變化，隨著pH值升高，晶體的長(zhǎng)度逐漸縮短。PBS緩沖液在pH值6.5時(shí)，晶體長(zhǎng)度平均34.22±9.29微米，PBS緩沖液在pH值7.2時(shí)，晶體長(zhǎng)度平均為13.36±6.24微米，PBS緩沖液在pH值7.6時(shí)，晶體長(zhǎng)度平均為9.24±1.38微米，PBS緩沖液在pH值8.0時(shí)，晶體長(zhǎng)度平均為2.61±0.44微米。在此四個(gè)pH值的PBS緩沖液環(huán)境中，未見(jiàn)到尿酸鹽晶體聚集現(xiàn)象。4組之間通過(guò)方差分析(SPSS軟件)，尿酸晶體長(zhǎng)度在pH6.5與pH7.2、7.6、8.0有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);pH7.2與pH7.6無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);pH7.2與pH8.0有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；pH7.6與pH8.0有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3 討 論

痛風(fēng)是一種嘌呤代謝異常所致的疾病，其關(guān)鍵物質(zhì)是高濃度的血尿酸。常以高尿酸血癥及由此引起的反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎為突出臨床特點(diǎn)。同時(shí)會(huì)形成關(guān)節(jié)周?chē)蚱渌课坏耐达L(fēng)石或痛風(fēng)結(jié)節(jié)，造成關(guān)節(jié)破壞或關(guān)節(jié)畸形。除高尿酸血癥的痛風(fēng)患者對(duì)心血管系統(tǒng)有一定影響外，在腎臟可引起尿酸結(jié)石及腎損害。由于身體中90%的排泄尿酸由腎臟排出，尤其是痛風(fēng)患者伴尿中高尿酸排泄和腎結(jié)石的患者，對(duì)腎臟損傷更為嚴(yán)重。

在痛風(fēng)治療期，每日足夠的飲水量和尿量對(duì)尿酸的排泄是重要的。但尿酸是一種弱酸物質(zhì)，常以晶體狀態(tài)存在于體液中；當(dāng)在酸性環(huán)境時(shí)，尿酸鹽易聚集或形成結(jié)石。怎樣的pH 值體液環(huán)境才能夠在保持不影響人體生理的狀態(tài)下，既能阻止尿酸結(jié)石的形成，同時(shí)又能使尿酸充分排泄，對(duì)減輕尿酸對(duì)人體的損害是非常重要的[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尿酸結(jié)晶在酸性環(huán)境中不但呈針狀，而且易凝聚；隨pH值增高到6.5～7.6時(shí)，晶體體積逐漸變小，并分散在液體中；當(dāng)pH值升高至8.0 時(shí)，晶體體積進(jìn)一步變小至顆粒狀，甚至溶解。由此提示，當(dāng)提高尿液pH值為7.0時(shí)，既可基本保持腎臟的生理環(huán)境，又能促進(jìn)尿酸鹽結(jié)晶的分散，對(duì)腎臟的尿酸排泄，防止和減輕尿酸腎結(jié)石的形成具有極其重要的臨床意義。

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