局部用雷帕霉素聚乳酸乙醇酸共聚物緩釋微球的制備及釋藥研究

[摘要]目的:介紹雷帕霉素(RAPA)聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)緩釋微球的制備方法，建立高效液相色譜法(HPLC)測定體系以檢測微球中雷帕霉素含量，檢測微球性狀并進(jìn)行體外釋藥實(shí)驗(yàn)。方法:以聚乳酸乙醇酸共聚物為載體，采用W/O/W 乳劑-擴(kuò)散溶劑揮發(fā)法制備雷帕霉素緩釋微球，掃描電鏡檢測微球外觀及微球粒徑，HPLC檢測微球載藥量、包封率及體外釋藥量。結(jié)果:所制微球光滑圓整，大小均一，平均粒徑:(121.18±27.83)μm，載藥率:(14.39 ± 1.32)%，包封率:(72.92±4.29)%，體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示1～4天有突釋，隨后平穩(wěn)釋藥至第10天累積釋藥率達(dá)80%。結(jié)論:采用制備工藝穩(wěn)定，所制微球載藥量及包封率均較高，形態(tài)完整，大小均一，體外釋藥較為平穩(wěn)并且具有明顯的緩釋作用。

[關(guān)鍵詞]雷帕霉素;緩釋;微球;PLGA

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0334-04

Preparation and in vitro release study of rapamycin in poly(lactic-co-glycolic )acid microsphere for topical administration

PEI Jiao-miao，XUE Xiao-yan，LIU Bei，XIA Wei，LUO Xiao-xing，GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the preparation technology of poly (lactide - co - glycolide) (PLGA) microspheres loaded with rapamycin (RAPA-PLGA-MS)， establish a HPLC method for content determination of rapamycin in microspheres and study powder particle characteristics and in vitro release characteristics of RAPA-PLGA-MS. Methods RAPA-PLGA-MS was prepared with PLGA as carriers by the water-in-oil-in-water(W/O/W) emulsion solvent evaporation method. Scanning electron miroscope (SEM) and HPLC were used to evaluate the micromeritic characteristics of RAPA-PLGA-MS， such as the particle size，loading efficiency， and entrapment efficiency and in vitro release characteristics.ResultsThe prepared microspheres were spherical with smooth surfaces，with an average particle size of (121.18±27.83) μm. The loading and encapsulation efficiency were (14.39±1.32)% and (72.92±4.29)% respectively. The in vitro release curve of RAPA-PLGA-MS was up to 80% in 10 days.Conclusions Rapamycin poly(lactic-co-glycolic )acid microspheres was successfully prepared and has obvious sustained release.

Key words:rapamycin;controlled release;microspheres;PLGA

隨著顯微外科技術(shù)的進(jìn)步與推廣以及抗免疫排斥藥物的研發(fā)與改良，同種異體復(fù)合組織移植在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用也有了更為廣闊的天地，但是限制其發(fā)展的瓶頸依就是免疫抑制劑全身長期應(yīng)用所帶來的毒副作用[1-2]，因此需要尋找出一種毒副作用小的治療方案。雷帕霉素是一種新型強(qiáng)效免疫抑制劑，本課題組已于2007年證實(shí)雷帕霉素(rapamycin，RAPA)局部應(yīng)用可以明顯延長大鼠異體皮瓣存活時(shí)間[3]，但是由于雷帕霉素半衰期為57～62h[4]，而急性排斥反應(yīng)往往發(fā)生于術(shù)后一個(gè)月內(nèi)，因此制備雷帕霉素聚乳酸乙醇酸共聚物(poly lactide-co-glycolide，PLGA)緩釋微球應(yīng)用于局部不僅可以降低全身的毒副作用，而且可以降低局部藥物濃度的波動(dòng)使局部長期保持有效的藥物濃度，減少給藥次數(shù)。PLGA是一種生物相容性好的可降解材料，目前已廣泛用于緩釋載體、組織工程支架材料及手術(shù)縫合線等領(lǐng)域[5]。本實(shí)驗(yàn)以PLGA為載體材料，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備雷帕霉素的PLGA緩釋微球[6]，檢測其理化特性并進(jìn)行體外釋藥實(shí)驗(yàn)。

1材料和方法

1.1 材料與設(shè)備:雷帕霉素(華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，純度>95%);乳酸-羥基乙酸共聚物物n (LA) :n ( GA) = 75 ∶25 (PLGA， sigma公司，USA);聚乙烯醇、二氯乙烷(Alfa Aesar公司，Sweden);乙腈、甲醇(色譜級，SK Chemicals，Korea);二甲基亞砜(DMSO，ACS grade，Amresco公司);冷凍干燥機(jī)(FD5-3，SIM公司，USA);HH-42快速恒溫?cái)?shù)顯水箱(常州國華電器有限公司);Mettler-Toledo電子天平(AL104，Sweden);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝生物科技股份有限公司);Waters高效液相色譜儀(alliance， 2695/2996，USA); MQS-50F01純水機(jī)(Millipore公司，USA);色譜柱Venμsil XBP-C18(5μm，4.6mm×250mm);RW.20N.n IKA機(jī)械式攪拌機(jī)(上海棱普儀器儀表有限公司);掃描電子顯微鏡(日立S-3400N，Japan);TGL-16B、TDL-5 型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 雷帕霉素微球制備:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化后的處方，采用W/O/W乳劑-擴(kuò)散溶劑揮發(fā)法制備雷帕霉素緩釋微球(Rapa-PLGA-MS)。稱取PLGA 600mg 加入到4ml二氯甲烷中，完全溶解后作為油相，取300μl 10mg/ml 雷帕霉素溶液加入油相，室溫混勻。另取1ml 2% 聚乙烯醇溶液作為內(nèi)水相，加入至油相。將上述混合溶液迅速冰浴超聲90s，形成W/O乳白色初乳。然后將初乳緩慢滴加入1%聚乙烯醇外水相溶液中， 用高速分散均質(zhì)機(jī)快速攪拌60s即得W/O/W復(fù)乳。室溫下用機(jī)械式攪拌機(jī)以1000r·min-1持續(xù)攪拌4h，直至有機(jī)相逐漸揮發(fā)完全微球固化，冷無菌三蒸水洗滌離心5次，分離微球，冷凍干燥48h，即得Rapa-PL GA-MS。

1.3 微球形態(tài)觀察及粒徑檢測:取Rapa-PL GA-MS樣品3份均勻涂布于蓋玻片，真空干燥，噴涂金粉，掃描電鏡觀察Rapa-PLGA-MS的形態(tài)。選取Rapa-PL GA-MS 6個(gè)樣本，每個(gè)樣本含微球不少于250個(gè)，同樣方法進(jìn)行掃描電鏡檢測其粒徑大小，計(jì)算微球的平均粒徑。

1.4 雷帕霉素含量測定

1.4.1 色譜條件:流動(dòng)相:乙腈/水(75/25);等度洗脫;紫外檢測波長278 nm;流速1 ml/min;柱溫40℃;樣品溫度25℃;進(jìn)樣量:20μl[6]。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取雷帕霉素對照品24mg， 置于10 ml 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到2400μg/ml 雷帕霉素對照品儲(chǔ)備液。將雷帕霉素對照品儲(chǔ)備液用乙腈逐級稀釋，分別得到24、12、6、3、1.5、0.75μg/ml 對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，進(jìn)樣并記錄色譜圖，以峰面積(AU)對溶液質(zhì)量濃度(ρ，μg/ml )作線性回歸，得到回歸方程。

1.5 精密度和回收率實(shí)驗(yàn):分別配制質(zhì)量濃度20μg/ml、5 μg/ml、1μg/ml的雷帕霉素對照品溶液，采用上述色譜條件，進(jìn)樣分析。分別在1天內(nèi)重復(fù)測定5次計(jì)算日內(nèi)精密度(intra-RSD)，連續(xù)測定3天計(jì)算精密度日間(inter-RSD)。將測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雷帕霉素含量，將計(jì)算所得值除以已知含量即得到方法回收率。

1.6 包封率與載藥率的測定:取樣品7.7mg，加入1ml乙腈，將此溶液超聲震蕩5min，渦旋混勻30min，靜置后取上清進(jìn)樣，按照1.4.1所述色譜條件進(jìn)行檢測，記錄峰面積代入線性回歸方程計(jì)算雷帕霉素的含量，并按照下式計(jì)算載藥量和包封率。

載藥率=樣品測定濃度×樣品體積/取樣質(zhì)量×100%

包封率=樣品測定濃度×樣品體積/樣品中雷帕霉素含量的理論值×100%

1.7 雷帕霉素微球體外釋藥的研究:本試驗(yàn)以pH 7.4 磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)。精密稱取Rap-PLGA-MS15 mg，用2 ml pH 7.4磷酸鹽緩沖液(含0.3%吐溫80)溶解。(37±1) ℃，100r·min-1 恒速攪拌，每天取樣1次連續(xù)取樣20天，每次取樣200μl，同時(shí)補(bǔ)加等溫、同體積的釋藥介質(zhì); 用HPLC法測定樣品濃度，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算累積釋藥率(Q，%)。

2結(jié)果

2.1 微球外觀及粒徑:所制微球形態(tài)圓整，表面光滑無破損，大小均勻。平均粒徑為:(121.18±27.83)μm。

2.2 微球中雷帕霉素含量測定方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:按照上述方法在該色譜條件下，雷帕霉素與其他物質(zhì)分離良好，理論塔板數(shù)大于60 000，最低檢測限為37.5 ng/ml。以峰面積(A)對溶液質(zhì)量濃度(ρ，μg/ml)作線性回歸，得到回歸方程:A=5.9614ρ+0.8166， r=0.9999，結(jié)果見圖2。表明雷帕霉素濃度在0.75～24μg/ml之間線性關(guān)系良好。

2.3 精密度與回收率:按照上述方法測得日內(nèi)、日間精密度均符合要求，回收率均在95%～105%內(nèi)(結(jié)果見表1、2、3)。結(jié)果顯示所采用的測量方法日內(nèi)及日間誤差小，在可控范圍之內(nèi)，以此方法進(jìn)行微球中雷帕霉素含量檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 包封率與載藥率:將3批不同時(shí)間點(diǎn)制備的微球取樣，按照上述方法測得微球的平均包封率為:(72.92±4.29)%，載藥率為:(14.39±1.32)%，結(jié)果顯示所制備微球載藥率及包封率較高。

2.5 載藥微球體外釋藥結(jié)果:體外釋藥實(shí)驗(yàn)表明微球在前4天會(huì)有突釋效應(yīng)，這與微球表面藥物釋放有關(guān)，隨后進(jìn)入緩釋階段，第10天其累計(jì)釋藥率達(dá)到80%，直至22天累計(jì)釋藥率達(dá)到95%，22天至25天的突釋與微球自身崩解有關(guān)。

3討論

同種異體復(fù)合組織移植的廣泛應(yīng)用為整形美容外科移植領(lǐng)域的發(fā)展提供了更為廣闊的空間，很大程度上解決了以往拆東墻補(bǔ)西強(qiáng)的弊端[7]，雖然手術(shù)技術(shù)方面已較為成熟，但是抗免疫排斥藥物的大劑量全身應(yīng)用所帶來的毒副作用卻常常讓整形外科醫(yī)師望而卻步[8]，如何在保證不發(fā)生急性排斥反應(yīng)的同時(shí)又盡可能降低抗免疫排斥藥物的毒副作用是當(dāng)今探討的熱點(diǎn)話題之一。雷帕霉素是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，1999年被FDA批準(zhǔn)上市，臨床上多以雷帕霉素配合環(huán)孢素或他克莫司(FK506)等進(jìn)行移植后的免疫抑制治療[9]，并且證實(shí)對急慢性排斥反應(yīng)均有良好的防治效果，但是雷帕霉素及其聯(lián)合治療所用藥物的長期全身用藥會(huì)導(dǎo)致許多毒副作用，如:肝腎毒性、高脂血癥、高膽固醇血癥、骨髓抑制等不良反應(yīng)[4，10]，這些問題對于處于免疫抑制狀態(tài)的患者來說都不容忽視，有的甚至是致命的，所以建立局部給藥方法就顯得頗有意義了。有實(shí)驗(yàn)證明雷帕霉素局部用藥加全身小劑量用藥在同種異體復(fù)合組織移植動(dòng)物模型中可以明顯延長皮瓣存活時(shí)間[3]，但是雷帕霉素半衰期約60h而急性排斥反應(yīng)可能發(fā)生在術(shù)后一個(gè)月內(nèi)，局部雷帕霉素PLGA緩釋微球給藥系統(tǒng)的建立可以使局部達(dá)到長期有效并且平穩(wěn)的藥物濃度，在減少全身用藥量及其毒副作用的同時(shí)也減少了用藥劑量及給藥次數(shù)，減輕了患者的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

PLGA是一種可生物降解的高分子聚合物，組織相容性好，已被廣泛應(yīng)用于藥物的緩控釋載體，手術(shù)縫合線、組織工程、骨科內(nèi)固定等材料。本實(shí)驗(yàn)通過W/O/W乳劑- 擴(kuò)散溶劑揮發(fā)法制備雷帕霉素PLGA微球，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)速，乳化時(shí)間，投藥比例等對微球大小有重要影響，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該制備條件是較為理想的，方法簡單，結(jié)果可靠。所得微球表面光滑圓整，形態(tài)規(guī)則，大小均一，包封率及載藥率較高，體外釋藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有明顯的緩釋效果，于10天累積釋藥率達(dá)到80%，達(dá)到預(yù)期的緩釋目標(biāo)，釋藥實(shí)驗(yàn)中土溫-80的加入明顯加速微球的釋藥速度，我們還將進(jìn)一步在大鼠體內(nèi)進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其體內(nèi)的代謝速率。

本課題的創(chuàng)新點(diǎn)在于雷帕霉素緩釋微球的成功制備給我們提供了新的給藥方法，通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)目前尚無人在此方面做過相關(guān)工作，我們可以在手術(shù)過程中我們可以在游離皮瓣縫合前于受者創(chuàng)面處均勻涂布一定劑量的雷帕霉素緩釋微球，術(shù)后可以全身給于小于常規(guī)劑量的環(huán)孢素或FK506，以期有效地減少全身給藥劑量，待皮瓣建立自身血液循環(huán)而不再依賴吻合血管供養(yǎng)后，利用吻合血管進(jìn)行灌注給藥，這樣以來為局部長期用藥提供了可能性，并且使得全身小劑量用藥變得更加安全，本課題組還將以此微球?yàn)榛A(chǔ)，進(jìn)行大鼠體內(nèi)藥物釋放實(shí)驗(yàn)，并且利用大鼠下腹部游離皮瓣模型進(jìn)一步驗(yàn)證雷帕霉素緩釋微球局部給藥系統(tǒng)的有效性和可行性。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Whitaker IS，Duggan EM，Alloway RR，et al.Composite tissue allotransplantation: a review of relevant immunological issues for plastic surgeons [J].J Plast， Reconstr Aesth Surg，2008，61:481-492.

[2]Ravindra KV，Wu S，Bozulic L，et al.Composite Tissue Transplantation: A Rapidly Advancing Field [J].Transplantation Proceedings，2008，40:1237-1248.

[3]張旭東，郭樹忠，李薈元，等.雷帕霉素局部用藥在異體復(fù)合組織移植中的應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2007，24:370.

[4]Kapila VP，Pharm D， Robert A，et al.Sirolimus (rapamycin): From the soil of Easter Island to a bright future[J].American Academy of Dermatology，2007，57:1046-1050.

[5]Hoffman AS.The origins and evolution of \"controlled\" drug delivery systems [J].J Controlled Release，2008，132:153-163.

[6]Jhunjhunwala S，Raimondi G，Thomson AW，et al.Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles [J].J Controlled Release，2009，133:191-197.

[7]Guo SZ， Han Y， Zhang XD，et al.Human facial allotransplantation:a 2-year follow-up study [J].Lancet，2008，372:631-638.

[8]Madani H，Hettiaratchy S，Clarke A，et al.Immunosuppression in an emerging field of plastic reconstructive surgery: composite tissue allotransplantation [J].J Plast Reconstr Aesth Surg，2008，61:245-249.

[9]EI-Sabrout R，Delaney V，Qadir M，et al.Sirolimus in combination with tacrolimus or mycophenolate mofetil for minimizing acute rejection risk in renal transplant recipients-A single center experience [J].Transplantation Proceedings，2003，35:89-94.

[10]Kumar RS，Peyre CG，Sher LS.Immunosuppression[J].Seminars in Anesthesia， Perioperative Medicine and Pain，2004，23:12-22.

[收稿日期]2009-11-16 [修回日期]2010-02-23

編輯/張惠娟