UVA1照射對人工皮膚分泌MMP-1影響的初步研究

[摘要]目的:探討不同UVA1劑量照射對人工皮膚分泌MMP-1的影響，明確光致人工皮膚損傷的UVA1劑量。方法:通過ELISA法檢測不同劑量的UVA1(0～90J/cm2)對人工皮膚表達(dá)MMP-1分泌的變化。結(jié)果:與0J/cm2相比，UVA1劑量為10J/cm2時MMP-1的分泌量無明顯變化(P>0.05)，當(dāng)UVA1劑量大于20J/cm2時人工皮膚分泌MMP-1的量逐漸增高(P<0.05，P<0.0001)，UVA1劑量在小于50J/cm2以前呈劑量依賴性增高，至70J/cm2以后分泌量較前有所降低。結(jié)論:引起人工皮膚光損傷的初始UVA1照射劑量為20J/cm2。

[關(guān)鍵詞]長波寬譜紫外線(UVA1);人工皮膚;基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0348-03

The preliminary study of the MMP-1 secretion in artificial skin in different dose of UVA1

SUN Su-jiao1，2，YAO Lu1，LUO Wen1，SU Shun-qin1，XU Ji-peng1，YNAG Zhi1，HE Li1

(1.Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College， Kunming 650032，Yunnan，China; 2.Department of Cosmetology， the Affiliated Hospital of Dali College， Dali671000，Yunnan， China)

Abstract:Objective To explored the different dose ofUVA1 irradiation on artificial skin secretion of MMP-1， clearly the UVA1 dose oflight-induced damage in artificial skin. MethodsThe ELISA assay was used to measure the changes of secretion of MMP-1 after different doses of UVA1 exposure(0J/cm2～90J/cm2).ResultsCompared to dose of 0J/cm2， the secretion of MMP-1 of UVA1 dose of 10J/cm2 has no significant difference(P>0.05). When the UVA1 doses greater than 20J/cm2， the secretion of MMP-1 in artificial skin was gradually increased (P<0.05， P<0.0001). The previous dose-dependent increase when UVA1 dose was less than 50J/cm2， but the secretion of MMP-1 was decreased when the dosage up to 70J/cm2.ConclusionThe results shows that the initial dose of the artificial skin photodamage caused by UVA1 radiation is 20J/cm2.

Key words:long-wave wide-spectrum ultraviolet (UVA1);artificial skin;matrix metalloproteinase -1 (MMP-1)

近年來長波寬譜紫外線UVA1(340～400nm)對皮膚的光損傷越來越受到人們的重視，因?yàn)閁VA1是紫外線中波長最長的一個波段，紫外線的波長越長對皮膚組織的穿透越深。UVA1的主要效應(yīng)部位是皮膚真皮層，真皮層主要的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP-1)與UVA引起的光損傷最為相關(guān)[1-2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人工皮膚，力求在一個模擬的更加接近正常人皮膚細(xì)胞環(huán)境的條件下，應(yīng)用對皮膚穿透力更強(qiáng)的UVA1照射人工皮膚，觀察不同UVA1照射劑量下人工皮膚損傷的情況，通過檢測MMP-1的分泌量間接反應(yīng)人工皮膚特別是真皮的損傷情況。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本來源:人工皮膚購買自陜西艾爾膚公司，產(chǎn)品編號:國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2007第3461110號。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑和材料:MMP-1ELISA試劑盒(ADL公司)，無因子角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基K-SFM(美國Gibco公司)，35mm培養(yǎng)皿(Coring 公司)。

1.2.2 儀器:SUV-1000日光紫外線模擬器和輻照計(jì)(上海Sigma公司)，酶標(biāo)儀(EL×800/Bio-tek)，CO2恒溫孵育箱(德國Sigma公司)，OLYMPUS BX-50F4顯微鏡。

1.3 方法步驟

1.3.1 紫外線照射:UVA1劑量=UVA1輻照度×?xí)r間(秒)，應(yīng)用上海SIGMA高技術(shù)有限公司UVA1輻照度監(jiān)示器標(biāo)定SUV-1000日光紫外線模擬器的輻照度。照射時培養(yǎng)皿蓋著蓋子，在計(jì)算強(qiáng)度時應(yīng)減去培養(yǎng)皿蓋衰減的強(qiáng)度。照射時每個培養(yǎng)皿加0.3mlPBS液防止組織變干，照射完畢后用PBS液清洗組織塊3次。

1.3.2ELISA法檢測MMP-1分泌量:在超凈臺內(nèi)配合不銹鋼標(biāo)尺將人工皮膚用手術(shù)刀和剪刀分割成5mm×5mm大小移入35mm培養(yǎng)皿中，UVA1照射劑量分組為0J/cm2、10J/cm2、20cm2、30J/cm2、40J/cm2、50J/cm2、70J/cm2、90J/cm2，每組設(shè)3個平行孔，照射后將皮片移入24孔板中標(biāo)號，加入K-SFM培養(yǎng)基0.5ml，至氣液界面繼續(xù)培養(yǎng)24h后行ELISA檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析:實(shí)驗(yàn)資料以(x±s)表示，采用Spss13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的Student's-t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從表1和圖1中可知，當(dāng)UVA1照射強(qiáng)度為10J/cm2時，人工皮膚分泌MMP-1與0J/cm2比較變化不明顯。隨著紫外照射強(qiáng)度的增加，人工皮膚分泌MMP-1逐漸增加，當(dāng)UVA1照射強(qiáng)度為20J/cm2時，與0J/m2比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.001)。當(dāng)UVA1照射強(qiáng)度增至70J/cm2及90J/cm2時，人工皮膚分泌MMP-1較前有所降低，但與0J/m2比較，差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

在以往光損傷的研究中，單層細(xì)胞培養(yǎng)、動物實(shí)驗(yàn)和正常人皮膚研究光損傷較為多見。但單層細(xì)胞的培養(yǎng)無法模擬機(jī)體的三維環(huán)境，特別是無法模擬光損傷時的穿透性，而動物與人由于種屬不同而存在差異，此外應(yīng)用正常人皮膚由于涉及來源和倫理問題，也較難開展。人工皮膚的出現(xiàn)為許多相關(guān)的研究開創(chuàng)了新的道路，因?yàn)樗诟蟪潭壬夏M了人體的三維環(huán)境。人工皮膚構(gòu)建工藝固定、性質(zhì)穩(wěn)定、應(yīng)用范圍廣、一致性強(qiáng)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有說服力。更重要的是人工皮膚中含有來源于人并能夠代謝的活細(xì)胞，因而能夠更好地模擬人體內(nèi)的狀態(tài)，更加真實(shí)地反應(yīng)人皮膚受到各種刺激后的反應(yīng)。

MMP-1可作為評估皮膚光損傷特別是真皮成纖維細(xì)胞光損傷的一個特異性指標(biāo)。大量的實(shí)驗(yàn)證明紫外線照射可引起成纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) 增多，特別是UVA的高穿透性使其作用部位位于真皮，成纖維細(xì)胞是其作用的主要靶細(xì)胞，UVA對成纖維細(xì)胞分泌MMPs有較大的影響[3-4]。許多證據(jù)表明在人的皮膚上，MMP-1隨年齡的增加而增加，并且與紫外線導(dǎo)致的慢性光損傷使膠原排列紊亂、斷裂等有密切關(guān)系，因此認(rèn)為MMP-1介導(dǎo)的膠原破壞的累積是皮膚老化(光損傷的重要表現(xiàn)之一)的主要原因[5-6]。Naru等[7]對以真皮成纖維細(xì)胞作為體外光老化模型的研究中，觀察到UVA1照射正常成纖維細(xì)胞后MMP-1 mRNA的表達(dá)水平與照射強(qiáng)度呈正相關(guān)。UVA1 誘導(dǎo)皮膚產(chǎn)生的ROS，通過MAPK信號傳導(dǎo)通路也可促進(jìn)MMP-1的表達(dá)，同時抑制膠原的合成[8]。Fagot D等[2]用3種體外培養(yǎng)的人工皮膚模型(僅含表皮的EPISKIN、含表皮和真皮的復(fù)合人工皮、體外培養(yǎng)的正常人皮膚)及體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫外線照射后，僅含表皮的EPISKIN和從正常人皮膚中分離出來的角質(zhì)形成細(xì)胞的 MMP-1的分泌不增加，而含表皮和真皮的復(fù)合人工皮和體外培養(yǎng)的正常人皮膚MMP-1的分泌是增加的，并且呈現(xiàn)劑量依賴，說明MMP-1可特異性表征真皮光損傷。

應(yīng)用ELISA法檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌細(xì)胞因子量的濃度和濃度變化趨勢是一種簡單可行的辦法，本實(shí)驗(yàn)主要是檢測MMP-1濃度變化的趨勢。我們的結(jié)果顯示與未照射組相比，當(dāng)UVA1的劑量在10J/cm2時，MMP-1的分泌稍有增加，但與0J/cm2組相比差異并無顯著性意義(P>0.05);自20J/cm2以后MMP-1分泌量逐漸增高，至70J/cm2和90J/cm2時MMP-1的分泌較前有所降低，我們主要是考慮大劑量的UVA1照射導(dǎo)致死亡的細(xì)胞增多，因此MMP-1的分泌下降，UVA1照射可誘導(dǎo)人工皮膚高分泌MMP-1的結(jié)果與上述許多研究的結(jié)果相符。在劑量方面細(xì)胞實(shí)驗(yàn)多數(shù)使用2～10J/cm2的UVA就可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分泌MMP-1的值增高，Pascual-Le等[9]用單獨(dú)的真皮替代物照射紫外線UVA時，使用10J/cm2的照射劑量就可使成纖維細(xì)胞分泌MMP-1增高，我們得出的結(jié)果偏高，考慮我們使用的是包含了表皮和真皮三維培養(yǎng)的人工皮膚，紫外線穿透表皮時需要損耗一定的劑量，另外我們使用的是波長較長的UVA1，研究認(rèn)為波長越大的紫外線效能越小，需要使皮膚損傷的劑量就越大[10]，從這個角度上說，我們的結(jié)果也符合理這個規(guī)律。從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出，與未照射組相比，UVA1照射劑量自20J/cm2后對人工皮膚MMP-1分泌就有顯著性的影響，說明在該劑量后人工皮膚就出現(xiàn)了光損傷;在照射劑量為50J/cm2以前MMP-1的分泌量呈現(xiàn)劑量依賴性，之后有所下降，說明50J/cm2以后光損傷較嚴(yán)重，這為我們下一步應(yīng)用人工皮膚研究光損傷時選擇合適的照射劑量奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Fisher GJ， Datta SC， Talwar HS，et al. Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism[J].Nature，1996，379(6563):335-339.

[2]Fagot D，Asselineau D，Bernerd F.Matrix metalloproteinase-1 production observed after solar-simulated radiation exposure is assumed by dermal fibroblasts but involves a paracrine activation through epidermal keratinocytes[J]. Photochem Photobiol，2004，79(6): 499-505.

[3]Hyeon HK，Chung MS，Chi HP，et al.Eicosapentaenoic acid inhibits UV induced MMP-1 expressing in human dermal fibroblast[J]. J Lipid Res，2005，46(8):1712-1720.

[4]Grant GM，Cobb JK，Castillo B，et al. Regulation of matrixmetal loproteinases following celluar transformation[J].J Cell Physiol，1996，167(1):177-183.

[5]Varani J，Warner RL，Gharaee-Kermani M，et al. Vitamin A antagonizes decreased cell growth and elevated collagen-degrading matrix metalloproteinases and stimulates collagen accumulation in naturally aged human skin[J]. J Invest Dermatol，2000，114(3):480-486.

[6]Wang F， Garza LA， Kang S，et al. In vivo stimulation of de novo collagen production caused by cross-linked hyaluronic acid dermal filler injections in photodamaged human skin[J]. Arch Dermatol，2007，143(2):155-163.

[7]Naru E，Suzuki T，Moriyama M，et al. Functional channgs induced by chronic UVA irradiation to cultured human dermal fibroblasts[J].Br J Dermatol，2005，153 supp 2:6-12.

[8]Wenk J，Brenneisen P，Meewes C，et al.UV induced oxidative stress and photoaging[J].Curr Probl Dermatol，2001，29:83-94.

[9]Pascual-Le Tallec I，Korwin-Zmijowska C，et al.Effects of simulated solar radiation on type I and type III collagens， collagenase (MMP-1) and stromelysin (MMP-3) gene expression in human dermal fibroblasts cultured in collagen gels[J]. J Photochem Photobiol B，1998，42(3):226-232.

[10]Eiichiro M，Akihisa T，Kou K.Time course and spacial distribution of UV effects on human skin in organ culture[J]. J Kadiat Res，2008，49(3):269-277.

[收稿日期]2009-11-18 [修回日期]2010-01-29

編輯/張惠娟