表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)小鼠脫發(fā)模型毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

[摘要]目的:觀察表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)C57BL6小鼠脫發(fā)模型毛發(fā)生長(zhǎng)及毛發(fā)周期的影響。方法:采用松香、蠟脫毛法誘導(dǎo)小鼠體毛由休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期。脫毛次日分組，各組小鼠每日分別以8%EGCG乙醇制劑、5%米諾地爾溶液、乙醇涂擦脫毛區(qū)，連續(xù)21天，記錄小鼠皮膚顏色變化過(guò)程及新生毛發(fā)生長(zhǎng)狀況，并通過(guò)HE切片觀察EGCG對(duì)皮膚、毛囊形態(tài)，毛囊數(shù)目的影響。結(jié)果:與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組提前24h由粉紅變?yōu)榧t色、推遲48h由黑色變?yōu)榛疑?，而基質(zhì)組與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差別;實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠毛囊數(shù)目在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均與陰性對(duì)照組小鼠具有顯著性差異。結(jié)論:EGCG可誘導(dǎo)小鼠毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間，推遲進(jìn)入退行期，并刺激小鼠毛囊數(shù)目增多。

[關(guān)鍵詞]EGCG;C57BL6小鼠;毛發(fā)周期;毛囊

[中圖分類(lèi)號(hào)]R758.71[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)03-0350-03

Effects of EGCG on hair growth of C57BL6 mouse alopecia model

LI Da-ning，LI Mei-yun，LIU Jin-fen，F(xiàn)ENG Xin-qing，SHI Yu

(Dermatology Department of Xuhui Central Hospital， Shanghai200031，China)

AbstractObjectiveTo observe the effects of EGCG on hair growth and hair cycle of C57BL6 mouse alopecia model.MethodsWe induced back hair of mice from anagen to telogen by depilation of hair shafts with wax∶resin (1∶1) mixture. The mice were treated tropically once a day respectively using 8% EGCG， 5% minoxidil solution and alcohol for 21 days， meanwhile the changes of skin color and new hair growth characteristic were observed daily. Furthermore，the effects of EGCG on skin， hair follicle morphology and the number of hair follicles were evaluated by HE slice.ResultsCompared with the negative control group， the back skin color of the experimental group and the positive control group turned from pink to black 24h earlier and gray from black delay 48h， while the matrix liquid group and the negative control group have no significant differences. There are significant differences in experimental group， the positive control group and the negative control group on the number of hair follicles.ConclusionEGCG not only can induce and prolong anagen， but also postpone catagen in C57BL6 mice. Moreover， EGCG can stimulate an increase in the number of hair follicles in mice.

Key words: EGCG; C57BL6 mice; hair cycle; follicles

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate， EGCG)是綠茶提取物茶多酚中的一種主要活性單體，具有廣泛的生物學(xué)活性。為了探討EGCG與毛發(fā)生長(zhǎng)的關(guān)系，筆者以C57BL6小鼠作為動(dòng)物模型，觀察EGCG對(duì)小鼠脫發(fā)模型毛發(fā)生長(zhǎng)及毛發(fā)周期的影響。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL 6 小鼠，雌性，8 周，15～20g，同系，共24只，中國(guó)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物中心提供。選擇皮色粉紅，毛發(fā)屬于休止期的小鼠。C57BL6小鼠的毛發(fā)周期同步，可根據(jù)其皮膚顏色判斷毛發(fā)周期的階段變化，毛發(fā)生長(zhǎng)期皮膚呈黑色，退行期呈灰色，休止期呈粉紅色[1]。

1.1.2 主要試劑:EGCG購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)E4143;5%米諾地爾溶液(商品名:蔓迪)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脫發(fā)模型建立:將松香與石蠟1:1混合加熱融化后，均勻涂于小鼠背部，涂抹面積約2cm×3cm，冷卻凝固后揭去，以去除背毛。確認(rèn)毛發(fā)生長(zhǎng)期處于休止期。

1.2.2 動(dòng)物分組:脫毛次日，選取脫毛區(qū)光滑無(wú)皮膚破損的小鼠，隨機(jī)分為4組，每組動(dòng)物數(shù)6只。分別是:①實(shí)驗(yàn)組:給予8%EGCG乙醇制劑;②陽(yáng)性對(duì)照組:給予5%米諾地爾溶液;③基質(zhì)組:給予基質(zhì)液(乙醇);④陰性對(duì)照組:不涂抹藥物。

1.2.3 給藥:局部皮膚直接用棉簽涂抹給藥，每天定時(shí)給藥1次，每次給藥量為0.1ml，連續(xù)給藥20天。

1.2.4 觀察記錄結(jié)果:每天觀察小鼠皮膚及毛色變化，記錄每只動(dòng)物背部去毛區(qū)皮膚顏色從涂藥到開(kāi)始變黑的時(shí)間;陰性對(duì)照組記錄脫毛后第1天到開(kāi)始去毛區(qū)皮膚變黑的時(shí)間;去毛區(qū)開(kāi)始變黑到長(zhǎng)滿毛的時(shí)間，并定期拍照。

第4、12、20天時(shí)，取各組小鼠背部相同位置皮膚組織塊，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，切片厚約4～5μm，HE染色，光鏡下觀察。觀察指標(biāo)如下:①一般組織學(xué)檢查:觀察皮膚完整性，有無(wú)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等反應(yīng)及程度;②毛囊計(jì)數(shù)，每例數(shù)3個(gè)高倍視野(×400)的毛囊數(shù)，取其均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS.11統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響:①實(shí)驗(yàn)組小鼠在拔毛后第5～6天局部皮膚逐漸出現(xiàn)黑色，毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期，10天后新的毛發(fā)長(zhǎng)出，20天時(shí)皮膚顏色又經(jīng)灰色(退行期)變?yōu)榉奂t色(休止期)，皮膚黑色及灰色共持續(xù)約15天;②陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在拔毛后第5天局部皮膚漸出現(xiàn)黑色，毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期，9天后新的毛發(fā)長(zhǎng)出，20天時(shí)皮膚顏色又經(jīng)灰色(退行期)變?yōu)榉奂t色(休止期)，皮膚黑色及灰色共持續(xù)15天;③基質(zhì)組、陰性對(duì)照組小鼠均在拔毛后第6天局部皮膚由粉紅色變?yōu)楹谏?0天后新的毛發(fā)長(zhǎng)出，19天時(shí)皮膚顏色又經(jīng)灰色變?yōu)榉奂t色，皮膚黑色及灰色共持續(xù)13天。

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 實(shí)驗(yàn)第4天時(shí)，切取每組小鼠背部皮膚，可觀察到實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組皮下血管網(wǎng)豐富，血管較粗;而基質(zhì)組和陰性對(duì)照組未見(jiàn)此現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)第12、20天，切取每組小鼠背部皮膚，石蠟切片，HE染色觀察到:各組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)均完整，被覆鱗狀上皮完整，角化層無(wú)增厚，真皮內(nèi)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物皮膚毛囊發(fā)育較完整，數(shù)量較多，黑素較基質(zhì)組和陰性對(duì)照組明顯。各組毛囊形態(tài)無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

2.3 EGCG對(duì)毛囊密度的影響:實(shí)驗(yàn)第20天，各組小鼠毛囊數(shù)目見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組小鼠在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均具有極顯著性差異，P<0.001， 基質(zhì)組與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，P>0.05。且實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異，P>0.05。

3討論

EGCG是綠茶提取物茶多酚中的一種主要活性單體，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖表現(xiàn)不同程度的抑制作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響等有關(guān)[3]。也有報(bào)道顯示EGCG對(duì)正常的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞有促增殖作用[4]。2006年Kwon 等[5]首次報(bào)道了EGCG可促進(jìn)人毛發(fā)生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)李梅云、范衛(wèi)新等[6]研究也發(fā)現(xiàn)一定濃度的EGCG可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人毛囊生長(zhǎng)和毛乳頭細(xì)胞增殖。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)EGCG對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)周期影響的相關(guān)報(bào)道。本研究以C57BL6小鼠為模型，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，觀察外用EGCG溶液對(duì)毛發(fā)周期、毛囊密度、毛囊形態(tài)的影響。

C57BL6小鼠是研究毛發(fā)周期的動(dòng)物模型，毛發(fā)呈周期性生長(zhǎng)，毛發(fā)周期分生長(zhǎng)期、退行期和休止期。。該小鼠毛發(fā)呈黑色，皮膚中的黑素細(xì)胞均分布于毛囊，僅在毛發(fā)生長(zhǎng)期才合成分泌黑素，并將黑素傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞，使皮膚呈黑色;在毛發(fā)退行期，黑素合成減少，皮膚逐漸由黑色變?yōu)榛疑?休止期無(wú)黑素合成，皮膚呈粉紅色。經(jīng)組織學(xué)驗(yàn)證，該小鼠皮膚顏色的變化能反映毛發(fā)生長(zhǎng)周期的不同時(shí)段。該小鼠在6～8周飼養(yǎng)良好狀態(tài)下，所有毛囊均由生長(zhǎng)期(皮膚黑色)進(jìn)入休止期(皮膚粉色)狀態(tài)，而且在生理狀態(tài)下不再自發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期，但經(jīng)人為拔毛后可被誘導(dǎo)進(jìn)入生長(zhǎng)期，拔毛后第5～6天 皮膚顏色變黑(生長(zhǎng)期第Ⅳ亞期)，黑色持續(xù)12天又轉(zhuǎn)為灰色(退行期)，2天后皮膚轉(zhuǎn)為粉紅色(休止期)[7]。

米諾地爾溶液是臨床應(yīng)用極為廣泛的一種治療各類(lèi)脫發(fā)的藥物，有研究表明，其可以使毛發(fā)提前進(jìn)入生長(zhǎng)期，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間，并縮短休止期，并能使毛囊增大[8]。故本研究選用5%米諾地爾溶液為陽(yáng)性對(duì)照。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚顏色提前 24h由粉紅色變?yōu)楹谏?，推遲24h由黑色變?yōu)榛疑?，毛囊生長(zhǎng)期時(shí)間較陰性對(duì)照組長(zhǎng)近72h，表現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果相似。提示EGCG與米諾地爾一致，可誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間，并推遲進(jìn)入退行期。我們還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)第4天時(shí)，切取每組小鼠背部皮膚，觀察到實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組皮下血管網(wǎng)豐富，血管較粗;而基質(zhì)組和陰性對(duì)照組未見(jiàn)此現(xiàn)象。推測(cè)EGCG和米諾地爾一樣具有促進(jìn)血管增生的作用。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)第20天，我們觀察到實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組小鼠毛囊數(shù)目，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均具有極顯著性差異，P<0.001;基質(zhì)組與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，P>0.05;實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異，P>0.05。由此可見(jiàn)EGCG具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用，且此作用與米諾地爾相當(dāng)。

本研究結(jié)果顯示EGCG可誘導(dǎo)C57BL6毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間，并推遲進(jìn)入退行期，具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用，可能與其促進(jìn)血管增生作用有關(guān)。國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)EGCG可促進(jìn)人毛發(fā)及體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng)和體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖。但人與動(dòng)物有著種屬差異，故EGCG促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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[收稿日期]2009-11-12 [修回日期]2010-02-03

編輯/張惠娟