血管鈉肽通過(guò)抑制白細(xì)胞L-選擇素表達(dá)保護(hù)碾壓撕脫皮瓣

[摘要]目的:本研究組以往的工作已證實(shí)血管鈉肽(Vasonatrin peptide，VNP)對(duì)碾壓撕脫傷皮瓣有明顯的保護(hù)作用，本研究擬探討該作用是否通過(guò)抑制皮瓣損傷后白細(xì)胞的L-選擇素表達(dá)介導(dǎo)。方法:24只大鼠隨機(jī)分為3組(n=8)，分別為SHAM手術(shù)組、碾壓撕脫組及VNP+碾壓撕脫組，于術(shù)前及術(shù)后12h取材，HE染色觀察組織學(xué)改變和白細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色對(duì)表達(dá)于白細(xì)胞表面的L-選擇素進(jìn)行標(biāo)記以明確VNP對(duì)碾壓撕脫皮瓣的具體作用。結(jié)果:碾壓撕脫組皮瓣組織損傷情況較重，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，其表面的L-選擇素表達(dá)也隨之升高，而VNP治療組皮瓣中的中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其所表達(dá)的L-選擇素也較前者顯著降低(P<0.05)。結(jié)論:VNP可抑制白細(xì)胞表面L-選擇素的表達(dá)，顯著抑制碾壓撕脫傷后皮瓣局部白細(xì)胞的活化，減輕其粘附和浸潤(rùn)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，抑制血栓形成，從而為臨床上提高碾壓撕脫皮瓣成活率并改善預(yù)后提供一種新的治療思路。

[關(guān)鍵詞]血管鈉肽;白細(xì)胞;皮瓣碾壓撕脫傷; L-選擇素

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)03-0337-04

Vasonatrin Peptide(VNP)protected the crush-avulsion injured skin flap from necrosis via inhibition of the expression of L-selectin on leucocytes

WANG Shi-ping，LAN Zhi-yong，XIA Wei，GUO Shu-zhong，ZHAO Qian，LIU Bei，PAN Bao-hua

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectivePrevious studies of our group showed that the Vasonatrin peptide(VNP)had protective effect on the cursh-avulsion injured skin flap. This study was designed to investigate whether the protection effect of VNP conducted via inhibition of expression ofL-selectin on leucocytes.MethodsTwenty four rats were randomly divided into three groups: the SHAM operation group， the crush injury group and the VNP treated group. Tissue samples from skin flap were collected before surgery and 12h after surgery， Hematoxylin-eosin stain was used to observe the histological change and inflammatory cell infiltration. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of L-Selectin on leucocytes in the skin flap of each group， by which we can affirm the effects of VNP. ResultsCompared with the VNP treated group， tissue damage was more serious and a mass of inflammatory cell infiltration was observed， and the expression of L-Selectin was significantly higher(P﹤0.05) in the crush injury group. Conclusion VNP，which could mitigate inflammatory reaction and inhibit thrombosis by decreasing the inflammatory cell infiltration and down regulating the expression of L-Selectin in the crush injury， has the potential to be a new therapeutic drug for clinical application.

Key words: Vasonatrin peptide (VNP); Leucocytes; Flap crush injury; L-Selectin

我們以往研究證實(shí)，在碾壓撕脫傷發(fā)生后，會(huì)發(fā)生非常復(fù)雜的病理生理學(xué)改變，其中白細(xì)胞對(duì)組織損傷會(huì)發(fā)揮重要的作用，參與了炎癥反應(yīng)和血栓的形成，白細(xì)胞在炎癥反應(yīng)區(qū)域集中，對(duì)炎癥的加重及血栓的形成和發(fā)展起到關(guān)鍵的作用，進(jìn)而造成碾壓撕脫組織內(nèi)形成廣泛的微血栓，導(dǎo)致組織缺血引起撕脫繼發(fā)性壞死的發(fā)生[1]。碾壓撕脫傷發(fā)生后，白細(xì)胞首先通過(guò)在血管壁上緩慢滾動(dòng)開(kāi)始發(fā)揮其在炎癥反應(yīng)中的作用，而白細(xì)胞與血管壁接觸這一使動(dòng)步驟是由其表面的L-選擇素通過(guò)與相應(yīng)配體結(jié)合來(lái)介導(dǎo)的[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察應(yīng)用血管鈉肽(Vasonatrin peptide，VNP)后碾壓撕脫皮瓣組織中白細(xì)胞浸潤(rùn)和L-選擇素表達(dá)情況的改變，研究其對(duì)碾壓撕脫皮瓣組織的保護(hù)作用機(jī)制，為臨床救治提供指導(dǎo)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組:清潔級(jí)SD大鼠24只(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體重220-280g，普通喂養(yǎng)。將24只大鼠隨機(jī)分為三組，每組8只，A組為SHAM手術(shù)組(皮瓣掀起后直接原位縫合，不進(jìn)行碾壓撕脫)，B組為單純碾壓撕脫組(生理鹽水1ml/kg腹腔注射， 1次/日)，C組為碾壓撕脫傷后VNP治療組(VNP 0.1mg/kg靜脈注射， 1次/日)。實(shí)驗(yàn)方法詳見(jiàn)先前實(shí)驗(yàn)[3]，簡(jiǎn)述為:在大鼠背部形成3cm×9cm長(zhǎng)方形任意皮瓣，使用皮膚碾壓撕脫傷模型機(jī)制作碾壓撕脫傷皮瓣模型(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科研制，專利號(hào):ZL 2008 2 0221813.3)。

1.2免疫組織化學(xué):術(shù)前及術(shù)后12h，各組于皮瓣中遠(yuǎn)1/3交界處切取全層皮瓣組織1cm×2cm，所取組織立即用10%福爾馬林固定，石蠟包埋備用。各組皮瓣組織標(biāo)本分別進(jìn)行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)超敏S-P試劑盒(購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)對(duì)組織進(jìn)行染色，具體染色步驟按照先前實(shí)驗(yàn)進(jìn)行[3];一抗L-Selectin(購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CA， USA)。結(jié)果判定:胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。每張切片在高倍鏡(400倍)下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，在同一背景條件下取圖并進(jìn)行灰度處理后用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)定平均積分光密度(IOD)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS12.0(SPSS Inc. Chicago， Illinois)統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較用采用方差分析，P﹤0.05，差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1 皮瓣成活率:通過(guò)我們的前期工作已證明，使用我科自行研制的皮膚碾壓傷模型可以制作出穩(wěn)定可重復(fù)的碾壓皮瓣。皮瓣碾壓后，組織自遠(yuǎn)端1/3開(kāi)始逐漸發(fā)生干性壞死，隨著時(shí)間推移，原本看似有活力的組織也開(kāi)始發(fā)生壞死表現(xiàn)，表皮脫屑、變硬等繼發(fā)性壞死特征相繼出現(xiàn)，至術(shù)后7天壞死和成活組織呈現(xiàn)明顯界限。此時(shí)計(jì)算各組皮瓣的成活率(皮瓣成活率=皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100)，結(jié)果如下:A組(SHAM): 61.12±4.92;B組(單純碾壓撕脫):37.42±4.36;C組(碾壓撕脫+VNP):49.96±1.32。 可以看出VNP治療能顯著提高皮瓣的成活面積(P<0.05)，減少繼發(fā)性壞死的發(fā)生。

2.2 組織損傷和白細(xì)胞浸潤(rùn):為進(jìn)一步了解碾壓傷后組織損傷情況和VNP的作用，我們選擇在傷后12h于皮瓣中遠(yuǎn)1/3交界處取材，進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。HE染色見(jiàn)SHAM手術(shù)組皮瓣組織形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管中血流通暢(圖1)。碾壓撕脫組皮瓣可見(jiàn)組織的形態(tài)和完整性遭到明顯破壞，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)可見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞大量出現(xiàn)，部分管腔內(nèi)充滿中性粒細(xì)胞，可見(jiàn)白細(xì)胞貼壁，有附壁血栓形成(圖2)。VNP治療組皮瓣組織損傷情況得到明顯改善:組織雖有水腫，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較單純碾壓皮瓣有明顯減少，大多聚集在血管壁外周，管腔內(nèi)充血，僅有少量中性粒細(xì)胞存在于管腔之中，可見(jiàn)白細(xì)胞附壁現(xiàn)象，尚未見(jiàn)明顯血栓形成(圖3)。

2.3 L-選擇素免疫組織化學(xué)染色:L-選擇素表達(dá)于多種白細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，是介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞初始作用和滾動(dòng)的主要黏附分子[4]，因此我們挑選了L-選擇素這一指標(biāo)來(lái)研究白細(xì)胞在碾壓撕脫傷中的作用。術(shù)前各組切片中L-選擇素表達(dá)未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。術(shù)后12h切片:SHAM手術(shù)組中L-選擇素陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞不多，多呈黃色、棕黃色等弱陽(yáng)性表現(xiàn)(圖4);碾壓撕脫組皮瓣可觀察到大量L-選擇素陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，且呈棕褐色的強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)，并其多位于管腔內(nèi)及血管周圍，尤其在管腔內(nèi)呈大量聚集表現(xiàn)，這與中性粒細(xì)胞聚集部位相一致，證明了在碾壓撕脫傷早期白細(xì)胞因L-選擇素的高表達(dá)而聚集于管腔之中，并最終滲出浸潤(rùn)至組織各處參與炎性反應(yīng)過(guò)程(圖5);VNP治療組中L-選擇素的表達(dá)較碾壓撕脫組明顯減少，散在于管腔及內(nèi)皮細(xì)胞周圍，說(shuō)明VNP較好地抑制了白細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的作用(圖6)。術(shù)后12h各組間平均積分光密度(IOD)差異具有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3討論

皮膚碾壓撕脫傷是整形外科的常見(jiàn)損傷，其損傷可分為原發(fā)性壞死和繼發(fā)性壞死，其中繼發(fā)性壞死往往導(dǎo)致傷后碾壓撕脫皮瓣大面積受損，是皮膚碾壓撕脫傷所特有的損傷特點(diǎn)，給患者的救治及預(yù)后恢復(fù)帶來(lái)很大難度。我科通過(guò)長(zhǎng)期研究總結(jié)出繼發(fā)性壞死的主要病理改變?yōu)?血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷脫落，白細(xì)胞貼壁黏附、血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，碾壓撕脫皮瓣中血流明顯下降，血管內(nèi)大量微血栓形成。我們通過(guò)活體熒光觀察發(fā)現(xiàn)[5]，在碾壓傷發(fā)生后30min左右即可見(jiàn)少量白細(xì)胞隨血流沿血管壁游走滾動(dòng)，后滾動(dòng)速度逐漸減慢，最終停止而黏附于血管壁之上。而后隨著黏附的白細(xì)胞越聚越多，最終形成血栓阻塞管腔，可見(jiàn)白細(xì)胞的貼壁黏附形成附壁血栓是造成微循環(huán)障礙的主要原因。根據(jù)碾壓撕脫傷后以白細(xì)胞為代表的組織病理學(xué)改變及以往研究結(jié)果我們能得出:選擇素分子參與了繼發(fā)性壞死的損傷過(guò)程，并對(duì)傷后白細(xì)胞貼壁滾動(dòng)、黏附、滲出及組織的病理變化有重要的作用[6-7]。

選擇素又稱凝集素樣細(xì)胞粘附分子(Lec-CAM)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附，并具有高度選擇性，分為E-、P-、L-選擇素三個(gè)成員。L-選擇素(或稱為CD62L)廣泛表達(dá)于多種白細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞，L-選擇素集中表達(dá)于未激活的中性粒細(xì)胞的微絨毛頂端或膜的皺折部位，這可能利于與其內(nèi)皮細(xì)胞配體及早接觸[8]，是整合素介導(dǎo)中性粒細(xì)胞牢固黏附的前提，在炎癥反應(yīng)的過(guò)程中起到重要的作用[9]。當(dāng)創(chuàng)傷及炎性發(fā)生時(shí)，炎癥介質(zhì)首先活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)黏附分子的相應(yīng)配體，同時(shí)，L-選擇素表達(dá)量升高，并在創(chuàng)傷后24h內(nèi)均處于高表達(dá)狀態(tài)[10];此時(shí)，血流中的白細(xì)胞通過(guò)其表面所表達(dá)的L-選擇素與其相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞配體結(jié)合，使原本在血流中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的白細(xì)胞在切應(yīng)力的作用下沿炎癥附近血管緩慢滾動(dòng)，這種“滾動(dòng)”就是白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞牢固黏附的先決條件，而后隨著L-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的白細(xì)胞激活和β2整合素的粘附加強(qiáng)作用，使白細(xì)胞活化、變形，穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞到血管外，最終移行到炎癥區(qū)域釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)造成組織纖維、壞死的等表現(xiàn)。因此，L-選擇素可作為白細(xì)胞參與創(chuàng)傷后反應(yīng)的標(biāo)志之一。國(guó)外學(xué)者研究證明[11]，通過(guò)阻止白細(xì)胞黏附，可顯著地減少白細(xì)胞對(duì)微循環(huán)機(jī)能和組織的損害，而L-選擇素介導(dǎo)白細(xì)胞的滾動(dòng)、黏附與滲出[12]，位于損傷改變的始動(dòng)環(huán)節(jié)，在創(chuàng)傷中有十分重要作用。同時(shí)，我們根據(jù)以往研究也已證實(shí)[13]，采用L-選擇素的拮抗劑可減輕組織炎癥癥狀，對(duì)缺血/再灌注損傷皮瓣起到一定得保護(hù)作用。因此使用一種可抑制或阻斷L-選擇素發(fā)揮作用，進(jìn)而減少白細(xì)胞對(duì)組織的損害的藥物，可能對(duì)碾壓撕脫皮瓣起到一定的保護(hù)作用。

血管鈉肽(Vasonatrin peptide，VNP)，是一個(gè)人工合成的含有27個(gè)氨基酸(Aa)殘基組成的多肽，它是心房鈉尿肽(ANP)和C型鈉尿肽(CNP)的嵌合物，在生物活性上兼具CNP和ANP的雙重作用。國(guó)外的研究報(bào)道CNP可抑制白細(xì)胞動(dòng)員并通過(guò)抑制P-選擇素的表達(dá)起到抑制白細(xì)胞貼壁滾動(dòng)和血小板凝集的作用[14]，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了VNP也具有抑制P-選擇素表達(dá)的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)顯示，碾壓撕脫傷后早期給予VNP進(jìn)行治療可同樣起到抑制L-選擇素表達(dá)的作用。與E-、P-選擇素不同，即使沒(méi)有刺激，白細(xì)胞表面也有少量L-選擇素表達(dá)，在細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)及其他因素的作用下，其表達(dá)的水平可發(fā)生變化，脫落是調(diào)節(jié)其活性的主要方式，而其反復(fù)脫落與再表達(dá)則影響著白細(xì)胞的趨化性[15]，故本研究中采用了平均積分光密度(IOD)這一客觀性較強(qiáng)的指標(biāo)對(duì)其組化結(jié)果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明VNP可通過(guò)抑制L-選擇素的表達(dá)起到抑制白細(xì)胞的貼壁及滲出浸潤(rùn)，減少血栓形成并減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí)減少白細(xì)胞對(duì)微循環(huán)機(jī)能和組織的損害，進(jìn)而提高皮瓣的成活率，對(duì)碾壓撕脫皮瓣起到保護(hù)作用。此外，VNP是一種人工合成的多肽，體內(nèi)可能缺乏特異性降解內(nèi)肽酶，克服了其他鈉尿肽代謝快、半衰期短的缺陷。因此，VNP有希望成為防治碾壓撕脫皮瓣繼發(fā)壞死的多肽，可為臨床上提高碾壓撕脫皮瓣成活率并改善預(yù)后提供一種新的治療思路。

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[收稿日期]2009-12-02 [修回日期]2010-02-23

編輯/張惠娟