MMP-1在人牙周膜成纖維細胞中的表達

[摘要]目的:在基因和蛋白水平檢測體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞(HPDLF)金屬基質蛋白酶-1(MMP-1)的表達情況。方法:①收集4～6代體外培養(yǎng)的人PDL細胞，使用PCR方法檢測細胞內MMP-1的基因表達;②取細胞外液用Western blot方法檢測MMP-1蛋白表達。結果:PCR結果顯示MMP-1在PDL中基因水平上有表達，而Western blot結果在蛋白水平上也證明了MMP-1在PDL中有表達，結論:體外培養(yǎng)的PDL具有MMP-1的功能。

[關鍵詞]人牙周膜成纖維細胞;MMP-1;Western blot;PCR

[中圖分類號]R783[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)03-0372-02

Expression of MMP-1 in human periodontal ligament fibroblasts

LIU Xin-wei1，CAO Jun1，LI Zhi-dong2，WANG Yuan2，LIU Qi1 ，ZHANG Zi-chuan1;XU Jing3

(1.Department of Orthodontics，College of Stomatology，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China;2.Department of Microbiology，Fourth Military Medical University;3.Xi’an Second Hospital，Xi’an Stomatology Hospital)

Abstract:ObjectiveTo detect matrix metalloproteinase -1(MMP-1)gene expression level and protein level produced by human periodontal ligament fibroblasts (HPDLF) cultured in vitro without stimulation. Methods①To collect human PDL cells cultured in vitro and detect gene expression of MMP-1 using PCR;②To detect protein expression of MMP-1 in the extracellular fluid using Western blot. ResultsPCR has proved the gene of MMP-1 expresses in the PDL，while the Western blot has showed the protein level of MMP-1 also expressed in the PDL. Conclusion MMP-1can be produced by PDL cultured in vitro without stimulation.

Key words:HPDLF;MMP-1;Western blot;PCR

基質金屬蛋白酶(matrix metallop roteinases，MMPs)是一組含Zn2+的能夠降解細胞外基質的蛋白酶家族，是細胞外基質降解的關鍵酶。生物體內的很多生理、病理改建都與這種物質相關，如MMP-1等能溶解牙骨質中的非鈣化有機質，與牙根吸收的發(fā)生機制相關。研究擬用Western blot和PCR方法在蛋白和基因水平分別研究體外培養(yǎng)的PDL在無干涉的情況下分泌MMP-1的情況，以確定在正常生長狀態(tài)下，PDL是否有分泌表達MMP-1的功能，從而有助于分析生理狀態(tài)下組織改建所需的MMP-1的細胞來源，以及分析PDL在這種改建中所起的作用。同時本研究還有助于明確PDL是否可以作為MMP-1的物質來源細胞，研究其調控表達機制，從而分析牙根吸收等病理活動的發(fā)生機制。

1材料和方法

1.1主要試劑與儀器:DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(solarbio);Taq DNA Polymerase、Loading Buffer(raKaRa，Japan);SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(AppliedBiosystems，USA);MMP-1引物(TaKaRa公司合成);分光光度計;蛋白marker;MMP-1抗體(ab.com公司);兔抗二抗;離心機;多功能電泳檢測儀;轉膜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPDLF的體外培養(yǎng):收集12～18歲患者正畸拔除的健康前磨牙，無菌條件下刮取牙根中1/3處牙周膜組織，組織塊法培養(yǎng)原代牙周膜細胞，培養(yǎng)的細胞經SABC免疫細胞化學檢測呈抗波形絲蛋白陽性，抗角蛋白陰性，表明細胞來源于中胚層，證實為牙周膜成纖維細胞。取其第4～6代細胞進行實驗。棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶+0.1%EDTA混合消化液消化細胞，約1min，用含10%小牛血清的DMEM終止。800r/min離心混勻，調整細胞密度，按2×10/ml接種在6孔培養(yǎng)板表面24h細胞貼壁后更換含10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)24h，使細胞相對同步化，備用。

1.2.2人牙周膜成纖維細胞分泌MMP-1表達的基因水平檢測:利用Primer Express(ABI，Foster City，CA)程序設計MMP-1鑒定引物。

引物序列如下:上游引物: 5'-GCCACAAAGTTGATGCAGTT-3'

下游引物: 5'-GCAGTTGAACCAGCTATTAG-3'

以上引物均由TaKaRa生物工程公司合成，擴增片段長度105bp。循環(huán)條件:95℃ 5min預變性，95℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)，72℃ 10min延伸。細胞總RNA提取及逆轉錄:取4代HPDLF根據TaKaRa公司PCR KIT(AMV)VER.3.0試劑盒產品說明提取總RNA。根據TaKaRa公司RTase M-MLV試劑盒操作說明將2μm總RNA逆轉錄成cDNA。將cDNA 產物進行PCR 擴增后，電泳檢測PCR擴增產物，PCR反應結束后，在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為120V，采用DL-2000 DNA marker，所得結果拍照并掃描。

1.2.3人牙周膜成纖維細胞分泌MMP-1表達的蛋白水平檢測:分別取陽性對照hepG2細胞，實驗對象HPDLF細胞，陰性對照。為防胎牛血清內蛋白干擾，待用細胞棄去DMEM培養(yǎng)液，無血清DMEM反復吹打后用無血清DMEM孵育1h后，取細胞上清，離心后測蛋白濃度，提取蛋白，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮6min，每孔上樣20μl，行12%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。TBST震蕩洗滌3次，10min/次;后用含10%脫脂奶粉的TBS封閉2h;TBST震蕩洗滌3次，10min/次;一抗封閉4℃過夜(1:500);TBST震蕩洗滌3次，10min/次:二抗封閉2h(1:2 000);TBST震蕩洗滌4次，10min/次。化學法發(fā)光，膠片顯色，分析結果。

2 結果

2.1 人牙周膜成纖維細胞分泌MMP-1表達的基因水平檢測結果:HPDLF細胞裂解液PCR結果顯示，HPDLF在無外界刺激情況下，在基因水平上有表達(如圖1)。

3.2 Western blot檢測MMP-1蛋白的表達:PBS孵育的HPDLF細胞和陽性對照hepG2細胞均在60KDa上出現清晰條帶，但作為陰性對照的位置卻沒有出現條帶(如圖2)。

3 討論

本研究中，我們通過PCR和Western blot方法在細胞外液中對MMP-1進行檢測，結果顯示，在沒有外界刺激的前提下，PDL細胞是可以分泌MMP-1的，這提示正常生長狀態(tài)下PDL細胞有分泌MMP-1的功能。如筆者前面所述的那樣，MMP-1作為金屬蛋白激酶家族中的一員，與機體生理及病理狀態(tài)下的組織改建是密切相關的。例如，在正常的骨組織的新陳代謝中，MMP-1參與骨的吸收與改建，在骨吸收過程中，MMP-1可去除骨表面未礦化層，將刺激吸收的礦化骨質暴露于破骨細胞，同時，分解膠原這一過程也是由MMP-1啟動的。這一步驟是其它MMPs進一步分解膠原碎片的前提條件。在正畸牙齒移動過程中，膠原纖維的分解斷裂是牙根吸收的一個關鍵因素[1]，膠原蛋白的降解包括細胞的內降解與細胞外降解兩個途徑。細胞外基質的降解主要依靠絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶和MMP等4類蛋白水解酶，其中MMP最為重要，能降解幾乎細胞外基質的所有成分，包括天然和變性的不同種類的膠原[2];而在牙根吸收發(fā)生時，有研究表明牙根吸收的關鍵在于PDL中膠原纖維的清除[1]。以往的實驗曾經證明，正畸過程中，機械力的使用傳遞至牙周，引起MMP-lmRNA表達的變化。體外研究[3]發(fā)現在牽張力作用下，PDL和牙齦成纖維細胞對MMP-1mRNA的表達增加。體內實驗[4]則表明，壓力和張力都可導致狗PDL中MMP-1的mRNA水平和其活性的明顯上升。而參與上述關于MMP-1的研究，大多是針對外界給予各種干涉下進行檢測的，MMP的表達在未受刺激的細胞中較低，但是部分在各種細胞外刺激因素誘導下(包括生長因子，細胞因子腫瘤促進劑，紫外線和紅外線輻射)，含量升高[5]。比如，Domeij等[6]在研究提到，用IL-1β、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)和ECF因子誘導人牙齦成纖維細胞產生MMP-1。本實驗則是針對無干涉情況下進行蛋白和基因方面的檢測，這一結果也與以往的研究有不同之處。

同時，本研究結果明確顯示的PDL細胞具有分泌MMP-1的功能，與成牙本質細胞的培養(yǎng)相比，PDL的體外培養(yǎng)方法簡單容易掌握，這提示我們可以以PDL細胞作為MMP-1的物質來源細胞，研究其調控表達機制，從而分析牙根吸收等病理活動的發(fā)生機制。這一結果，一方面提示PDL細胞是牙根吸收活動中MMP-1表達增強的細胞來源之一，也為進一步研究牙根吸收中MMP-1的干涉調控奠定基礎做刺激情況下對比PDL分泌MMP-1實驗提供依據。

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[6]Domeij H，Yucel-Lindberg T，Modeer T.Signal pathways in-volved in the production of MMP-1 and MMP-3 in human ng4-val fibmblasts[J].Eur J Oral Sci，20O2，ll0(4):302-306.

[收稿日期]2009-11-16 [修回日期]2010-01-25

編輯/何志斌