分子標記及其在核桃種質(zhì)資源研究中的應用

陳 霞 陳少瑜 陸 斌 李文祥 張 雨

摘要介紹了分子標記技術(shù)的類型,以及目前常用的幾種分子標記技術(shù)(RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR等)的基本原理、特點,綜述了分子標記技術(shù)在核桃種質(zhì)資源研究中的應用情況,并對目前分子標記研究存在的問題及前景作了分析。

關(guān)鍵詞分子標記;核桃;種質(zhì)資源;應用

中圖分類號Q819文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)14-0347-04

分子標記也稱為DNA分子遺傳標記,或DNA標記,是繼形態(tài)學標記、細胞學標記及生化標記之后,近年來被廣泛應用的一種新的遺傳標記。分子標記從分子水平反映生物個體間或種群間具有差異特征的DNA片段,直接反映基因組DNA間的差異,從而為解釋各物種間的親緣關(guān)系奠定了技術(shù)理論基礎[1]。DNA標記能對各個發(fā)育時期的個體、組織、器官進行檢測,不受發(fā)育階段及環(huán)境的影響,且遺傳穩(wěn)定、數(shù)量豐富。DNA分子標記對生物的影響表現(xiàn)為中性,有些標記為共顯性,且對選擇隱性基因控制的性狀十分有利。至DNA標記誕生到現(xiàn)在,發(fā)展迅猛,日臻成熟。目前,DNA標記被廣泛地應用于植物遺傳育種、基因定位、基因克隆以及分子輔助選擇等研究領域。

我國是核桃屬(Juglans)植物分布中心之一,原產(chǎn)于我國的有5個種,其中核桃(J. regia L.)和鐵核桃(J. siggillata L.)具有極大的商業(yè)堅果栽培價值[2-5]。隨著核桃屬作物大規(guī)模商業(yè)化的快速發(fā)展,以及品種選育、鑒定、推廣及種質(zhì)資源收集和保護工作的深入開展,形態(tài)描述、地理來源以及同工酶等方法由于自身存在局限性而難以滿足核桃屬植物研究和開發(fā)的需要,分子標記技術(shù)將成為上述工作的有效工具。

1分子標記的類型

DNA分子標記大多以電泳譜帶的形式體現(xiàn),大致可分為兩大類[1]。第1類是非PCR依賴的分子標記(基于Southern雜交的分子標記),包括限制性片段長度多態(tài)性標記(restriction fragment length polymorphism DNA,RFLP)、原位雜交(in situ hybridization)等;第2類DNA標記基于PCR技術(shù),主要包括隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplification polym-orphism DNA,RAPD)、DNA擴增指紋印跡(DNA amplifi-cation fingerprinting,DNA)、簡單序列重復標記(Simple seq-uence repeat,SSR)、隨機引物聚合酶鏈反應(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)以及擴增片段長度多態(tài)性標記(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等。

也有分為5類的劃分法,即在前2類的基礎上增添后3類。第3類以重復序列為基礎的分子標記,包括衛(wèi)星DNA(satellite DNA)、微衛(wèi)星DNA(microsatwllite DNA)、小衛(wèi)星DNA以及簡單重復序列等;第4類是以單核苷酸多態(tài)性為基礎的分子標記技術(shù),如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP);第5類是以mRNA為基礎的分子標記技術(shù),包括差異顯示(differental display,DD)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、表達順序標簽(expressed sequence taqs,EST)等[6]。由此可見,各類之間也存在著交叉,如第3類中的微衛(wèi)星DNA也可以歸于第2類以PCR為基礎的分子標記技術(shù)。

2幾種常用分子標記的原理和特點

2.1RFLP(Restriction Fragment length Polymorphsm)

RFLP即限制性片段長度多態(tài)性,它作為遺傳工具是由Grozdicker于1974年創(chuàng)立,Botesin于1980年再次提出,是最早應用的分子標記技術(shù)[6,7]。DNA中特定限制性酶切位點上堿基對的改變及酶切位點之間的分子重排事件(如缺失、倒位、易位等)是產(chǎn)生RFLP的分子基礎。其基本原理是由限制性內(nèi)切酶酶解樣品DAN,遺傳組成不同的個體間的DNA可產(chǎn)生大小不同的片段,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜等支持物上,通過與經(jīng)過放射性同位素或者非放射性物質(zhì)標記的特定DNA片段(探針)雜交,最后通過放射自顯影或酶學檢測不同材料對特定探針的多態(tài)性。該標記實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠,在遺傳上呈共顯性;不足在于實驗成本較高,DNA所需量較大,實驗操作復雜,檢測周期長,檢測效率低,此外同位素探針容易造成環(huán)境污染。

2.2RAPD(Random Amplifiled Polymorphic DNA)

為克服RFLP技術(shù)上的缺點,Williams等[8]于1990年建立了隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)。RAPD基本原理是利用1個隨機引物(8～10個堿基)通過PCR反應非定點地擴增DNA片段,然后用凝膠電泳分離擴增片段來研究DNA多態(tài)性。較之RFLP、RAPD技術(shù)簡單,檢測速度快,DNA用量少,實驗設備簡單,不需DNA探針,設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析,不依賴種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu),1套RAPD引物可以用于分析不同生物基因組,用1個引物就可擴增出許多片段,且不需要同位素,安全性好;但RAPD技術(shù)受諸多因素影響,穩(wěn)定性和重復性較差[9],呈顯性標記而不能區(qū)分雜合子和純合子。

2.3AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP擴增片段長度多態(tài)型,是1993年由荷蘭Keygene公司的科學家Zabeau和Vos發(fā)明的一種DNA分子標記新技術(shù)[10],是在PCR技術(shù)和RFLP標記技術(shù)的基礎上產(chǎn)生的。用限制性內(nèi)切酶雙酶切基因組DNA,形成分子量大小不等的隨機限制性片段,再在片段兩端接上特定接頭,通過接頭序列和PCR引物3′末端的識別后,特異性片段經(jīng)變性、退火和延伸周期性循環(huán)擴增,最終利用聚丙烯酰胺電泳分子篩作用將這些特異的限制性片段分離開來。AFLP在技術(shù)上是RAPD和PFLP的結(jié)合,既具RFLP的可靠性,又有RAPD的靈敏性,是分子標記技術(shù)重大突破,目前被認為是一種十分理想、有效的分子標技術(shù);缺點是操作技術(shù)較復雜,DNA要求純度高,實驗成本相應增加。

2.4SSR(Simple Sequence Repeats)和ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)

1991年,Moore等在PCR技術(shù)的基礎上創(chuàng)立了SSR(簡單重復序列)標記技術(shù)[11]。SSR是一類由幾個(多為1～5個)堿基串聯(lián)重復而成的DNA序列,其中最常見是雙核苷酸重復即(CA)n和(TG)n,在植物基因中(AT)n最多。每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同,重復單位數(shù)目10～60個,其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復次數(shù)不同,導致SSR長度的高度變異性,這一變異性正是SSR標記產(chǎn)生的基礎。SSR標記技術(shù)根據(jù)微衛(wèi)星重復序列兩端的特定短序列設計引物,通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段。核心序列重復次數(shù)不同,從而擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物,這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法。

在SSR標記中,采用PCR反應必須知道擴增DNA片段兩側(cè)序列,多數(shù)情況下某些序列本身或其旁側(cè)序列并不清楚,且由于SSR引物具有物種特異性,引物設計費時耗力,要檢測多個基因座是不現(xiàn)實的,這就限制了PCR技術(shù)的應用。

1994年Zietkiewicz等對SSR技術(shù)進行了發(fā)展,建立了加錨微衛(wèi)星寡核苷酸技術(shù)[12],即簡單重復間區(qū)(ISSR)或以微衛(wèi)星為引物的PCR技術(shù),可以克服上述SSR的障礙。他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物,即在SSR的5′端或3′端加上2～4個隨機選擇的核苷酸,這可引起特定位點退火,從而導致錨定微衛(wèi)星引物間的基因節(jié)段進行PCR擴增。這類標記又被稱為ISSR或ASSR。在所用的兩端引物中,一個是錨定引物,另一個是隨機引物。

SSR和ISSR與上述幾類標記相比,具有穩(wěn)定可靠、操作簡單等特點,兩者都是以重復序列和PCR擴增為基礎,被列為第2代分子標記技術(shù)。

3分子標記技術(shù)在核桃種質(zhì)資源研究中的應用

隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展與日趨成熟,其已經(jīng)廣泛應用于果樹研究中[13-15],分子標記技術(shù)在核桃種質(zhì)資源研究中的應用主要有以下幾方面。

3.1品種起源鑒定與分類

核桃起源問題一直是許多學者較有爭議的問題,也為此做了一些探索研究[16],而正確地分類是搞清起源問題的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的植物分類主要采用形態(tài)指標,但形態(tài)指標容易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生飾變,從而導致分類偏差。由于遺傳變異不僅表現(xiàn)在外部形態(tài)、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)等方面,DAN非編碼區(qū)域的變異對于生物的遺傳和進化也起著重要作用,故在分類方面,借助分子標記技術(shù)可以較全面地對研究對象進行比較分析,提高分類的準確性和可靠性。

1998年,Nicese等[17]用RAPD標記分析了19個核桃品種的遺傳關(guān)系,聚類分析結(jié)果顯示與經(jīng)典的分類結(jié)果一致,表明RAPD標記能準確反映彼此的系譜關(guān)系,首次為核桃的育種及種質(zhì)資源分析奠定了基礎。吳燕民等[18]用RAPD法對麻核桃的起源與分類地位進行了分析,指出核桃揪×核桃的天然雜交是麻核桃形成的主要機制;在麻核桃形成過程中,核桃揪的遺傳貢獻率大于核桃;在胡桃屬分類中,麻核桃應歸為核桃鍬組,這與傳統(tǒng)分類學的結(jié)果一致。吳燕民等[19]用RAPD技術(shù)對核桃屬內(nèi)9個種及近緣屬的2個種進行了基因組DNA多態(tài)性分析,結(jié)果表明,鐵核桃為核桃屬中一個獨立種;核桃屬內(nèi)組間和種間親緣關(guān)系與經(jīng)典分類學的結(jié)果完全一致。劉曉麗[20]利用SSR分子標記技術(shù)對新疆伊犁野核桃、喀什實生核桃及部分栽培品種的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析,初步提出伊犁野核桃、喀什實生核桃和栽培品種的親緣演化關(guān)系圖,為“我國是世界栽培核桃的起源中心之一”[21]的論斷進一步提供了分子證據(jù),并為栽培核桃品種的進一步選育提供分子依據(jù)。

3.2遺傳多樣性分析

遺傳多樣性即基因多樣性,體現(xiàn)在分子、細胞和個體3個水平上,是生命進化和物種分化的基礎。一個物種的遺傳變異愈豐富,它對生存環(huán)境的適應能力便愈強;而一個物種的適應能力愈強,則它的進化潛力也愈大。對核桃各種屬的遺傳多樣性研究,有利于對核桃種質(zhì)資源的保護并為核桃育種提供一定的理論依據(jù)。

奇異核桃Paradox是美國北加州黑核桃與普通核桃(J.hindsii×J. regia)的雜種后代的統(tǒng)稱,是加州核桃產(chǎn)業(yè)的重要砧木。為了搞清楚Paradox的遺傳背景,Daniel Potter等[22]對5種北美黑核桃進行了核DNA和葉綠體DAN的3個非編碼區(qū)的ITS序列分析,并對27個Paradox居群作了分子檢測,結(jié)果顯示,所采用的Paradox砧木的基因中有很大部分是來自J. hindsii以外的其他種。徐鄭等[23]運用RAPD技術(shù)對川西高原及秦巴山區(qū)核桃作了研究,指出前者遺傳多樣性高于后者。陳良華等[24]用AFLP技術(shù)對四川省的3個野生核桃種群和1個野生鐵核桃種群共46個品種進行了遺傳多樣性分析,得出鐵核桃群體遺傳多樣性水平略高于核桃群體,且群體內(nèi)的遺傳多樣性大于群體間。郝艷賓等[25]運用已開發(fā)的黑核桃SSR引物探索出適合核桃屬SSR標記的引物,得出有72.78%的黑核桃SSR引物能應用于核桃屬,能進一步用于核桃屬的遺傳多樣性研究。并用SSR技術(shù)對我國核桃組種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析[26],認為我國核桃栽培實生群可劃分為新疆核桃、華北核桃和西藏核桃三大相互獨立的地理生態(tài)類型,而秦巴山地核桃應分別屬于華北和新疆2個地理生態(tài)型。李同和[27]利用AFLP銀染技術(shù),對四川省3個核桃居群和1個鐵核桃居群的共46個樣品進行遺傳多樣性分析、居群遺傳結(jié)構(gòu)分析及種屬關(guān)系探討。指出鐵核桃居群遺傳多樣性水平略高于核桃居群,各種多態(tài)性指數(shù)表明居群內(nèi)的遺傳多樣性大于居群間,這為核桃種質(zhì)資源的保護和育種提供一定的理論依據(jù)。在對四川西部核桃屬植物遺傳多樣性的研究過程中,王寶慶[28]的研究結(jié)果與李同和的較一致。王滑等[29]也用SSR標記技術(shù)對中國核桃的8個天然居群進行遺傳多樣性分析,統(tǒng)計分析得出云南麗江鐵核桃居群的遺傳多樣性最高,四川黑水核桃居群最低,同時得出8個居群間的遺傳距離與其地理距離有顯著的相關(guān)性。

3.3重要農(nóng)藝性狀的連鎖標記

早實性是核桃生產(chǎn)的瓶頸性作用性狀,也是近年來核桃研究最多的一個農(nóng)藝性狀。核桃童期的長短取決于該物種本身的特性,受基因控制。普通核桃中的晚實類群的童期長達4～8年,極大地限制了核桃的栽培和育種。研究核桃早實基因的遺傳規(guī)律,尋找與其相連鎖的DNA分子標記,從而克隆出核桃早實基因,這對核桃育種、栽培實踐和揭示木本植物童期發(fā)育的機理都有重要意義。

張虎平等[30]先利用表觀性狀將參試核桃分為早實和晚實2個集群,再利用RAPD技術(shù)篩選出一個與早實性狀相關(guān)的穩(wěn)定的標記,最后將其成功地轉(zhuǎn)換為特異性的SCAR標記。楊克強等[31]用BSA法獲得了與核桃早實性狀相關(guān)的RAPD標記OPB-08958,并對早實和晚實核桃品種進行了DNA擴增,只在早實品種的擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)此條帶。并測出該標記序列為核桃基因組所獨有,與核桃早實基因之間的遺傳距離為1.99cm[32]。此外,Nadia Goue等[33]用RACE技術(shù)(cDAN末端快速擴增技術(shù))來隔離核桃CDKA基因的完整序列,并對該基因的結(jié)構(gòu)與功能進行了首次描述,據(jù)其報道該基因與核桃木徑向生長和出材量有關(guān)。

3.4構(gòu)建指紋圖譜

傳統(tǒng)的植物學分類的理論基礎都建立于性狀分析,這些性狀大多是與環(huán)境緊密相關(guān)的表現(xiàn)型,加之核桃苗期各品種之間的性狀差異較小,在進行苗木選購時難免出現(xiàn)品種混雜、以次充好的現(xiàn)象,不利于核桃良種的推廣。指紋圖譜是指能夠反映生物個體間差異的電泳圖譜。由于它具有類似人類指紋的高度個體特異性和穩(wěn)定可靠性,故被稱為“指紋圖譜”。分子標記出現(xiàn)后,DNA被迅速用作指紋圖譜分析,稱作DNA指紋圖譜。運用DAN指紋圖譜能進行品種的真實性和純度鑒定,確定品種的親緣關(guān)系,以及用于新品種登記和品種知識產(chǎn)權(quán)保護等。

陳良華等[34]運用RAPD技術(shù)對核桃與鐵核桃特征性條帶進行標記,篩選出的引物D6能擴增出核桃種的一條250bp的特異帶,鐵核桃中沒有,得出D6-250可能為核桃與鐵核桃之間的特異性分子標記,為核桃與鐵核桃種質(zhì)鑒定提供一定的理論依據(jù)。陳少瑜等[35]運用RAPD和ISSR標記分別對云南核桃的11個主要栽培品種進行遺傳多樣性分析,并構(gòu)建這11個品種的指紋圖譜。王紅霞[36]利用AFLP分子標記技術(shù)對普通核桃131份材料的遺傳多樣性進行分析,構(gòu)建了核桃的核心種質(zhì),并對核桃種間的親緣關(guān)系進行研究,將核桃屬8個種分為4個組:黑核桃組,野核桃、吉寶核桃和心形核桃組,鐵核桃、核桃楸和河北核桃組,普通核桃組。陳靜[37]在建立適合核桃的AFLP銀染技術(shù)體系的基礎上,構(gòu)建了58份核桃供試樣品的指紋圖譜,并對其遺傳多樣性進行了分析,揭示了供試材料間遺傳背景的相似性及復雜性,為核桃的品種鑒定和產(chǎn)權(quán)保護提供了理論依據(jù)。

4應用前景

近年來,在人類基因組研究的推動下,NDA分子標記的研究與利用得到迅速發(fā)展,并廣泛應用于農(nóng)業(yè)基礎與實踐。目前,果樹分子標記的研究已取得實質(zhì)性進展,并應用到果樹育種的各個方向。核桃為多年生作物,性周期長,自交結(jié)實率低,個體雜合度高,植株高大,給普通遺傳學的研究帶來困難,由于對親本復雜的遺傳背景缺乏了解,果樹育種中的盲目性很大。分子標記是輔助核桃遺傳育種研究的有力手段,將大大加快核桃育種的進程,縮短育種年限,提高育種效率。

值得指出的是,在真核生物的DNA分子上同時存在著“Junk DAN”、內(nèi)含子和外顯子3種組成,雖然內(nèi)含子也是基因的組成部分,但卻在RNA離開細胞核時,即轉(zhuǎn)錄前被剪除,只有外顯子能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯等步驟形成蛋白質(zhì)。筆者認為,目前開發(fā)的DAN分子標記技術(shù)對這3種組成不能進行識別標記,也就是說呈現(xiàn)的多態(tài)性標記并不能全部轉(zhuǎn)化成為生物的性狀,其中存在著對生產(chǎn)無指導意義的部分。因此,DNA標記技術(shù)的發(fā)展有待于對DAN分子組成部分功能的研究。

分子標記技術(shù)在實際生產(chǎn)中應滿足穩(wěn)定性好、分辨率高、多態(tài)性強和效率高等要求。充分考慮成本與效益等限制問題,該問題的解決有賴于分子生物學和其他相關(guān)學科的相互滲透和相關(guān)人員的更緊密合作。隨著NDA分子標記的廣泛應用、分子生物學及相關(guān)邊緣學科理論與技術(shù)的迅速發(fā)展,必然不斷開發(fā)出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標記。隨著NDA提取、純化的程序化,電泳分析的自動化,數(shù)據(jù)處理計算機化及信息網(wǎng)絡化的進一步發(fā)展,DNA分子標記技術(shù)將在生產(chǎn)中發(fā)揮越來越大的作用。

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