腺病毒－ＶＥＧＦ基因重組體促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣成活的實(shí)驗(yàn)研究

丁　志　鄭江紅　鄧智明　楊松林

[摘要]目的：應(yīng)用大鼠預(yù)構(gòu)皮瓣模型，探討基因治療技術(shù)產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣血管新生和皮瓣存活的可能性，為臨床上尋找加速預(yù)構(gòu)皮瓣成熟的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：20只SD大鼠每只腹部?jī)蓚?cè)各構(gòu)建一個(gè)預(yù)構(gòu)皮瓣，共構(gòu)建40個(gè)皮瓣，每只大鼠兩側(cè)皮瓣按隨機(jī)原則進(jìn)行不同的處理，分別歸于實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M，每組各20個(gè)皮瓣。于大鼠腹部?jī)蓚?cè)各標(biāo)記3cm×2cm矩形預(yù)構(gòu)區(qū),短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側(cè)短邊中點(diǎn)向后縱向切開(kāi)后肢皮膚，剝離出長(zhǎng)約2cm的股動(dòng)靜血管束，遠(yuǎn)端結(jié)扎切斷。在兩側(cè)預(yù)構(gòu)區(qū)域的中軸線上，于真皮與肉膜層間各制作一皮下隧道，實(shí)驗(yàn)組的隧道壁皮下組織內(nèi)注射攜帶有VEGF基因的腺病毒，同法向所有對(duì)照組的隧道壁軟組織內(nèi)注射等量生理鹽水。將已剝離好的血管束向顱側(cè)翻轉(zhuǎn)置入相應(yīng)皮下隧道內(nèi)。所有已植入股血管的預(yù)購(gòu)區(qū)域2周后均被制成以植入血管束為蒂的島狀皮瓣，從兩組中各取一個(gè)皮瓣進(jìn)行免疫組化染色，觀察有無(wú)VEGF生成，其余島狀皮瓣均縫回原處。形成島狀皮瓣后第七天觀察皮瓣存活及血管新生情況。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的皮瓣平均存活率分別為(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血管放射顯影圖上，實(shí)驗(yàn)組植入血管周圍見(jiàn)廣泛白色顯影，尤以血管兩端明顯，而對(duì)照組新生血管顯影僅局限于植入血管周圍；組織學(xué)切片顯示實(shí)驗(yàn)組植入血管周圍新生血管豐富，以毛細(xì)血管為主，并見(jiàn)肉芽成份，對(duì)照組新生血管相對(duì)較少，兩組間新生小血管管腔大小則無(wú)明顯差異；免疫組化檢測(cè)顯示僅實(shí)驗(yàn)組皮瓣中有VEGF表達(dá)。結(jié)論：腺病毒-VEGF基因重組體能通過(guò)促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的血管新生，增加預(yù)構(gòu)皮瓣的存活率。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；預(yù)構(gòu)皮瓣；基因治療；腺病毒

[中圖分類號(hào)]R622 Q813 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）03-0332-04

Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats

DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin

(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,

200233,Shanghai,China)

Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P<0.01). Microangiographic studies showed widespread neovascularisation around the pedicle-especially in the proximal and distal end-in experiment group, but new vessel formation is confined to the vicinity of the pedicle in control group; Histological examination done under high-power magnification(×100) revealed rich vascularity and mild inflammation surrounding the implanted vessel in experiment group, but small amount of new vessel was found in control group. The calibres of the new vessel from two groups were similar; Immunohistochemical stain showed that the VEGF was expressed in the survival tissue of the flap treated with Ad-VEGF, but it was not found in the control group. Conclusion Adenovirus-mediated VEGF gene therapy can increase the survival of prefabricated flaps through inducing regional angiogenesis.

Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus

預(yù)構(gòu)皮瓣應(yīng)用中要解決的重要問(wèn)題是知名血管植入預(yù)構(gòu)區(qū)域后，建立新的血供系統(tǒng)所需時(shí)間較長(zhǎng)。近年來(lái)，有報(bào)導(dǎo)一些多肽類生長(zhǎng)因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通過(guò)直接或間接刺激血管生成作用被用于促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的再血管化進(jìn)程，特別是VEGF能特異性地促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、增加血管通透性,為血管內(nèi)皮的遷移及基質(zhì)形成創(chuàng)造條件，故備受研究者青睞。但生長(zhǎng)因子蛋白半衰期短、療效不穩(wěn)定、需反復(fù)應(yīng)用、副作用多，本研究應(yīng)用基因治療技術(shù)，將人VEGFcDNA 通過(guò)腺病毒載體，一次性注射于大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣血管束周圍軟組織內(nèi)，通過(guò)觀察VEGF 的表達(dá)情況及對(duì)預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化進(jìn)程和成活的影響，探討腺病毒-VEGF基因重組體促進(jìn)血管化和皮瓣成活的可能性。

1材料和方法

1.1 腺病毒-VEGF基因重組體的制備：重組復(fù)制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院細(xì)胞所構(gòu)建。將hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位點(diǎn),并轉(zhuǎn)化DH5進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳證實(shí)hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位點(diǎn)，測(cè)序證實(shí)hVEGF165無(wú)突變。以標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣共沉淀法(Promega, Inc.Kit)轉(zhuǎn)染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317細(xì)胞，通過(guò)G418的集落篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定包裝細(xì)胞上清中病毒的滴度，計(jì)算3個(gè)梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包裝細(xì)胞系集落，在32℃的條件下培養(yǎng)48h。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示hVEGF16經(jīng)過(guò)EcoI和HindIII雙酶切后產(chǎn)生2個(gè)分別約5.4kb和560bp的hVEGF165片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)突變，說(shuō)明腺病毒-VEGF基因重組體構(gòu)建成功。

1.2 動(dòng)物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只體重0.3～0.4kg，每只腹部?jī)蓚?cè)各構(gòu)建一個(gè)預(yù)構(gòu)皮瓣，共構(gòu)建40個(gè)皮瓣，每只大鼠兩側(cè)皮瓣按隨機(jī)原則進(jìn)行不同的處理，分別歸于實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M，每組各20個(gè)皮瓣。1%的氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉(1ml/100mg)、硫化鋇液脫毛及仰臥位固定后，于大鼠腹部?jī)蓚?cè)各標(biāo)記3cm×2cm矩形預(yù)構(gòu)區(qū),短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側(cè)短邊中點(diǎn)向后縱向切開(kāi)后肢皮膚，在顯微鏡下仔細(xì)剝離出長(zhǎng)約2cm的股動(dòng)靜血管束，遠(yuǎn)端結(jié)扎切斷。在兩側(cè)預(yù)構(gòu)區(qū)域的中軸線上，用18G注射器針頭于真皮與肉膜層間各制作一長(zhǎng)2cm、寬0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向?qū)嶒?yàn)組的隧道壁皮下組織內(nèi)注射攜帶有VEGF基因的腺病毒，分4個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1ml濃度為4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有對(duì)照組的隧道壁軟組織內(nèi)注射等量生理鹽水。將已剝離好的血管束向顱側(cè)翻轉(zhuǎn)置入相應(yīng)預(yù)構(gòu)區(qū)的皮下隧道內(nèi)，血管束末端用縫線固定于附近皮膚以防回縮，6-0絲線縫合切口（圖1），動(dòng)物返回籠中。所有預(yù)構(gòu)區(qū)域2周后均沿前述腹部預(yù)構(gòu)區(qū)標(biāo)記線切開(kāi)皮膚，于肉膜層下方剝離形成以植入股血管束為蒂的島狀皮瓣，從兩組中各選一個(gè)皮瓣進(jìn)行免疫組化染色，觀察有無(wú)VEGF生成，其余島狀皮瓣均縫回原處（圖2）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 免疫組化檢測(cè)：血管束植入預(yù)構(gòu)區(qū)域后2周，分別切取Ad-VEGF基因治療組和生理鹽水對(duì)照組中的一個(gè)預(yù)構(gòu)皮瓣進(jìn)行免疫組化檢測(cè)：組織切片經(jīng)脫蠟、浸水處理后用H2O2處理（室溫，10min），應(yīng)用羊血清封閉（37℃，30min）,直接滴加濃度為1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠來(lái)源單克隆抗體，Santa Cruz公司，美國(guó)），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素標(biāo)記為山羊抗鼠，DAKO公司，丹麥），DAB（DAKO公司，丹麥）染色，光鏡下放大100倍觀察有無(wú)棕黃色顆粒表達(dá)從而確定有無(wú)VEGF蛋白生成。

1.3.2 皮瓣存活率：形成島狀皮瓣后第七天，按前述方法麻醉動(dòng)物，相同物距下數(shù)碼相機(jī)拍照后，將圖像輸入KS400 圖像分析系統(tǒng)，經(jīng)圖像增強(qiáng)、分割、待測(cè)面積的二值化處理，精確測(cè)量皮瓣存活部分及壞死部分面積，根據(jù)公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100%，算出兩組各19個(gè)皮瓣的存活率，再計(jì)算各組皮瓣存活率的均數(shù)。

1.3.3 放射顯影：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個(gè)皮瓣，手術(shù)顯微鏡下解剖出蒂部股血管束，分別向兩側(cè)股動(dòng)脈內(nèi)灌注60%泛影葡胺約3ml，結(jié)扎蒂部的股動(dòng)靜脈并切下皮瓣，放射科拍攝鉬靶X光片，獲得植入血管及新生血管的放射顯影圖。

1.3.4 組織學(xué)觀察：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個(gè)皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，經(jīng)酒精梯度脫水二甲苯透明后石蠟包埋，萊卡切片機(jī)切成4μm薄片,蘇木精-伊紅染色封片，光鏡下放大100倍觀察植入的血管束周圍新生的小血管情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)表示為x±s,用SPSS 11.0 版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩兩之間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大體觀察及皮瓣存活率：制成島狀皮瓣后，多數(shù)皮瓣邊緣出現(xiàn)程度不等的青紫腫脹，繼而顏色發(fā)黑干性壞死，有的破潰形成形狀各異的創(chuàng)面，一般5～7天后壞死范圍穩(wěn)定，成活與壞死界限分明，皮瓣成活區(qū)質(zhì)地均柔軟（圖3），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組皮瓣局部可見(jiàn)皮下小血腫。VEGF基因治療組與生理鹽水對(duì)照組皮瓣平均存活率分別為(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，兩組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

2.2血管新生情況：血管放射顯影顯示，實(shí)驗(yàn)組植入血管周圍見(jiàn)廣泛白色顯影，尤以血管兩端明顯，而對(duì)照組新生血管顯影僅局限于植入血管周圍(圖4)；HE染色組織學(xué)切片顯示實(shí)驗(yàn)組植入血管周圍新生血管豐富，以毛細(xì)血管為主，并見(jiàn)肉芽成份，對(duì)照組新生血管相對(duì)較少，兩組間新生小血管管腔大小則無(wú)明顯差異(圖5)。

2.3免疫組織化學(xué)檢查：光鏡下放大100倍觀察來(lái)自兩組的免疫組化染色切片，VEGF基因治療組見(jiàn)到大量棕黃色顆粒表達(dá),彌漫分布于新生小血管周圍，對(duì)照組切片上未看到棕黃色顆粒（圖6）。

3討論

植入血管與皮膚、皮下組織間建立起新的血液循環(huán)是預(yù)構(gòu)皮瓣成功的關(guān)鍵，新血管系統(tǒng)形成的速度、數(shù)量和范圍直接決定著預(yù)構(gòu)皮瓣的成熟時(shí)間和成活范圍，因此如何促進(jìn)植入血管束多形成新生小血管并與皮瓣的小血管之間建立有效的吻合成為當(dāng)前預(yù)構(gòu)皮瓣的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，一些多肽類生長(zhǎng)因子能通過(guò)促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF來(lái)促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的成熟，也取得了預(yù)期效果。研究顯示，VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的血管形成因子，能特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，通過(guò)啟動(dòng)有絲分裂原活化蛋白激酶來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]，其家族中VEGF165在體內(nèi)分布最廣，表達(dá)水平最高。由于VEGF在體內(nèi)的半衰期很短，一般不超過(guò)6min，必須反復(fù)使用才能發(fā)揮其血管生成作用，極為不便，不但增加感染機(jī)會(huì)，而且蛋白價(jià)格昂貴，這些情況限制了臨床應(yīng)用前景。后來(lái)有人曾利用凝膠態(tài)的聚乙烯乙醇作為緩釋劑，試圖延長(zhǎng)VEGF作用時(shí)間，發(fā)現(xiàn)并未提高VEGF的療效[6]。近年來(lái)，日漸成熟的基因重組和轉(zhuǎn)染等生物技術(shù)為VEGF保持其在局部的持續(xù)存在和作用提供了新穎的途徑：將VEGF基因插入到某種載體形成基因重組體，再轉(zhuǎn)染作用部位細(xì)胞，將VEGF基因帶入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞成為 VEGF 的“緩釋庫(kù)”，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不斷產(chǎn)生VEGF蛋白，充分發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。目前該基因治療技術(shù)已被報(bào)道用來(lái)改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自體顆粒脂肪移植成活率[8]，也有學(xué)者用于治療臨床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的療效。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上設(shè)想應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便縮短預(yù)構(gòu)成熟時(shí)間。研究結(jié)果顯示，注射基因重組體后兩周時(shí)的實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本切片免疫組化染色可見(jiàn)大量棕黃色顆粒，證實(shí)pcDNA3/hVEGF165已進(jìn)入血管束周圍細(xì)胞內(nèi)并持久表達(dá)了VEGF蛋白，證明基因治療技術(shù)同樣能保持VEGF在預(yù)構(gòu)皮瓣中的持久存在。在HE染色組織切片及血管放射顯影的光鏡檢查中，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本的新生小血管較對(duì)照組的豐富，說(shuō)明Ad-VEGF基因治療組在局部VEGF的持續(xù)刺激下，誘導(dǎo)形成了大量的新生小血管，有利于預(yù)構(gòu)皮瓣的存活，表現(xiàn)為治療組島狀皮瓣存活率高于對(duì)照組，這些結(jié)果說(shuō)明應(yīng)用基因治療技術(shù)產(chǎn)生VEGF促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣成熟是可行的。

本研究采用腺病毒作為VEGF基因的載體，是因?yàn)槠滢D(zhuǎn)導(dǎo)效率高，而且腺病毒一般不與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色體整合，故比較安全[10]。在HE染色組織切片上，治療組見(jiàn)到明顯炎性肉芽成份，這與以前的有關(guān)研究報(bào)導(dǎo)相符合，可能與腺病毒導(dǎo)致的宿主免疫反應(yīng)[11]有關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)治療組一些皮瓣內(nèi)出現(xiàn)小血腫，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以尋找合宜的劑量和用藥濃度以最大程度的發(fā)揮其促血管生成作用而盡量避免副作用是今后研究的問(wèn)題之一。

建立合理的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪茄芯款A(yù)構(gòu)皮瓣再血管化的前提，以往的預(yù)構(gòu)皮瓣實(shí)驗(yàn)研究中，多是先掀起隨意型皮瓣，然后將血管載體固定于皮瓣肉面，其缺點(diǎn)是手術(shù)創(chuàng)傷大，易引起嚴(yán)重纖維化影響預(yù)構(gòu)皮瓣的質(zhì)地；此外，掀起皮瓣還會(huì)因手術(shù)創(chuàng)傷觸發(fā)內(nèi)源性血管生長(zhǎng)因子產(chǎn)生[12]，干擾對(duì)外源性VEGF發(fā)揮促進(jìn)血管新生作用的觀察。本研究在一期手術(shù)中，并未掀起皮瓣，只是在預(yù)構(gòu)區(qū)域形成一包容血管束的皮下隧道，這無(wú)疑最大程度地減少了內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生，而且手術(shù)創(chuàng)傷小，保證了皮瓣質(zhì)地柔軟，操作也簡(jiǎn)便，有臨床推廣價(jià)值。以往有研究認(rèn)為，VEGF在非缺血組織中生物活性低[13]，本研究預(yù)構(gòu)區(qū)血液循環(huán)良好，VEGF同樣顯示了良好的促進(jìn)血管新生作用，這也許和腺病毒誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。在剝離股血管束時(shí)，我們保留了少許管周組織，以防止損傷血管束內(nèi)動(dòng)、靜脈之間的微細(xì)血管通道[14]，保證移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周組織保留過(guò)多，一部分管周組織會(huì)因?yàn)樵缙谌毖l(fā)生纖維化，從而妨礙血管束新生小血管。血管束植入動(dòng)物肉膜層與真皮層之間，是因?yàn)槿饽觾?nèi)小血管網(wǎng)及真皮下血管網(wǎng)均較豐富，便于新生血管與其吻接溝通，同時(shí)制作島狀皮瓣時(shí)也提供了解剖標(biāo)志。

總之，本研究證明基因治療方法能夠保持VEGF在預(yù)構(gòu)皮瓣中的持久存在，從而促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣血管新生和皮瓣成活，未見(jiàn)明顯并發(fā)癥，為臨床上加速預(yù)構(gòu)皮瓣成熟提供了新的途徑。但腺病毒作為目的基因載體，是否會(huì)使人體基因發(fā)生突變，是否會(huì)導(dǎo)致病毒感染，以及如何提高基因轉(zhuǎn)染效率，尋找恰當(dāng)?shù)慕o藥途徑、用藥劑量與濃度等問(wèn)題尚需要繼續(xù)研究。

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[收稿日期]2008-12-29[修回日期]2009-02-06

編輯/張惠娟