中藥芪紅合劑對腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織中ＰＡＩ－１表達的影響

董華玲　馬　華

[摘要]目的：探討中藥芪紅合劑對腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織中纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）表達的影響，及其對腎間質(zhì)纖維化的作用機制。方法：采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)致腎間質(zhì)纖維化的動物模型， 40只雄性Wistar大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組（A組）、手術(shù)模型組（B組）、芪紅合劑組（C組）、依那普利組（D組）。術(shù)后14 d處死各組大鼠，收集血清、測定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，取結(jié)扎側(cè)腎組織分別用HE、Masson染色，采用免疫組化檢測腎組織中纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）的表達，并用計算機圖像分析系統(tǒng)進行分析。結(jié)果：模型組大鼠腎組織中PAI-1的表達較假手術(shù)組顯著升高，兩治療組較模型組明顯降低。模型組大鼠血肌酐、尿素氮水平較假手術(shù)組明顯增高，兩治療組較模型組顯著下降。結(jié)論：中藥芪紅合劑可降低大鼠血尿素氮、血肌酐水平，并可通過抑制纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）的表達，而起到減輕腎間質(zhì)纖維化病變程度的作用，推測其抑制PAI-1表達上調(diào)的作用可能是其抗腎間質(zhì)纖維化的作用機制之一。

[關鍵詞] 單側(cè)輸尿管結(jié)扎；腎間質(zhì)纖維化；芪紅合劑；纖溶酶原激活物抑制劑-1

[中圖分類號] R285.6 [文獻標識碼]B [文章編號]1674-4721（2009）01（a）-043-03

The effect of Astragalus and Safflower mixture on expression of tissue inhibitors of motalloprotenase in renal tubulointerstitial fibrosis in rats with Unilateral Ureteral Obstruction

DONG Hua-ling1,MA Hua2

(1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030024,China; 2.The Second Hospital of Shanxi Medicine University,Taiyuan 030024,China)

[Abstract] Objective: To observe the effect of Astragalus and Safflower mixture on the expression of PAI-1 in rats with Unilatreal Ureteral Obstruction. To investigate the theraputic effects and its mechanisms of Astragalus and Safflower mixture.Methods: Rat renal interstitial fibrosis model was produced by unilateral ureteral obstruction,40 Wistar male rats were randomly divided into four groups: sham group(A group),UUO group(B group), A&S group(C group) and ACEI group(Dgroup). Sera and kidney tissues were collected from each group on the forteenth day.Bun and Scr were measured.It was carried out to measure the level of tubulointerstitial damage by Masson staining. The expression of PAI-1 in kidneys was analyzed by immunohistochemical method. Results: The expression of PAI-1 and the renal interstitial fibrotic area were highter significantly than that in sham group. Compared with UUO group, those of the treatment groups decreased markedly. The level of BUN and Scr in UUO group were significantly highter than that in sham group.Compared with UUO group,the level of BUN and Scr in treatment groups were significantly lower. Conclusion: Astragalus and Safflower mixture can downregulate the level of BUN and Scr in UUO animal model rats, Astragalus and Safflower mixture can suppress the upregulation of PAI-1 expression in kidneys of UUO animal model rats and decrease their interstitial fibrotic area.It is inferred that it may be one of the mechanisms of Astragalus and Safflower mixture suppressing renal tubular damage and interstitial fibrosis.

[Key words] Unilateral Ureteral Obstruction；Renal tubulointerstitial fibrosis； Astragalus and Safflower mixture； Plasminogen activator inhibitor 1.

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟疾病長期遷延所致，是最終導致慢性腎功能衰竭的主要病理基礎，它以腎小管損傷、腎間質(zhì)炎細胞浸潤、纖維化為特征[1]。

芪紅合劑是在長期的臨床實踐中總結(jié)出的治療腎臟疾病的經(jīng)驗方，在我們的前期研究中，芪紅合劑對單側(cè)輸尿管結(jié)扎致腎間質(zhì)纖維化大鼠模型腎組織的病變程度有一定改善，并可減少結(jié)締組織生長因子（CTGF）和基質(zhì)金屬蛋白組織抑制1（TIMP-1）在腎組織中的表達，本課題旨在研究芪紅合劑對纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）表達的影響，進一步探討芪紅合劑在腎間質(zhì)纖維化中的作用及可能的作用機制，為臨床用藥提供可靠的理論和實驗依據(jù)。

1材料和方法

1．1實驗藥物、試劑

1.1.1 芪紅合劑由黃芪、紅花、大黃、水蛭等組成，按比例稱取后，由山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院中藥制劑室煎制，每毫升藥液中含生藥3.7 g。

1.1.2依那普利佛山雅來制藥有限公司提供，5 mg/粒

1.1.3主要試劑纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1) 免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 動物分組和造模雄性Wistar大鼠40只（由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，二級），體重（150±3） g。常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，隨機分為4組：正常對照組（A組）、手術(shù)模型組（B組）、芪紅合劑組（C組）、依那普利組（D組），每組10只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎致腎間質(zhì)纖維化大鼠模型（UUO），模型制備方法參考文獻[2]。術(shù)前3 d開始灌胃給藥，假手術(shù)組、手術(shù)模型組正常進水進食，中藥治療組每天給予芪紅合劑2 ml/只，西藥治療組按10 mg/kg給予依那普利，每天1次。手術(shù)后第14天以10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動脈采血，分離血清，用于測定血生化指標；摘取左腎分別用10%中性甲醛和4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用于免疫組化分析。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 血生化指標的檢測血尿素氮(BUN)采用二乙酰一肟法、血肌酐(Scr)采用苦味酸不除蛋白法測定。

1.2.2.2 腎組織病理觀察石蠟包埋切片，行HE和Masson染色。光鏡下觀察腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)及變化。Masson染色在400倍光鏡下觀察腎間質(zhì)膠原纖維染色，每組選取8張切片，每張切片選取不重復的8個視野。采用BI2 000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，計算腎間質(zhì)Masson染色陽性面積及陽性面積占整個視野百分比。

1.2.2.3 腎組織PAI-1免疫組織化學觀察腎組織中PAI-1免疫組化采用SABC法，采用BI2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，在400倍光鏡下測量每個顯示屏的陽性染色面積和染色強度(平均光密度)。每組選取8張切片，每張切片測量8個視野進行半定量分析。

1.2.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件處理，結(jié)果均以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩間比較采用SNK-q檢驗。

2結(jié)果

2.1 腎功能檢測結(jié)果

模型組尿素氮和血肌酐均較假手術(shù)組升高，兩治療組較模型組呈下降，提示中藥芪紅合劑及依那普利均能降低梗阻性實驗大鼠血尿素氮、血肌酐水平。見表1。

2.2腎臟病理觀察結(jié)果

肉眼觀察可見：假手術(shù)組腎臟大小形態(tài)正常，顏色暗紅，模型組結(jié)扎側(cè)腎臟體積明顯腫大，內(nèi)含混濁尿液，顏色變淺，腎實質(zhì)變薄，腎盂擴張。

光鏡下HE染色結(jié)果：假手術(shù)組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列緊密、整齊；手術(shù)模型組可見腎小管排列紊亂，彌漫的腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性，多數(shù)腎小管擴張、部分萎縮，偶見壞死，腎間質(zhì)增寬，腎小管間質(zhì)中有炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化，治療組上述改變均較模型組減輕。

Masson染色示：假手術(shù)組腎臟有膠原染色主要位于腎小球基膜、Bowman囊、系膜區(qū)和腎小管的毛細血管周圍；模型組可見腎間質(zhì)增寬，大量膠原纖維增生，間質(zhì)膠原纖維呈藍色染色，間質(zhì)纖維化呈灶狀分布，腎小球病變不明顯，治療組上述改變均有所減輕。結(jié)果見表2。

2.3腎組織中PAI-1的免疫組化分析

假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細胞胞漿有少量PAI-1表達，腎小球和腎間質(zhì)細胞少見PAI-1表達。模型組可見PAI-1表達較假手術(shù)組明顯增強，主要在皮髓交界的腎小管間質(zhì)區(qū)以及腎小管上皮細胞表達明顯。治療組較模型組表達明顯減弱，但仍未達到假手術(shù)組水平。結(jié)果見表3。

3討論

腎間質(zhì)纖維化是各種原因造成的腎小管及間質(zhì)病變的最終結(jié)果，也是導致終末期腎衰的主要原因之一。細胞外基質(zhì)（ECM）的大量沉積是腎間質(zhì)纖維化形成的主要機制[3]?，F(xiàn)已證實ECM的降解減少是引起ECM積聚的主要原因[4]。

調(diào)節(jié)ECM降解主要為凝血纖溶系統(tǒng)和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)，其中尤以凝血纖溶系統(tǒng)更為重要。已知纖溶系統(tǒng)在組織重塑、血栓溶解、基質(zhì)降解中具有重要作用，纖溶酶除可直接降解ECM，還可促進基質(zhì)金屬蛋白酶家族的表達上調(diào)[5]。纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）是纖溶酶原激活物（PA）的生理性特異抑制物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四種不同類型的PAI(PAI-1、PAI-2、PAI-3、PAI-4)，均有抑制PA的作用，其中PAI-1是PAI的主要形式，也是PA最重要的抑制劑，能抑制PA對纖溶酶原的活化，從而抑制纖維蛋白水解和ECM降解，導致組織器官硬化、纖維化。馬宏[6]等通過對腎病大鼠腎組織中尿激酶纖溶酶原激活物及其抑制物表過特點的研究發(fā)現(xiàn)，在腎病大鼠的腎組織中PAI-1表達上調(diào)；Ishidoya[7]等用RT-PCR和免疫組化的方法，在梗阻后1~10 d，發(fā)現(xiàn)梗阻腎中PAI-1mRNA的表達明顯上調(diào)，而對照組腎組織中的PAI-1mRNA無明顯變化。這些研究都表明PAI-1的表達上調(diào)在腎間質(zhì)纖維化中起著重要作用。

腎間質(zhì)纖維化在中醫(yī)屬于“水腫”、“癃閉”、“關格” 等疾病的范疇。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學微觀發(fā)病機制，根據(jù)中醫(yī)“久病多虛”、“久病入絡”、“病久多瘀”的理論，我們認為本病屬于中醫(yī)氣虛血瘀、痰瘀互結(jié)、蘊久化毒為害所致。在長期臨床實踐中，根據(jù)病癥結(jié)合、整體調(diào)節(jié)的理論，對各種慢性腎臟疾病運用扶正活血、化瘀通絡之法，選用基礎方芪紅合劑進行辨證治療，能夠有效的改善患者的臨床癥狀，延緩病情的進展，提高患者的生存質(zhì)量。

芪紅合劑是以黃芪、紅花、大黃、水蛭等為主組成，方中黃芪扶正固本，現(xiàn)代藥理研究證實有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化作用，可通過對多種細胞因子的調(diào)節(jié)作用，減少蛋白尿，保護腎臟。黃芪藥物血清能抑制PAI-1基因表達的上調(diào)，達到抗纖維化作用[8-9]。紅花、水蛭活血化瘀，有研究發(fā)現(xiàn)紅花對損傷的腎小管上皮細胞具有保護作用[10]，水蛭是經(jīng)典的破血逐瘀藥，其主要成分水蛭素是天然凝血酶拮抗劑，以水蛭為主藥的復方可以下調(diào)5/6腎切除大鼠殘腎中TGF-β1、PAI-1mRNA的表達，從而延緩腎小球硬化[11]。大黃解毒瀉熱，可抑制腎小球上皮細胞的肥大和增殖，抑制體內(nèi)蛋白分解，降低血肌酐和尿素氮的生成[12]。同時大黃還可降低PAI-1活性，增加細胞外基質(zhì)降解[13]。全方配伍可攻補兼施，攻邪而不傷正，扶正又不助邪，共奏益氣活血、化瘀通絡之效。

單側(cè)輸尿管梗阻是公認的腎間質(zhì)纖維化的較好模型，可以導致嚴重的腎小管間質(zhì)病變而腎小球不受影響，在本研究中觀察到，梗阻后的大鼠腎組織中大量炎癥細胞浸潤，腎小管擴張，壞死，腎間質(zhì)增寬以及間質(zhì)纖維化。提示該模型制備成功。在研究中我們觀察了纖溶酶原激活物抑制劑－1（PAI－1）在腎組織中的變化，我們發(fā)現(xiàn)中藥芪紅合劑和依那普利均可抑制PAI-1在UUO大鼠腎組織中表達的上調(diào)。提示中藥芪紅合劑可能通過抑制PAI-1在UUO大鼠腎組織中的表達，延緩腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化的進展。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)中藥芪紅合劑與依那普利均可通過下調(diào)UUO術(shù)后大鼠的血肌酐和尿素氮水平，明顯改善其腎功能，并可通過下調(diào)PAI-1在腎組織中的表達減輕腎小管損傷和間質(zhì)纖維化，提示抑制PAI-1的表達上調(diào)是中藥芪紅合劑抗腎小管間質(zhì)損傷的作用機制之一。

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（收稿日期：2008-12-18）