龍腦樟揮發(fā)油對大鼠離體頸總動脈環(huán)的作用

魯杰 馬國祥 江健 胡繼川

摘要?目的：建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）聯(lián)用分析鑒定龍腦樟揮發(fā)油（VOCC）的化學(xué)成分的方法，探討VOCC對大鼠頸總動脈的張作用。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取，無水硫酸鈉脫水-4 ℃冰箱中重結(jié)，通過GC-MS對VOCC進行成分分析，結(jié)合計算機檢索對分離的化合物進行結(jié)構(gòu)分析與鑒定，色譜峰面積采用歸一化法計算各組分的相對含量;將大鼠頸總動脈血管環(huán)制成無內(nèi)皮和含內(nèi)皮2種標本，以苯腎上腺素（PE）為血管收縮劑，觀察VOCC對大鼠離體血管環(huán)預(yù)收縮的作用。結(jié)果：共分離得到45個化學(xué)成分，鑒定得到相似度在90%以上的40個化合物，占總VOCC的99.86%，天然冰片的相對含量最高，占總VOCC的93.49%;VOCC能抑制PE所致的頸總動脈收縮，且無內(nèi)皮依賴性，VOCC對勁總動脈血管的舒張作用呈明顯劑量依賴性。結(jié)論：在本實驗條件下，天然冰片得到了基線分離，此方法可用于天然冰片原料和制劑的定量分析;VOCC對PE誘導(dǎo)的血管收縮具有顯著拮抗作用，提示其具有較好的擴血管作用。

關(guān)鍵詞?龍腦樟;天然冰片;氣相色譜-質(zhì)譜;大鼠;頸總動脈血管;收縮;舒張;作用機制

Abstract?Objective：To establish a gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）combined analysis method to identify the chemical constituents of Volatile Oil of Cinnamomum Camphora（VOCC），and to explore the effects of VOCC on the common carotid artery in rats.Methods：The method of our study were as follows：extracted by steam distillation，dehydrated in anhydrous sodium sulfate dehydrated in -4 ℃ refrigerator，analyzed the composition of VOCC by GC-MS，combined with computer search to analyze and identify the separated compounds.The relative content of each component was calculated by one-step method; the rat common carotid artery vascular ring was made into endothelium-free and endothelium-containing specimens，and phenylephrine（PE）was used as a vasoconstrictor to observe VOCC on role of ring pre-contraction on isolated rat blood vessels.Results：A total of 45 chemical components were isolated，and 40 compounds identified were with a similarity above 90%，accounting for 99.86% of the total VOCC.Natural borneol had the highest relative content，accounting for 93.49% of the total VOCC; VOCC could inhibit PE common carotid artery contracted without endothelium dependence，and the vasodilator effect of VOCC on the common arterial artery was obviously dose-dependent.Conclusion：Under this experimental condition，natural borneol is separated from the baseline.This method can be used for quantitative analysis of natural borneol raw materials and preparations.VOCC has a significant antagonistic effects on PE-induced vasoconstriction，suggesting that it has a good vasodilator effects.

Keywords?Cinnamomum Camphora; Borneol; GC-MS; Rats; Common Carotid Artery; Systole; diastole; Action mechanism

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.016

龍腦樟（Cinnamomum camphora chvar.Borneol）是上世紀八十年代在湖南新晃發(fā)現(xiàn)的，目前該種被認為是樟[Cinnamomum camphora（L.）Presl]的一種化學(xué)型[1]，其新鮮枝、葉提取得到的揮發(fā)油中富含右旋龍腦，是目前天然冰片的最佳植物原料。且自古就是一種高級香料，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香料、化妝品、食品工業(yè)等行業(yè)[2-3]。

天然冰片又叫天然右旋龍腦，其氣清香，味辛、涼，歸心、脾、肺經(jīng)，具有通諸竅、消腫止痛、散郁火、去臀明目、開竅醒神等功效[4-5]。天然冰片在我國有2 000多年的用藥歷史，是安宮牛黃丸、六神丸、丹參滴丸等中華國藥之瑰寶的主要組分，其作為佐藥治療心血管疾病在臨床上廣泛應(yīng)用[6-8]，但有關(guān)VOCC對離體血管的作用及機制尚未見報道。

歷史上天然冰片主要是來自于龍腦香科龍腦香（Dryobalanops aromatica Gaertn.f.）樹的樹脂提取物，該植物主要分布在印尼的蘇門答臘群島，我國長期依賴進口。自我國發(fā)現(xiàn)龍腦樟后，其已成為我國天然冰片的主要植物來源。由于龍腦樟地理分布范圍較廣，在我國長江流域及華南地區(qū)均有零星分布，且其呈化學(xué)多型性，導(dǎo)致種內(nèi)形成了豐富的遺傳變異，不同產(chǎn)地的龍腦樟樹種品質(zhì)以及龍腦含量均存在較大的差異[9]，這直接影響到以天然冰片入藥的制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性。因此本實驗采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、計算機聯(lián)用的方法對從湖南引種栽培的VOCC化學(xué)成分進行了分析，為控制天然冰片的質(zhì)量提供理論依據(jù);通過VOCC作用于大鼠離體頸總動脈環(huán)，觀察其對頸動脈血管的擴張作用，為進一進探討其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SD成年健康SPF級大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（240±10）g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2011-0003，常規(guī)實驗室恒溫恒濕環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食，12 h/12 h晝夜交替。

1.1.2?藥物?龍腦樟新鮮枝、葉于2018年5月采自湖南省新晃龍腦開發(fā)有限責任公司龍腦樟種植基地，并由對材料進行分類學(xué)鑒定為樟科龍腦樟（Cinnamomum camphora chvar.Borneol）。

1.1.3?試劑與儀器?氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司，型號：Agilent 7890B GC-5977A MS），全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海摩速科學(xué)器材有限公司，型號：SGW-1），臺式高速離心機（美國ThermoFisher公司，型號：Heraeus Mutifuge XIR），超純水機（上海必能信有限公司，型號：D-1006-D2），100～1 000 μL、20～200 μL、5～50 μL，移液槍（德國BRAND公司，型號：M8-50），四腔器官浴槽系統(tǒng)（成都儀器廠，型號：SQG-4型），生物信號采集處理系統(tǒng)（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司，型號：DB088）。苯腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，批號：080311），乙酰膽堿（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：080424），酚妥拉明注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準字H31020589），硝苯地平（山西云鵬制藥有限公司，國藥準字H14020798），K-H營養(yǎng)液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：080114），本實驗所用提取分離試劑均為分析純。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?參照文獻方法[10]，制備保留內(nèi)皮和去內(nèi)皮血管環(huán)標本。大鼠處死后迅速取出雙側(cè)頸動脈，預(yù)冷后置于K-H液中（恒溫37 ℃，95% O2+5%CO2混合氣體飽和液），去除血管上的脂肪及結(jié)締組織，將動脈剪成3 mm左右的環(huán)，制備成保留內(nèi)皮血管環(huán)備用;取部分頸動脈環(huán)用棉簽插入血管腔輕輕旋轉(zhuǎn)并前后移動2～3次，制備成去內(nèi)皮血管環(huán)標本備用。血管環(huán)制備好后懸掛于浴槽內(nèi)，血管一端固定于浴槽內(nèi)，另一端與張力換能器連接，采用生物信號采集系統(tǒng)采集和記錄張力的變化。浴槽內(nèi)K-H液保持恒溫37 ℃、持續(xù)通入95%O2+5% CO2的混合氣體，共平衡60 min，平衡結(jié)束后，按實驗要求進行分組處理，平衡期間每15 min換恒溫37 ℃的K-H液1次。

1.2.2?給藥方法?采用水蒸氣蒸餾法提取。稱取新鮮龍腦樟枝、葉200 g剪碎后置于VOCC提取裝置中，加重蒸水2 L，蒸餾提取2 h，提取物用無水硫酸鈉脫水后置于-4 ℃冰箱中重結(jié)晶24 h后稱重，用乙酸乙醋溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容、備用。

1.2.3?檢測指標與方法?GC-MS測試分析：VOCC經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析鑒定，檢出的峰得到GC-MS指紋色譜圖，對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)美國NIST 05標準質(zhì)譜庫檢索及人工解析確定各化學(xué)成分，按峰面積歸一化法求得各化學(xué)成分的相對質(zhì)量百分含量。GC-MS條件：色譜柱DB-624毛細管柱30 m×0.25 mm×1.40 μm）;柱溫起始溫度60 ℃恒溫3 min后以20 ℃/min速率升溫至220 ℃，恒溫5 min后以5 ℃/min速率升溫至280 ℃，恒溫4 min，流速1 mL/min，進樣口溫度280 ℃，進樣量1 μL;電離方式EI、離子源溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍：50～400 amu全掃描，溶劑切除時間3.5 min。血管環(huán)內(nèi)皮完整性檢驗：將制備好的保留內(nèi)皮和去內(nèi)皮血管環(huán)標本用90 mmol/L KCl刺激血管環(huán)20 min后用KH液洗脫，重復(fù)3次，以誘發(fā)血管最大張力，待血管收縮到基礎(chǔ)狀態(tài)并穩(wěn)定后，用PE 1×10-6 mol/L預(yù)收縮動脈環(huán)，待收縮穩(wěn)定后，加入Ach 10-5 mol/L，若加入Ach后使血管環(huán)舒張、且血管舒張達50%以上，表明內(nèi)皮完整;反之，則認為內(nèi)皮已去除。VOCC對PE致血管環(huán)舒張的作用：取上述符合要求的內(nèi)皮完整的血管環(huán)標本，待血管環(huán)收縮穩(wěn)定后，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、陽性藥對照組（PHE組）、藥物組高（1.80 mmol/L）、中（1.20 mmol/L）、低劑量組（0.6 mmol/L）。各組浴槽中加入終濃度為1×10-6 mol/l的PE刺激血管環(huán)收縮，等血管環(huán)收縮張力穩(wěn)定后進行加藥實驗。藥物組：精密稱取2.0 gVOCC溶于無水乙醇中，制成終濃度為0.60、1.20、1.80 mmol/LVOCC混合液，分別取400 μL加入到浴槽中;PHE組加入400 μL PHE溶液（濃度為8×10-6μmol/L）;空白對照組往浴槽中加入400 μL無水乙醇（濃度為4.45 mmol/L）。記錄各組給藥5 min后的舒張率，計算各組舒張率[11]。舒張率=（收縮最大張力-舒張最小張力）/（收縮最大張力-初始張力）×100%。VOCC擴血管活性的量效評價：按以上方法，分別取400 μL終濃度為0.4、0.60、0.8、1.0、1.20、1.4、1.6、1.80 mmol/L加入到浴槽中，觀察記錄血管收縮情況。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用例（%）表示，進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?VOCC的提取?重結(jié)晶后所得的白色結(jié)晶體即為VOCC。200 g的新鮮龍腦樟枝、葉得揮發(fā)油2.72 g。經(jīng)公式：VOCC提取率（%）=VOCC的質(zhì)量/龍腦樟枝、葉的質(zhì)量×100%，計算出龍腦樟提取率為1.36%（w/w）。

2.2?GC-MS指紋色譜圖?按“2.2”項的GC-MS條件對VOCC進行分析，得到其總離子流圖，結(jié)果見圖1。

2.3?VOCC的化學(xué)成分?VOCC經(jīng)GC-MS分析得到45個化合物，通過鑒定得到相似度在90%以上的40個化合物，占總VOCC的99.86%，其主要成分為天然冰片，占總成分的93.49%，其次為：樟腦占總VOCC的1.16%、β-石竹烯占總VOCC的0.73%、α-石竹烯占總VOCC的0.72%。結(jié)果顯示，VOCC中天然冰片的含量非常高。所鑒定的VOCC中的化學(xué)成分及所得的各化學(xué)成分在VOCC中的相對峰面積百分含量見表1。

2.4?VOCC對PE所致血管環(huán)收縮的作用?經(jīng)陽性藥PHE和不同劑量藥物作用后，含內(nèi)皮和去內(nèi)皮各組的血管環(huán)張力均不同程度降低，與空白對照組比較，除藥物低劑量外，PHE組和藥物高、中劑量組的血管舒張率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與PHE組比較，藥物高、中劑量組的血管舒張率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.01）。提示VOCC能抑制PE所致的頸總動脈收縮，且無內(nèi)皮依賴性。結(jié)果見表2、表3。

2.4?VOCC擴血管活性的量效曲線?VOCC對勁總動脈血管的舒張作用呈明顯劑量依賴性，在0.1～1.5 mmol/L范圍內(nèi)時，隨著給藥濃度增加，VOCC擴血管作用呈明顯增長趨勢;在1.5～2.1 mmol/L范圍內(nèi)，隨著給藥濃度增加，其擴血管作用增加較緩;當給藥濃度為1.5 mmol/L時，舒張率最大可達70.46%。見圖2。

3?討論

在VOCC提取過程中，我們采取水蒸氣蒸餾法進行提取，經(jīng)乙醚萃取后所得VOCC經(jīng)GC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)所得VOCC中天然冰片的含量與未經(jīng)乙醚萃取組含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義[12-14]。因此，本實驗VOCC提取后直接采用無水硫酸鈉脫水后重結(jié)晶，所得VOCC中天然冰片含量高，此方法可節(jié)約提取時間、降低生產(chǎn)成本，可有效應(yīng)用于天然冰片的工業(yè)化生產(chǎn)中。

龍腦樟中天然冰片的提取及含量測定的色譜方法研究較多，但目前文獻報道所得的天然冰片的含量均在60%以下。本研究所采用的VOCC的提取方法得油率高（1.36%）;所采用GC-MS色譜分析鑒定方法，鑒定出VOCC含有40種成分，均為萜類成分[15];本研究中采用的GC條件使天然冰片得到了基線分離，其相對含量高達93.49%%。提示本提取、分析的工藝方法可用于天然冰片原料和制劑的定量分析。

天然冰片的主要來源植物為龍腦樟，龍腦樟揮發(fā)油中的主要成分為天熱冰片[16]。天然冰片屬于名貴中草藥材，在《本草綱目》中提到：“龍腦者，以白瑩如冰及作梅花片者為良，故俗呼為冰片腦”。天然冰片具有開竅醒神、清熱止痛的功效[17-18]?，F(xiàn)代藥理研究證實，天然冰片具有抗病原微生物，抗炎鎮(zhèn)痛的作用，并且可提高血管壁通透性的[19]。PE可誘導(dǎo)血管收縮，其誘導(dǎo)血管收縮主要通過激活血管平滑肌α受體，打開慢鈣通道，使細胞外鈣內(nèi)流致胞質(zhì)中鈣濃度提高，收縮力增強，從而達到血管收縮的作用[20]。本實驗結(jié)果表明，VOCC中高劑量組均能明顯拮抗PE所致的血管收縮，無內(nèi)皮依賴性，提示了VOCC誘發(fā)血管舒張可能與受體依賴性鈣通道和細胞內(nèi)Ca2+釋放的抑制有關(guān)。研究結(jié)果顯示，VOCC對頸總動脈血管具有顯著的舒張作用，且呈明顯的劑量依賴性，這可能是因為天熱冰片具有對鈣拮抗作用，可直接作用于血管平滑肌，抑制Ca2+的釋放，從而降低細胞內(nèi)Ca2+的濃度水平，進而使血管平滑肌舒張。

綜上所述，采用GC-MS法對從湖南引種栽培的VOCC化學(xué)成分進行了分析，對于充分提高龍腦樟植物資源的利用率有著十分重要的意義，VOCC具有擴血管作用，可為其用于臨床治療心腦血管疾病提供了基礎(chǔ)。

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（2019-03-25收稿?責任編輯：王明）