斜紋夜蛾SlbHLH互作蛋白的篩選與驗(yàn)證

摘要

為探索斜紋夜蛾Spodoptera litura bHLH轉(zhuǎn)錄因子在斜紋夜蛾響應(yīng)微生物農(nóng)藥脅迫過(guò)程中的作用，采用酵母雙雜交技術(shù)，以SlbHLH為誘餌蛋白，篩選經(jīng)微生物農(nóng)藥處理后的斜紋夜蛾cDNA文庫(kù)。經(jīng)測(cè)序和BLAST比對(duì)分析，初步篩選出38個(gè)與SlbHLH互作的蛋白。通過(guò)酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)試驗(yàn)，驗(yàn)證了候選互作蛋白SlCDA、SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP、SlTRYP與SlbHLH之間的互作關(guān)系。經(jīng)金龜子綠僵菌、短穩(wěn)桿菌和蘇云金芽胞桿菌處理后的RTqPCR結(jié)果表明，在一定微生物農(nóng)藥及其配套處理模式下，SlbHLH的表達(dá)趨勢(shì)與SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP的表達(dá)趨勢(shì)一致，與SlTRYP的表達(dá)趨勢(shì)相反，預(yù)示互作蛋白與SlbHLH可能共同參與調(diào)控斜紋夜蛾對(duì)微生物農(nóng)藥脅迫的響應(yīng)過(guò)程。本研究為解析斜紋夜蛾bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其互作蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

斜紋夜蛾; bHLH轉(zhuǎn)錄因子; 酵母雙雜交; 互作蛋白; 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：

S 4334

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024430

Screening and validation of SlbHLHinteracting proteins in Spodoptera litura

WU Shuang， LUO Yunmi， ZENG Zhihong， WANG Rongsheng， YU Ying， CHEN Lei*

（Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 401329， China）

Abstract

To explore the role of the bHLH transcription factor in the response of Spodoptera litura to microbial pesticide stress， yeast twohybrid assay was carried out to screen the cDNA library constructed from microbial pesticidetreated S.litura using SlbHLH as the bait. Through sequencing and BLAST analysis， a total of 38 candidate interacting proteins were initially identified. Pointtopoint yeast twohybrid assays confirmed the interactions between SlbHLH and SlCDA， SlCHIT， SlFCP， SlHEMO， SlLCP， and SlTRYP. RTqPCR analysis following treatment with Metarhizium anisopliae， Empedobacter brevis and Bacillus thuringiensis revealed that the expression patterns of SlbHLH were consistent with those of SlCHIT， SlFCP， SlHEMO， and SlLCP， but opposite to that of SlTRYP under specific microbial pesticide stresses and treatment conditions. These results suggest that SlbHLH and its interacting proteins may collaboratively regulate the response of S.litura to microbial pesticide stress. This study provides a foundation for further elucidating the biological functions of the bHLH transcription factor and its interacting proteins in S.litura.

Key words

Spodoptera litura; bHLH transcription factor; yeast twohybrid; interacting protein; gene expression

斜紋夜蛾Spodoptera litura隸屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一種世界性分布的害蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)寄主范圍廣，取食植物多達(dá)390余種，其中包括290余種農(nóng)作物［1］。斜紋夜蛾產(chǎn)卵量大、幼蟲(chóng)具暴食性，且抗藥性強(qiáng)，防治難度大，給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失［2］。斜紋夜蛾除對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性外，在部分地區(qū)對(duì)蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis等微生物農(nóng)藥也產(chǎn)生了抗性［3］。研究表明，昆蟲(chóng)通過(guò)分布于脂肪體、血淋巴細(xì)胞表面或游離血淋巴中的C型凝集素、半乳糖凝集素、清道夫受體等識(shí)別外源病原微生物，進(jìn)而激活體內(nèi)的細(xì)胞免疫或體液免疫過(guò)程，促進(jìn)吞噬、集結(jié)和包囊作用，激活溶酶體和溶菌酶介導(dǎo)的蛋白分解等過(guò)程來(lái)抵御微生物侵染［46］。因此，研究斜紋夜蛾對(duì)微生物農(nóng)藥脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)發(fā)掘新的斜紋夜蛾防治靶標(biāo)、開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥等具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

堿性螺旋環(huán)螺旋bHLH（basic helixloophelix）轉(zhuǎn)錄因子是一類古老而保守的蛋白家族，其廣泛參與真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控過(guò)程［78］。根據(jù)序列相似性和結(jié)構(gòu)特征，研究者們將動(dòng)物bHLH轉(zhuǎn)錄因子劃分為A～F共6組［9］。對(duì)昆蟲(chóng)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究表明，家蠶Bombyx mori絲腺A組bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage和Bmdimm共同參與調(diào)控絲素重鏈基因flbH的表達(dá)［10］，并且，Bmsage還參與決定絲腺的細(xì)胞數(shù)量［11］。果蠅Drosophila C組bHLH轉(zhuǎn)錄因子Sim和Trh參與調(diào)控氣管形成及中線發(fā)育［1213］;果蠅E組bHLH轉(zhuǎn)錄因子Dpn和spl參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和分化［14］。飛蝗Locusta migratoria C組bHLH轉(zhuǎn)錄因子LmAhR參與了對(duì)毒死蜱的解毒代謝過(guò)程［15］。褐飛虱Nilaparvata lugens C組bHLH轉(zhuǎn)錄因子Nlss參與調(diào)控觸角和翅的發(fā)育［16］。C組bHLH轉(zhuǎn)錄因子HIF1α參與調(diào)控橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis對(duì)缺氧環(huán)境的耐受性［17］。對(duì)德國(guó)小蠊Blattella germanica、白蟻Prorhinotermes simplex、二化螟Chilo suppressalis、異色瓢蟲(chóng)Harmonia axyridis、沙蔥螢葉甲Galeruca daurica等昆蟲(chóng)的研究表明，C組bHLH轉(zhuǎn)錄因子Met參與調(diào)控發(fā)育和雌性繁殖過(guò)程［1821］。對(duì)斜紋夜蛾的研究表明，在正常發(fā)育情況下，5齡和6齡幼蟲(chóng)B組bHLH轉(zhuǎn)錄因子SlMondo及E組的SlCwo和SlHespl3在脂肪體和中腸中表達(dá)水平較高。在感染病原微生物后，B組SlbHLHs的表達(dá)差異數(shù)目更多;感染蘇云金芽胞桿菌后，中腸SlbHLHs表達(dá)下調(diào);感染核型多角體病毒后，脂肪體中SlCwo表達(dá)上調(diào)［22］。近年來(lái)，關(guān)于植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與防御病原微生物的報(bào)道層出不窮［2327］。然而，斜紋夜蛾bHLH是否也參與調(diào)控對(duì)病原微生物的免疫反應(yīng)，尤其是是否啟動(dòng)了昆蟲(chóng)對(duì)微生物侵染的應(yīng)答，尚不清楚。

酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用的有效方法之一，其原理是將待測(cè)蛋白分別融合到酵母表達(dá)質(zhì)粒的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活域上，形成融合表達(dá)載體，當(dāng)待測(cè)蛋白成功結(jié)合，則能啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而證明待測(cè)蛋白之間存在互作關(guān)系［28］。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于互作蛋白的篩選與驗(yàn)證、蛋白互作機(jī)理的探索、蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖譜繪制等研究［2935］。本研究從微生物農(nóng)藥脅迫處理的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中篩選與SlbHLH互作的蛋白，為解析SlbHLH轉(zhuǎn)錄因子的免疫調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斜紋夜蛾幼蟲(chóng)采自國(guó)家農(nóng)作物蔬菜改良中心重慶分中心（29°29′N，106°20′E，海拔295 m），在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用人工飼料［36］飼養(yǎng)10代以上，飼養(yǎng)溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度65%～75%，光周期L∥D=12 h∥12 h。分別采用200×107個(gè)/mL金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421油分散制劑（重慶聚立信生物工程有限公司）、625×107個(gè)/mL短穩(wěn)桿菌Empedobacter brevis GXW154懸浮劑（鎮(zhèn)江市潤(rùn)宇生物科技開(kāi)發(fā)有限公司）和250 mg/mL蘇云金芽胞桿菌B.thuringiensis可濕性粉劑（康欣生物科技有限公司）處理幼蟲(chóng)。為模仿斜紋夜蛾接觸微生物農(nóng)藥的不同方式，將處理分為3組，第1組為直接處理組：將10頭4齡幼蟲(chóng)分別浸沒(méi)于上述濃度的微生物農(nóng)藥溶液中，停留10 s取出，置于濾紙上室溫下晾干后用人工飼料繼續(xù)飼養(yǎng)，以蒸餾水替代微生物農(nóng)藥處理的幼蟲(chóng)作為對(duì)照;第2組為間接處理組：將10 cm3大小的人工飼料分別浸沒(méi)于上述濃度的微生物農(nóng)藥溶液中，停留10 s取出，置于濾紙上室溫下晾干后飼養(yǎng)10頭4齡幼蟲(chóng)，以蒸餾水替代微生物農(nóng)藥處理飼料飼養(yǎng)幼蟲(chóng)作為對(duì)照;第3組為綜合處理組：分別將10頭4齡幼蟲(chóng)和10 cm3大小的人工飼料浸沒(méi)于上述濃度的微生物農(nóng)藥溶液中，停留10 s取出，置于濾紙上室溫下晾干，用被微生物農(nóng)藥處理過(guò)的飼料飼養(yǎng)被微生物農(nóng)藥處理過(guò)的幼蟲(chóng)，以蒸餾水替代微生物農(nóng)藥處理飼料和幼蟲(chóng)作為對(duì)照。當(dāng)各處理組的人工飼料耗盡時(shí)，均以未經(jīng)微生物農(nóng)藥處理的人工飼料進(jìn)行補(bǔ)給。每組處理重復(fù)3次。收集處理后24 h和72 h的幼蟲(chóng)，置于-80℃?zhèn)溆谩2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞、pGBKT7、pGADT7、pGBKT753、pGADT7T、pGBKT7Lam、酵母缺陷型培養(yǎng)基、Xαgal等購(gòu)自Clontech公司。

1.2 總RNA提取與cDNA文庫(kù)構(gòu)建

取11各組中處理后24 h和72 h的斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)各1頭，用TRIzol法提取混樣總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。使用cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Clontech，630490）合成dscDNA，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。經(jīng)DSN酶均一化處理后，將dscDNA分別連接至線性化的pGADT7Smal1、pGADT7Smal2和pGADT7Smal3，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞（DH10B）。庫(kù)容量鑒定公式：文庫(kù)滴度（cfu/mL）=每板單菌落數(shù)/涂板菌液體積（mL）×稀釋倍數(shù)，文庫(kù)總庫(kù)容量（cfu）=文庫(kù)滴度（cfu/mL）×文庫(kù)菌液總體積（mL）。挑取平板上的單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并電泳檢測(cè)文庫(kù)片段長(zhǎng)度和陽(yáng)性率，陽(yáng)性率=重組成功數(shù)量/克隆總數(shù)×100%。

1.3 誘餌載體構(gòu)建、自激活檢測(cè)及毒性檢測(cè)

從微生物農(nóng)藥脅迫后的斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）中篩選到在一定微生物農(nóng)藥及其配套處理模式下表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子SlbHLH（NCBI登錄號(hào)：XM_022978466），該SlbHLH屬于E組bHLH。設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增SlbHLH全長(zhǎng)序列并構(gòu)建誘餌重組質(zhì)粒，再將誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7SlbHLH+pGADT7、陽(yáng)性對(duì)照pGBKT753+pGADT7T、陰性對(duì)照pGBKT7Lam+pGADT7T分別共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后分別涂布于SD/Leu/Trp（DDO）、SD/Leu/Trp/His（TDO）、SD/Leu/Trp/His/3AT（TDO/3AT）和SD/Leu/Trp/His/Ade（QDO）培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)4 d。判斷誘餌蛋白毒性和自激活的標(biāo)準(zhǔn)為：DDO培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，則誘餌蛋白無(wú)毒性;TDO培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，則誘餌蛋白存在自激活;TDO/3AT（5 mmol/L）培養(yǎng)基上不長(zhǎng)斑，則表明5 mmol/L 3AT可以抑制誘餌蛋白自激活，抑制HIS3報(bào)告基因的背景表達(dá)，QDO培養(yǎng)基上不長(zhǎng)斑，則誘餌蛋白不能激活報(bào)告基因ADE2表達(dá)，兩者同時(shí)滿足則在該條件下誘餌蛋白不存在自激活現(xiàn)象。

1.4 SlbHLH互作蛋白篩選

采用質(zhì)粒大量提取試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］提取cDNA文庫(kù)質(zhì)粒，再用含有pGBKT7SlbHLH的Y2HGold誘餌菌液作為受體菌制備感受態(tài)細(xì)胞，將cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)接于YPDA液體培養(yǎng)基，30℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)后，涂布于SD/Leu/Trp/His/Xαgal/3AT（TDO/X/3AT）平板，再挑選TDO/X/3AT平板上的陽(yáng)性克隆，點(diǎn)種到SD/Leu/Trp/His/Ade/Xαgal/3AT（QDO/X/3AT）平板上，30℃培養(yǎng)4～5 d。挑取生長(zhǎng)良好的藍(lán)色菌落用pGADT7通用引物（表1）進(jìn)行PCR檢測(cè)并測(cè)序。

1.5 候選互作蛋白酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

根據(jù)前期斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和各互作蛋白在陽(yáng)性克隆中被檢出的重復(fù)次數(shù)，選取其中的幾丁質(zhì)脫乙酰酶SlCDA、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白SlCHIT、柔性角質(zhì)層蛋白SlFCP、血細(xì)胞素SlHEMO、幼蟲(chóng)角質(zhì)層蛋白SlLCP和胰蛋白酶SlTRYP進(jìn)行酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。設(shè)計(jì)引物（表1）將各蛋白基因序列構(gòu)建到獵物質(zhì)粒pGADT7上，然后將pGADT7SlCDA、pGADT7SlCHIT、pGADT7SlFCP、pGADT7SlHEMO、pGADT7SlLCP和pGADT7SlTRYP分別與pGBKT7SlbHLH共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后分別取菌液點(diǎn)接到平板DDO、TDO/3AT和QDO上，30℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.6 SlbHLH與互作蛋白的基因表達(dá)分析

采用TRIzol法分別提取各處理組中處理后24 h 和72 h的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)總RNA，再用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照前期研究結(jié)果［37］，同時(shí)以斜紋夜蛾SlRPLP0和SlRPS13基因作為內(nèi)參，分別設(shè)計(jì)各基因引物（表1），采用SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）和qTOWER3 RealTime PCR Thermal Cycler（Analytik Jena， Germany）進(jìn)行RTqPCR，參照Livak和Schmittgen（2001）的2-ΔΔCT法［38］計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，采用Microsoft Excel和IBMSPSSStatistics version 23 （SPSS， Inc.， Armonk， NY， USA）進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析和鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾幼蟲(chóng)總RNA與cDNA

不同微生物農(nóng)藥處理斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)后24 h和72 h取樣，采用TRIzol法提取混樣總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和吸光度檢測(cè)結(jié)果均表明總RNA質(zhì)量較好，A260/A280=211，總RNA濃度為1 578898 ng/μL。經(jīng)分離純化的mRNA和dscDNA條帶大小分布于500～2 000 bp（圖1a，b），分子量分布正常，濃度和純度較好，可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建。

2.2 cDNA文庫(kù)質(zhì)量

通過(guò)同源重組的方法將dscDNA片段和線性化

的pGADT7Smal1、pGADT7Smal2、pGADT7Smal3連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得DH10B文庫(kù)菌，文庫(kù)滴度

為162×109 cfu/mL，PCR鑒定結(jié)果顯示，文庫(kù)插入片段80%在750 bp以上（圖2），文庫(kù)陽(yáng)性率為100%（大于90%），符合文庫(kù)篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 誘餌自激活和毒性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)獲得的誘餌質(zhì)粒進(jìn)行毒性檢測(cè)和自激活檢測(cè)，誘餌質(zhì)粒和獵物空載體共轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，涂布DDO平板能生長(zhǎng)，說(shuō)明重組誘餌質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入宿主菌，且對(duì)宿主菌無(wú)毒性;涂布TDO培養(yǎng)基能生長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌蛋白具有自激活活性;涂布TDO/3AT（5 mmol/L）不長(zhǎng)，說(shuō)明5 mmol/L 3AT可以抑制誘餌蛋白自激活，該條件下誘餌質(zhì)粒不能激活酵母細(xì)胞報(bào)告基因HIS3表達(dá);涂布QDO不長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌質(zhì)粒不能激活酵母細(xì)胞報(bào)告基因ADE2表達(dá)，該條件下不存在自激活現(xiàn)象（圖3），可用于酵母雙雜交驗(yàn)證。

2.4 酵母雙雜交篩選SlbHLH互作蛋白

將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘餌菌株感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行加壓篩選，經(jīng)TDO/X/3AT（5 mmol/L）（圖4a）和QDO/X/3AT（5 mmol/L）（圖4b，c）培養(yǎng)，共獲得59個(gè)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子（圖4d）。利用pGADT7通用引物對(duì)候選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)去除重復(fù)，初步獲得38個(gè)與SlbHLH互作的蛋白（表2）。

2.5 SlbHLH互作蛋白分析

基于前期斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)篩選出的38個(gè)蛋白進(jìn)行分析，GO注釋顯示，與SlbHLH互作的蛋白主要參與蛋白質(zhì)合成、ATP合成與水解、幾丁質(zhì)結(jié)合、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、角質(zhì)層形成等過(guò)程。KEGG分析顯示，與SlbHLH互作的蛋白主要參與氨基糖和核苷酸糖代謝、神經(jīng)活性配體受體相互作用、mTOR信號(hào)通路、核糖體信號(hào)通路、半乳糖代謝、嘧啶代謝、糖酵解/糖異生通路，以及酪氨酸、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑。主要包括幼蟲(chóng)角質(zhì)層蛋白（larval cuticle protein）、蛹角質(zhì)層蛋白（pupal cuticle protein）、柔性角質(zhì)層蛋白（flexible cuticle protein）、血細(xì)胞素（hemocytin）、胰蛋白酶（trypsin， alkaline Clike）、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（myosin regulatory light chain 2）、線粒體ATP合成酶（mitochondrial ATP synthase）、核糖體蛋白（ribosomal protein）、V型質(zhì)子ATP酶（Vtype proton ATPase）等。其中，篩選重復(fù)度較高的有各種角質(zhì)層蛋白、胰蛋白酶、ATP合成酶和核糖體蛋白。

2.6 SlbHLH互作蛋白驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證SlbHLH的互作蛋白，將誘餌質(zhì)粒pGBKT7SlbHLH與獵物質(zhì)粒pGADT7SlCDA、pGADT7SlCHIT、pGADT7SlFCP、pGADT7SlHEMO、pGADT7SlLCP、pGADT7SlTRYP分別共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行SlbHLH與SlCDA、SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP、SlTRYP的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，涂布DDO平板均能生長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌和獵物均共轉(zhuǎn)化成功;涂布TDO/3AT（5 mmol/L）平板均能生長(zhǎng)，說(shuō)明能激活報(bào)告基因HIS3的表達(dá)，SlbHLH與SlCDA、SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP、SlTRYP均存在相互作用;其中，SlHEMO、SlFCP、SlLCP與SlbHLH的共轉(zhuǎn)化菌涂布QDO平板均能生長(zhǎng)，說(shuō)明能激活報(bào)告基因HIS3和ADE2的表達(dá)，即SlHEMO、SlFCP、SlLCP與SlbHLH蛋白之間均存在較強(qiáng)的相互作用（圖5）。

2.7 SlbHLH及互作蛋白基因表達(dá)分析

RTqPCR結(jié)果顯示，不同微生物農(nóng)藥處理模式對(duì)各基因的表達(dá)有一定的影響。在各處理模式下，SlbHLH、SlCHIT、SlHEMO在金龜子綠僵菌處理后的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，各基因表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的134～462、105～1075、176～413倍（圖6a，6c，6e）。其中，SlbHLH在處理后72 h均顯著上調(diào)（Plt;005），在直接、間接和綜合處理模式下，其表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的462、335倍和266倍（圖6a）;SlCHIT在處理后24 h均顯著上調(diào)（Plt;005），在直接、間接和綜合處理模式下，其表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的230、233倍和957倍（圖6c）。SlCDA的表達(dá)量?jī)H在金龜子綠僵菌直接和綜合處理后24 h、間接處理后72 h顯著上調(diào)（Plt;005），其表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的582、84020倍和12952倍，而直接處理后72 h、間接處理后24 h均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)（圖6b）。

在各處理模式下，SlbHLH、SlFCP、SlHEMO、SlLCP在短穩(wěn)桿菌處理后72 h表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，各基因表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的142～288、106～1913、326～2126、273～34297倍（圖6a，6d～f）;SlTRYP在短穩(wěn)桿菌處理后24 h和72 h的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，24 h和72 h表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的0086 9～0795 6、0000 4～0008 6倍（圖6g）。SlCDA的表達(dá)量?jī)H在短穩(wěn)桿菌間接和綜合處理后24 h顯著上調(diào)（Plt;005），其表達(dá)量分別為對(duì)照組表達(dá)量的1769倍和40657倍，而在直接處理后24 h和72 h、間接處理后72 h均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)（圖6b）。

在各處理模式下，SlbHLH的表達(dá)量?jī)H在蘇云金桿菌直接處理后的24 h顯著上調(diào)（Plt;005），其他各組SlbHLH表達(dá)量與對(duì)照組表達(dá)量之間沒(méi)有顯著性差異（Pgt;005）（圖6a），且SlbHLH與各互作蛋白的表達(dá)趨勢(shì)之間沒(méi)有明顯一致性。

上述結(jié)果表明，在一定微生物農(nóng)藥及其配套處理模式下，SlbHLH的表達(dá)趨勢(shì)與SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP的表達(dá)趨勢(shì)一致，與SlTRYP的表達(dá)趨勢(shì)相反。

3 結(jié)論與討論

對(duì)昆蟲(chóng)bHLH互作蛋白的研究表明，果蠅bHLH與隱花色素2形成二聚體，參與調(diào)控對(duì)光的響應(yīng)［39］;與堿性亮氨酸拉鏈bZIP互作，參與性別決定［40］。家蠶bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage與Bmdimm、絲腺因子SGF1互作，參與調(diào)控絲素重鏈基因flbH的表達(dá)［10］。果蠅、德國(guó)小蠊、白蟻的bHLHPAS轉(zhuǎn)錄因子MET與核受體輔激活因子NCoA直系同

源物TAI互作，參與調(diào)控保幼激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［20，41］。

然而，針對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其互作蛋白與昆蟲(chóng)免疫響應(yīng)和抗病過(guò)程相關(guān)性的研究鮮少報(bào)道。

我們從前期的斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出發(fā)，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，篩選出在一定微生物農(nóng)藥及其配套處理模式下表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子SlbHLH。本研究采用酵母雙雜交技術(shù)，篩選出38個(gè)與SlbHLH互作的蛋白。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和各互作蛋白的篩選重復(fù)度，選取其中的SlCDA、SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP和SlTRYP，采用酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)試驗(yàn)，進(jìn)一步確定了這6個(gè)蛋白與SlbHLH之間存在互作關(guān)系，且SlHEMO、SlFCP、SlLCP與SlbHLH之間為強(qiáng)互作關(guān)系。此外，RTqPCR結(jié)果表明，在一定微生物農(nóng)藥及其配套處理模式下，SlbHLH的表達(dá)趨勢(shì)與SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP的表達(dá)趨勢(shì)一致，與SlTRYP的表達(dá)趨勢(shì)相反。上述6個(gè)互作蛋白中，幾丁質(zhì)脫乙酰酶是幾丁質(zhì)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖，其中幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮、中腸上皮細(xì)胞和圍食膜的重要組分［42］。研究表明，昆蟲(chóng)組織中的幾丁質(zhì)和殼聚糖的含量比例可以影響昆蟲(chóng)組織的功能［43］。Zhong等［44］研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)脫乙酰酶在家蠶中腸合成并轉(zhuǎn)移到圍食膜，參與圍食膜的更新。

對(duì)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera的研究表明，幾丁質(zhì)脫乙酰酶參與調(diào)控圍食膜的通透性及對(duì)病原物的抵御能力［45］。此外，幾丁質(zhì)脫乙酰酶還參與調(diào)控昆蟲(chóng)蛻皮、羽化和氣管延伸等過(guò)程［4648］。從本研究3種處理模式下SlCDA的表達(dá)量差異看，其在短穩(wěn)桿菌直接處理24 h和72 h后，均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，但在間接和綜合處理后24 h均顯著上調(diào)（Plt;005），表明短穩(wěn)桿菌主要通過(guò)斜紋夜蛾取食過(guò)程影響SlCDA的表達(dá)。雖然SlCDA與SlbHLH的表達(dá)趨勢(shì)沒(méi)有明顯一致性，但SlCDA很可能是短穩(wěn)桿菌在斜紋夜蛾消化系統(tǒng)相關(guān)組織上的作用靶基因之一。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白可以結(jié)合幾丁質(zhì)，進(jìn)而改變生物組織結(jié)構(gòu)［49］。研究表明，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白也參與生物抗病原物等過(guò)程［5052］。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白SlCHIT包含幾丁質(zhì)結(jié)合圍食膜蛋白A結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)是圍食膜基質(zhì)蛋白的主要特征。研究表明，圍食膜及其相關(guān)蛋白在昆蟲(chóng)體液免疫、中腸細(xì)胞凋亡、抗外源病原菌等過(guò)程中發(fā)揮重要功能［53］。本研究3種處理模式下，在相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，3種微生物農(nóng)藥均能誘導(dǎo)SlCHIT表達(dá)，表明SlCHIT可以通過(guò)體表和消化系統(tǒng)對(duì)3種微生物農(nóng)藥脅迫做出響應(yīng)。柔性角質(zhì)層蛋白和幼蟲(chóng)角質(zhì)層蛋白均是構(gòu)成角質(zhì)層的主要成分，昆蟲(chóng)角質(zhì)層不僅對(duì)昆蟲(chóng)身體起支撐作用，也是昆蟲(chóng)抵御外源病原體和農(nóng)藥的屏障［54］。本研究間接和綜合處理模式下，短穩(wěn)桿菌和蘇云金芽胞桿菌均能顯著誘導(dǎo)柔性角質(zhì)層蛋白SlFCP表達(dá)（Plt;005），表明SlFCP可能主要在斜紋夜蛾消化系統(tǒng)中發(fā)揮作用。關(guān)于血細(xì)胞素的研究表明，昆蟲(chóng)血細(xì)胞素參與對(duì)病原物的固定和清除，介導(dǎo)了血淋巴中的凝血、結(jié)節(jié)和囊胞化過(guò)程［55］。本研究間接和綜合處理模式下，3種微生物農(nóng)藥均能顯著誘導(dǎo)血細(xì)胞素SlHEMO表達(dá)（Plt;005），表明SlHEMO可能是3種微生物農(nóng)藥在斜紋夜蛾消化系統(tǒng)組織上的共同靶基因之一。胰蛋白酶是一種蛋白水解酶。昆蟲(chóng)攝取食物后，食物在圍食膜內(nèi)以及圍食膜和腸壁細(xì)胞之間被胰蛋白酶分解消化［56］。研究表明，小菜蛾P(guān)lutella xylostella胰蛋白酶基因的低表達(dá)與小菜蛾對(duì)蘇云金芽胞桿菌Cry1Ac毒素的抗性有關(guān)［57］。本研究3種處理模式下，短穩(wěn)桿菌均會(huì)抑制SlTRYP表達(dá);金龜子綠僵菌綜合處理后24 h、蘇云金芽胞桿菌直接處理后24 h、間接處理后24 h和72 h，SlTRYP的表達(dá)量均會(huì)顯著下調(diào)（Plt;005），表明斜紋夜蛾通過(guò)降低SlTRYP表達(dá)響應(yīng)3種微生物農(nóng)藥脅迫。

綜上所述，6種候選互作蛋白均與昆蟲(chóng)抗病原菌過(guò)程相關(guān)，并且其中5種蛋白基因的表達(dá)趨勢(shì)與SlbHLH表達(dá)趨勢(shì)存在相關(guān)性。因此，SlbHLH很可能與SlCHIT、SlFCP、SlHEMO、SlLCP、SlTRYP共同參與調(diào)控斜紋夜蛾對(duì)金龜子綠僵菌、短穩(wěn)桿菌和蘇云金桿菌脅迫的響應(yīng)過(guò)程。本研究為解析斜紋夜蛾bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其互作蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 秦厚國(guó)， 汪篤棟， 丁建， 等. 斜紋夜蛾寄主植物名錄［J］. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2006， 18（5）： 5158.

［2］ 田麗. 農(nóng)藥施用對(duì)棉田斜紋夜蛾的共生菌群落結(jié)構(gòu)及相關(guān)抗性基因分析［D］. 烏魯木齊： 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2020.

［3］ 潘飛， 秦雙， 嚴(yán)春雨， 等. 斜紋夜蛾對(duì)15種殺蟲(chóng)劑的抗藥性監(jiān)測(cè)［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 36（5）： 10421047.

［4］ SILVERMAN N， MANIATIS T. NFkappaB signaling pathways in mammalian and insect innate immunity ［J］. Genes and Development， 2001， 15（18）： 23212342.

［5］ 張明明， 初源， 趙章武， 等. 昆蟲(chóng)天然免疫反應(yīng)分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)， 2012， 55（10）： 12211229.

［6］ 曾令瑜， 李志紅， 柳麗君. 昆蟲(chóng)免疫及五種重要入侵昆蟲(chóng)免疫機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2019， 46（1）： 616.

［7］ JONES S. An overview of the basic helixloophelix proteins ［J］. Genome Biology， 2004， 5（6）： 226231.

［8］ HAO Yaqi， ZONG Xiumei， REN Pan， et al. Basic helixloophelix （bHLH） transcription factors regulate a wide range of functions in Arabidopsis ［J/OL］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（13）： 7152. DOI： 103390/ijms22137152.

［9］ LEDENT V， VERVOORT M. The basic helixloophelix protein family： Comparative genomics and phylogenetic analysis ［J］. Genome Research， 2001， 11（5）： 754770.

［10］趙小明. 家蠶絲腺特異表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage和Bmdimm的功能研究［D］. 重慶： 西南大學(xué)， 2014.

［11］HOU Sihan， SUN Yan， WU Yangchun， et al. Bmsage is involved in the determination of cell number in the silk gland of Bombyx mori ［J/OL］. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2019， 113： 103205. DOI： 101016/j.ibmb2019103205.

［12］MURALIDHAR M G， CALLAHAN C A， THOMAS J B. Singleminded regulation of genes in the embryonic midline of the Drosophila central nervous system ［J］. Mechanisms of Development， 1993， 41（2）： 129138.

［13］WILK R， WEIZMAN I， SHILO B Z. Trachealess encodes a bHLHPAS protein that is an inducer of tracheal cell fates in Drosophila ［J］. Genes and Development， 1996， 10（1）： 93102.

［14］LI Xiaosu， CHEN Rui， ZHU Sijun. bHLHO proteins balance the selfrenewal and differentiation of Drosophila neural stem cells by regulating Earmuff expression ［J］. Developmental Biology， 2017， 431（2）： 239251.

［15］ZHANG Xueyao， JIE Dong， LIU Jiao， et al. Aryl hydrocarbon receptor regulates the expression of LmGSTd7 and is associated with chlorpyrifos susceptibility in Locusta migratoria ［J］. Pest Management Science， 2019， 75（11）： 29162924.

［16］LI X， LIU F Z， CAI W L， et al. The function of spineless in antenna and wing development of the brown planthopper， Nilaparvata lugens ［J］. Insect Molecular Biology， 2019， 28（2）： 196207.

［17］DENG Yufang， HU Fan， REN Lili， et al. Effects of anoxia on survival and gene expression in Bactrocera dorsalis ［J］. Journal of Insect Physiology， 2018， 107： 186196.

［18］MIAO Lijun， ZHANG Nan， JIANG Heng， et al. Involvement of two paralogous methoprenetolerant genes in the regulation of vitellogenin and vitellogenin receptor expression in the rice stem borer， Chilo suppressalis ［J/OL］. Frontiers in Genetics， 2020， 11： 609. DOI： 103389/fgene202000609.

［19］MA Hongyue， LI Yanyan， LI Ling， et al. Juvenile hormone regulates the reproductive diapause through methoprenetolerant gene in Galeruca daurica ［J］. Insect Molecular Biology， 2021， 30（4）： 446458.

［20］MILACEK M， BITTOVA L， TUMOVA S， et al. Binding of de novo synthesized radiolabeled juvenile hormone （JH Ⅲ） by JH receptors from the Cuban subterranean termite Prorhinotermes simplex and the German cockroach Blattella germanica ［J/OL］. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2021， 139： 103671. DOI： 101016/j.ibmb2021103671.

［21］HAN Hui， FENG Zhaoyang， HAN Shipeng， et al. Molecular identification and functional characterization of methoprenetolerant （Met） and krüppelhomolog 1 （Krh1） in Harmonia axyridis （Coleoptera： Coccinellidae） ［J］. Journal of Economic Entomology， 2022， 115（1）： 334343.

［22］ZHANG Jie， ZHU Mengyao， LI Qilin， et al. Genomewide identification and characterization of basic helixloophelix transcription factors in Spodoptera litura upon pathogen infection ［J］. Insect Science， 2022， 29（4）： 977992.

［23］SONG Susheng， QI Tiancong， FAN Meng， et al. The bHLH subgroup Ⅲd factors negatively regulate jasmonatemediated plant defense and development ［J/OL］. PLoS Genetics， 2013， 9（7）： e1003653. DOI： 101371/journal.pgen1003653.

［24］FAN Min， BAI Mingyi， KIM J G， et al. The bHLH transcription factor HBI1 mediates the tradeoff between growth and pathogenassociated molecular patterntriggered immunity in Arabidopsis ［J］. The Plant Cell， 2014， 26（2）： 828841.

［25］馬達(dá). 擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子HFR1調(diào)控抗病性與發(fā)育的機(jī)制研究［D］. 長(zhǎng)沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

［26］XU Fang， KAPOS P， CHENG Yuti， et al. NLRassociating transcription factor bHLH84 and its paralogs function redundantly in plant immunity ［J/OL］. PLoS Pathogens， 2014， 10： e1004312. DOI： 101371/journal.ppat1004312.

［27］左麗萍. OsbHLH81基因在水稻抗條斑病和白葉枯病中的功能鑒定［D］. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

［28］FIELDS S， SONG O. A novel genetic system to detect proteinprotein interactions ［J］. Nature， 1989， 340（6230）： 245246.

［29］BRCKNER A， POLGE C， LENTZE N， et al. Yeast twohybrid， a powerful tool for systems biology ［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2009， 10（6）： 27632788.

［30］許艷， 李冉， 宋健， 等. 大麗輪枝菌及激素處理后棉花酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建［J］. 植物保護(hù)， 2021， 47（2）： 4655.

［31］沈竹， 曹勤紅. 酵母雙雜交及其衍生技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2022， 30（12）： 24252433.

［32］韋吉， 欒宏瑛， 王薈潔， 等. 致病疫霉誘導(dǎo)的馬鈴薯酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建及無(wú)毒蛋白PiAVR3b寄主靶標(biāo)篩選［J］. 植物保護(hù)， 2022， 48（4）： 114122.

［33］董夢(mèng)迪， 邢啟凱， 周悅妍， 等. 葡萄VvERF655基因響應(yīng)可可毛色二孢的表達(dá)模式及VvERF655與VvWRKY75的互作［J］. 植物保護(hù)， 2024， 50（4）： 1623.

［34］王芳， 張世子， 戴镕徽， 等. 柱花草SgMPK6互作蛋白的篩選與驗(yàn)證［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2024， 33（7）： 8493.

［35］曾琴， 梁青， 趙丹. 杜仲法呢基焦磷酸合酶EuFPS1互作蛋白篩選及分析［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 2024， 60（3）： 585595.

［36］陳其津， 李廣宏， 龐義. 飼養(yǎng)五種夜蛾科昆蟲(chóng)的一種簡(jiǎn)易人工飼料［J］. 昆蟲(chóng)知識(shí)， 2000， 37（6）： 325327.

［37］WU Shuang， LUO Yunmi， ZENG Zhihong， et al. Determination of internal controls for quantitative gene expression of Spodoptera litura under microbial pesticide stress ［J/OL］. Scientific Reports， 2024， 14： 6143. DOI： 101038/s41598024567249.

［38］LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method ［J］. Methods， 2001， 25（4）： 402408.

［39］OSSWALD M， SANTOS A F， MORAISDES E. Lightinduced protein clustering for optogenetic interference and protein interaction analysis in Drosophila S2 cells ［J/OL］. Biomolecules， 2019， 9（2）： 61. DOI： 103390/biom9020061.

［40］ERICKSON J W， CLINE T W. A bZIP protein， sisterlessa， collaborates with bHLH transcription factors early in Drosophila development to determine sex ［J］. Genes and Development， 1993， 7（9）： 16881702.

［41］TUMOVA S， DOLEZEL D， JINDRA M. Conserved and unique roles of bHLHPAS transcription factors in insectsfrom clock to hormone reception ［J/OL］. Journal of Molecular Biology， 2024， 436（3）： 168332. DOI： 101016/j.jmb2023168332.

［42］MERZENDORFER H， ZIMOCH L. Chitin metabolism in insects： structure， function and regulation of chitin synthases and chitinases ［J］. Journal of Experimental Biology， 2003， 206（24）： 43934412.

［43］YASUYUKI A， RADHIKA D， KHURSHIDA B， et al. Analysis of functions of the chitin deacetylase gene family in Tribolium castaneum ［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2009， 39（5/6）： 355365.

［44］ZHONG Xiaowu， WANG Xiaohuan， TAN Xiang， et al. Identification and molecular characterization of a chitin deacetylase from Bombyx mori peritrophic membrane ［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2014， 15（2）： 19461961.

［45］JAKUBOWSKA A K， CACCIA S， GORDON K H， et al. Downregulation of a chitin deacetylaselike protein in response to baculovirus infection and its application for improving baculovirus infectivity ［J］. Journal of Virology， 2010， 84（5）： 25472555.

［46］NOH M Y， MUTHUKRISHNAN S， KRAMER K J， et al. Group I chitin deacetylases are essential for higher order organization of chitin fibers in beetle cuticle ［J］. Journal of Biological Chemistry， 2018， 293（18）： 69856995.

［47］LUSCHNIG S， BATZ T， ARMBRUSTER K， et al. Serpentine and vermiform encode matrix proteins with chitin binding and deacetylation domains that limit tracheal tube length in Drosophila ［J］. Current Biology， 2006， 16（2）：186194.

［48］WANG Shenqiu， JAYARAM S A， HEMPHL J， et al. Septatejunctiondependent luminal deposition of chitin deacetylases restricts tube elongation in the Drosophila trachea ［J］. Current Biology， 2006， 16（2）： 180185.

［49］VAAJEKOLSTAD G， HORN S J， VAN AALTEN D M F， et al. The noncatalytic chitinbinding protein CBP21 from Serratia marcescens is essential for chitin degradation ［J］. Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（31）： 2849228497.

［50］KURAISHI T， HORI A， KURATA S. Hostmicrobe interactions in the gut of Drosophila melanogaster ［J/OL］. Frontiers in Physiology， 2013， 4： 375. DOI： 103389/fphys201300375.

［51］SHIRK P D， PERERA O P， SHELBY K S， et al. Unique synteny and alternate splicing of the chitin synthases in closely related heliothine moths ［J］. Gene， 2015， 574（1）： 121139.

［52］DESTOUMIEUX D， MUOZ M， COSSEAU C， et al. Penaeidins， antimicrobial peptides with chitinbinding activity， are produced and stored in shrimp granulocytes and released after microbial challenge ［J］. Journal of Cell Science， 2000， 113（3）： 461469.

［53］王亞清， 王晗， 王倩茹， 等. 過(guò)表達(dá)圍食膜因子基因Bm09641家蠶中腸轉(zhuǎn)錄組分析［J］. 蠶業(yè)科學(xué)， 2023， 49（3）： 234243.

［54］梁欣， 陳斌， 喬梁. 昆蟲(chóng)表皮蛋白基因研究進(jìn)展［J］. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)， 2014， 57（9）： 10841093.

［55］王菁菁， 胡宏旺， 胡瓊波. 昆蟲(chóng)hemocytin蛋白研究進(jìn)展［J］. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)， 2022， 65（12）： 16871694.

［56］董育新， 劉惠霞. 昆蟲(chóng)胰蛋白酶及其基因表達(dá)［J］. 昆蟲(chóng)知識(shí)， 1998， 35（4）： 249251.

［57］龔莉君. 小菜蛾胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶家族基因?qū)t Cry1Ac毒素的抗性機(jī)理［D］. 長(zhǎng)沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2020.

（責(zé)任編輯：楊明麗）