空心蓮子草提取物添加劑量安全性評(píng)價(jià)研究

空心蓮子草Alternantheraphiloxeroides（Mart.）Griseb，莧科蓮子草屬，是一種多年生的宿根草本植物，別名又叫水花生、空心、喜旱蓮子草等，廣泛分布于我國(guó)20多個(gè)省、區(qū)直轄市，具有極強(qiáng)的繁殖能力、抗逆性、適應(yīng)性等特點(diǎn)，能迅速適應(yīng)并生長(zhǎng)于各類水體環(huán)境中，并嚴(yán)重抑制其他生物的生長(zhǎng)，被列為中國(guó)首批外來(lái)入侵物種[1。但在醫(yī)學(xué)研究上，空心蓮子草因其獨(dú)特的藥用價(jià)值而被廣泛應(yīng)用。相關(guān)研究表明，空心蓮子草具有清熱、涼血、解毒等功效，可用于治療流感病毒、柯薩奇病毒、乙型肝炎病毒、流行性出血病毒等感染，其中竹節(jié)參皂昔Ⅳa、竹節(jié)參皂苷甲酯等6種化合物具有抗甲型流感病毒H3N2的作用[2-3]。

植物提取物在作為飼料添加劑前需要進(jìn)行安全性研究，需要嚴(yán)格控制主要成分的含量比例，避免不合理或過(guò)量攝入導(dǎo)致添加作用無(wú)效或動(dòng)物出現(xiàn)不良反應(yīng)，產(chǎn)生危害作用。本文旨在以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，探究空心蓮子草提取物是否對(duì)小鼠存在毒性作用，以便為其作為飼料添加劑是否具有安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

空心蓮子草提取物采用水提，提取時(shí)間 |0.5h 、料液比1：30、超聲時(shí)間 30min ，將提取物作為藥物。取60只健康小鼠（雌雄各半，體重 27～33g ），在溫度 25±39C 、濕度35%～60% 、12h光照/黑暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，期間自由攝食飲水。

1.2試驗(yàn)方法

前期的毒性試驗(yàn)中小鼠給藥劑量設(shè)置2 g/kg 、4g/kg兩個(gè)劑量組，兩組小鼠均未出現(xiàn)死亡，確定空心蓮子草藥液對(duì)小鼠的 LD₅₀ 大于4g/kg。

正式試驗(yàn)選取KM小鼠40只，每組10只，雌雄各半，給藥劑量隨機(jī)分為低劑量組（ 6g/kg ）、中劑量組（ 8g/kg ）高劑量組（ 10gkg ）和空白對(duì)照組（生理鹽水），灌胃給藥，灌胃體積分別為 10.2mL ， 0.4mL ， 0.6mL ， 0.8mL ，每天灌3次，每次間隔 3～4h 灌胃完成后自由飲食，觀察期間記錄小鼠狀態(tài)（毛色、飲食、精神、行為等）及死亡小鼠數(shù)量。當(dāng)小鼠死亡時(shí)，要及時(shí)解剖，并觀察內(nèi)臟變化，稱重，做好文字記錄。7d后，將小鼠脫頸處理致其死亡，解剖觀察臟器色澤、大小以及有無(wú)肉眼可見(jiàn)病變等，稱取各臟器重量，計(jì)算臟器指數(shù)。相關(guān)公式如下：

臟器指數(shù) （%）= （臟器鮮重/體重） ^*100 給藥劑量（ g/kg ）） O= 每只小鼠給藥量（g）/小鼠體重（kg）灌胃體積 （mL ） O= 每只小鼠給藥量（g）/藥物濃度（ g/mL ）

試驗(yàn)期間死亡的小鼠及試驗(yàn)結(jié)束后處死的小鼠，在剖檢后取有關(guān)組織器官（肝臟、腎臟、腸道）放入預(yù)冷的 14% 多聚甲醛固定液內(nèi)固定。石蠟切片常規(guī)制作程序方法制作組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞空泡化、腎小管上皮細(xì)胞壞死、腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞等。

表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3數(shù)據(jù)分析

本研究主要利用SPSS26.0軟件，對(duì)各劑量組下小鼠的體重增長(zhǎng)率、臟器指數(shù)進(jìn)行方差分析，后使用Duncan's新復(fù)極差法，進(jìn)行顯著性差異比較，利用最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較（ Plt;0.05 ），用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理及圖表的繪制，表格中數(shù)據(jù)為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。

2結(jié)果與分析

2.1毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在毒性實(shí)驗(yàn)中，2g/kg、4g/kg灌胃組小鼠無(wú)一死亡，小鼠沒(méi)有異常情況，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)積極、靈活，皮毛光澤，眼瞼與黏膜無(wú)病變變化，呼吸無(wú)異常，未見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，剖解未見(jiàn)明顯肉眼變化。

2.2正式試驗(yàn)結(jié)果

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，所有劑量組的小鼠均存活良好，未觀察到任何異常體征，且小鼠精神活躍、運(yùn)動(dòng)自如，被毛保持正常光澤，眼瞼及黏膜狀態(tài)無(wú)改變，呼吸平穩(wěn)，未出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。解剖最大劑量下小鼠內(nèi)臟檢查，未發(fā)現(xiàn)顯著肉眼可見(jiàn)的病理改變（圖1）。這些結(jié)果表明，空心蓮子草的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量超過(guò)10g/kg ，據(jù)此可判定該物質(zhì)屬于一種無(wú)毒類物質(zhì)。

圖1小鼠解剖圖

第一，體重變化。

實(shí)驗(yàn)期間，小鼠的采食、飲水等行為活動(dòng)正常，生命體征穩(wěn)定。7d飼養(yǎng)前后，稱取小鼠體重，以此計(jì)算小鼠的體重增長(zhǎng)率。如表2數(shù)據(jù)所示，與對(duì)照組相比，除低劑量組降低 22.49% 外，中劑量、高劑量組增長(zhǎng)率均顯著增加80.36% 、 30.54% （ Plt;0.05 ），可知，空心蓮子草藥劑對(duì)小鼠的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

表2毒性試驗(yàn)中空心蓮子草對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)率的影響（ ）

注：以上數(shù)據(jù)為10次重復(fù)所得結(jié)果，不同的小寫字母代表各處理的差異水平顯著（ Plt;0.05 ），下同

第二，臟器指數(shù)。

給藥結(jié)束后，將小鼠處死、解剖，觀察發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠內(nèi)臟組織無(wú)明顯的病變和損傷，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，各處理組的具體臟器指數(shù)如表3所示。與對(duì)照組相比，各劑量組下的心、肝、脾、肺、腎臟器指數(shù)無(wú)明顯差異一 Pgt;0.05 ），但對(duì)胃腸道指數(shù)而言，施加藥劑處理后，低劑量、中劑量及高劑量組值顯著提高，相較于對(duì)照組，分別提高了 9.43% 、 16.70% ， 9.86% 。可知，施加空心蓮子草劑量處理對(duì)小鼠的多個(gè)臟器發(fā)育無(wú)顯著的毒副作用，反而還可促進(jìn)小鼠胃腸道的生長(zhǎng)發(fā)育。

第三，病理組織學(xué)檢查。

給藥結(jié)束后，對(duì)各劑量組及對(duì)照組小鼠的肝、腎、腸進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

圖2各劑量組下小鼠腸組織病理切片觀察

注：A圖表低劑量組；B圖表中劑量組；C圖表高劑量組；D圖表對(duì)照組；下同

由圖2小鼠腸組織切片病理切片觀察可知，各劑量組下，腸組織腸絨毛發(fā)達(dá)，數(shù)量豐富，形狀不規(guī)則，黏膜上皮結(jié)構(gòu)不清，固有層內(nèi)可見(jiàn)多量腸腺，呈圓管或直管狀，排列緊密，少量杯狀細(xì)胞散在分布，黏膜肌層將腸腺及黏膜下層分隔開(kāi)；肌層薄，平滑肌組織細(xì)胞排列緊密。且與空白組相比，各劑量組均未對(duì)小鼠的腸組織未產(chǎn)生明顯病變。

圖3各劑量組線下小鼠肝組織病理切片觀察

Figurel-3 Observationof histopathological section ofmouse liver under each dose group line

對(duì)小鼠肝組織切片病理切片觀察可知（圖3），空白組下，肝臟組織被膜，未見(jiàn)明顯異常情況。肝小葉分界不清，中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細(xì)胞和肝血竇，大量肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，周圍肝竇受擠壓；偶見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，胞核固縮、碎裂、溶解，胞質(zhì)崩解，周圍偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞浸潤(rùn)；相鄰肝小葉之間的門管區(qū)未見(jiàn)明顯異常。然而，各劑量組下，小鼠肝臟未見(jiàn)大量明顯細(xì)胞腫脹、肝細(xì)胞壞死和細(xì)胞浸潤(rùn)等病理特征，說(shuō)明空心蓮子草是一類良好的保肝藥物。

表3毒性試驗(yàn)中臟器指數(shù)的測(cè)定結(jié)果 ）

注：以上數(shù)據(jù)為10次重復(fù)所得結(jié)果，同列數(shù)字下不同的小寫字母代表同一個(gè)指標(biāo)內(nèi)各處理的差異水平顯著 _{（Plt;0.05）} ，下同

3討論

在畜禽的安全生產(chǎn)，飼料質(zhì)量是限制其最重要的關(guān)鍵因素。天然植物飼料添加劑雖由天然活性成分組成，但其成分復(fù)雜，安全性評(píng)估難度較大，已有研究表明部分產(chǎn)品存在潛在毒副作用4。為保障人畜健康安全，避免長(zhǎng)期進(jìn)食含化學(xué)物質(zhì)殘留的食品而導(dǎo)致機(jī)體受損，如過(guò)敏、致癌、致畸和致突變等作用，需要對(duì)化學(xué)物質(zhì)如飼料及食品添加劑、其他與之有關(guān)的農(nóng)藥、重金屬、生物毒素的殘留等進(jìn)行安全性毒理評(píng)價(jià)試驗(yàn)。它包括急性毒性、亞慢性毒性、慢性毒性這三種試驗(yàn)。急性試驗(yàn)是指試驗(yàn)動(dòng)物一次接觸或24h內(nèi)多次接觸，就會(huì)引起動(dòng)物表現(xiàn)出顯著的毒性效應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡的試驗(yàn)。它的目的是了解受試物的毒性強(qiáng)度，進(jìn)而為后續(xù)的亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的劑量選擇提供理論依據(jù)。致死劑量通常用半數(shù)致死劑量來(lái)表示，單位是每公斤體重所攝入受試物質(zhì)的毫克數(shù)，即mg/kg。亞慢性試驗(yàn)是指動(dòng)物連續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間（2周或4周，甚至數(shù)月）接觸較大劑量的化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。而慢性毒性是指以低劑量長(zhǎng)期給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸，觀察其對(duì)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

有些化學(xué)物質(zhì)毒性較弱，甚至經(jīng)急性毒性試驗(yàn)證明后，可以劃分為無(wú)毒類物質(zhì)，但是若是人類或動(dòng)物持續(xù)或長(zhǎng)期攝入，這些物質(zhì)在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生蓄積，時(shí)間久了就會(huì)產(chǎn)生不良的反應(yīng)。因此，需要對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期的、安全性研究，以確定最大無(wú)毒副作用劑量。目前來(lái)說(shuō)，關(guān)于天然植物提取物添加劑對(duì)動(dòng)物腸道、肝臟、腎臟等內(nèi)臟組織結(jié)構(gòu)影響的研究報(bào)道仍然較少，本研究從病理學(xué)上研究臟器組織的健康狀態(tài)、發(fā)育程度及病變與否，對(duì)探究畜禽的生長(zhǎng)狀況及生產(chǎn)性能是有價(jià)值的。

本研究中，在空心蓮子草灌胃7d后，與對(duì)照組相比，中高劑量組顯著提高了小鼠的體重增長(zhǎng)率，各劑量組顯著提升了小鼠的胃腸道指數(shù)，這表明心蓮子草灌藥處理后會(huì)改善小鼠的生長(zhǎng)及胃腸道結(jié)構(gòu)的發(fā)育，提升機(jī)體的免疫水平和生長(zhǎng)性能。本研究結(jié)果與前人多項(xiàng)研究結(jié)果相似，如楊子旭等5發(fā)現(xiàn)在肉雞的日糧中 10.3%～0.5% 的松針提取物能顯著增加其日增重，進(jìn)而提高其生長(zhǎng)性能。另外，田浪等人通過(guò)研究植物添加劑對(duì)黃羽肉雞的影響中，發(fā)現(xiàn)復(fù)合植物飼料添加劑可以增加動(dòng)物十二指腸絨毛長(zhǎng)度，而腸道含有豐富的腺體及淋巴結(jié)，是重要的免疫器官，增大腸道黏膜表面積，不僅可以促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力。陳瓊等的研究顯示中藥提取物能夠顯著提高育雛期、育成期凌云烏雞的體重、成活率、體重均勻度、預(yù)備留種率，表明中藥提取物能顯著提高凌云烏雞生長(zhǎng)發(fā)育的。以上研究表明，空心蓮子草對(duì)動(dòng)物是無(wú)害且有益的。

另外，解剖圖結(jié)果與空白對(duì)照組相比顯示，高劑量組下小鼠內(nèi)臟無(wú)明顯損傷，表明小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)最大耐受劑量 gt;10g/kg ，且小鼠HE染色切片分析表明，各劑量組小鼠的腸道和肝臟組織均未觀察到明顯的病理學(xué)改變，這表明空心蓮子草對(duì)小鼠灌藥處理并不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生顯著的毒性作用。相應(yīng)的研究也有報(bào)道，如馮香安[在飼料中添加不同濃度的植物槲皮素，各試驗(yàn)組動(dòng)物解剖后在肉眼病檢中未發(fā)現(xiàn)各臟器明顯病變，且經(jīng)H正染色的部分臟器也未發(fā)現(xiàn)明顯病變，表明植物槲皮素長(zhǎng)期飼喂不會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)生毒副作用。此外，劉茹等研究山楂、陳皮、黃芪等中草藥添加劑對(duì)斷奶仔豬的安全性中也發(fā)現(xiàn)，在飼料中按 5% ！ 3% 、 1% 的添加量進(jìn)行添加，各試驗(yàn)組豬內(nèi)臟器官均正常，組織結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)出血、壞死等病理性變化，未發(fā)現(xiàn)病變，表明中草藥添加劑對(duì)斷奶仔豬是安全的。另外，值得注意的是，肝臟組織學(xué)特征顯示各劑量組不僅無(wú)毒副作用反而呈現(xiàn)出一定的肝保護(hù)作用趨勢(shì)。武謙虎等[1]、閻納新等[研究證明了空心蓮子草對(duì)化學(xué)性肝損傷、免疫性肝損傷及乙醇急性肝損傷均有保護(hù)、緩解作用。

結(jié)語(yǔ)

這些研究結(jié)果表明，空心蓮子草植物添加劑總體上不僅能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育、改善動(dòng)物的消化和吸收功能、保護(hù)肝臟組織，而且對(duì)機(jī)體無(wú)顯著的毒副作用，表明可以將空心蓮子草作為天然植物飼料添加劑應(yīng)用于畜禽的安全性生產(chǎn)。

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收稿日期：2025-05-13

作者簡(jiǎn)介：張超（1985—），女，漢族，碩士。研究方向：中草藥在野生動(dòng)物臨床運(yùn)用。

*通訊作者：司紅彬（1977一），男，漢族，博士，教授。研究方向：現(xiàn)代中獸藥及藥物劑型研究、細(xì)菌耐藥性傳播與控制研究、中西醫(yī)結(jié)合研究。