草魚cdx2基因密碼子偏好性與進(jìn)化分析

在生物體的氨基酸組成中，1個(gè)氨基酸可以對(duì)應(yīng)多種密碼子。編碼同一類氨基酸的多個(gè)密碼子叫作同義密碼子[1]。在蛋白合成過程中，同義密碼子的使用頻率存在差異，且物種和基因?qū)δ骋环N或幾種密碼子的使用具有偏好性[2]。目前，用于解釋密碼子偏好性現(xiàn)象的主要是2種經(jīng)典理論模型，即“中性理論”和“選擇-突變-漂變”學(xué)說[3-4]。密碼子偏好性分析是一種較為復(fù)雜的生物學(xué)問題，其影響因素主要是自然選擇和突變壓力，除此之外，堿基組成、基因表達(dá)水平、GC含量、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA豐度、RNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因長(zhǎng)度等也是影響密碼子偏好性形成的因素[5-7]。進(jìn)行各個(gè)物種間密碼子偏好性使用差異的分析，可以了解各個(gè)物種間的進(jìn)化起源關(guān)系和基因的進(jìn)化規(guī)律，進(jìn)一步探究和分析某個(gè)基因在進(jìn)化過程中所受到的選擇壓力或者突變壓力的影響[8]。同時(shí)，通過對(duì)密碼子偏好性的分析，有助于了解基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子機(jī)制，達(dá)到有效預(yù)測(cè)基因外源表達(dá)系統(tǒng)和最佳表達(dá)宿主的目的[9]

cdx2基因?qū)儆谖残屯春谢颍╟audal-relatedhomeoboxgene）家族成員，從胚胎發(fā)育的前期到成熟期均有表達(dá)，在腸道上皮形態(tài)的發(fā)生、維持以及分化等方面發(fā)揮重要作用[10]。cdx2基因及其相關(guān)的蛋白最早由Mlodzik從果蠅中成功分離，與 parahox家族呈高度的同源性[1]。近年來，人體染色體研究結(jié)果顯示， cdx2 基因位于染色體的13q12＼～13區(qū)，全長(zhǎng)為 22～23kb ，由 cdx2 基因編碼的蛋白含313個(gè)氨基酸，按照螺旋-環(huán)-螺旋的形式結(jié)合在DNA的相關(guān)位置，以轉(zhuǎn)錄因子的方式調(diào)控DNA 的表達(dá)[12] O

草魚（Ctenopharyngodonidella）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）、鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、雅羅魚亞科（Leuciscinae）、草魚屬（Ctenopharyngodon），是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水養(yǎng)殖品種之一，也是國(guó)民消費(fèi)量最大的魚類之_[13]。2021年我國(guó)草魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá) 575.5萬t^[14] 。草魚是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，含有豐富的不飽和脂肪酸和必需氨基酸，深受消費(fèi)者喜愛[15]。分析草魚與其他物種cdx2基因的密碼子偏好性和進(jìn)化關(guān)系，不僅有助于闡釋草魚與不同物種間cdx2基因的進(jìn)化關(guān)系，還能為草魚cdx2基因的外源表達(dá)選擇適宜的宿主，通過優(yōu)化密碼子提高外源基因的表達(dá)水平，研究結(jié)果可為草魚 cdx2 基因的異源表達(dá)與分子調(diào)控研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 序列及數(shù)據(jù)來源

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取草魚及8種動(dòng)物的17個(gè)cdx2基因的完整編碼區(qū)序列（codingDNA sequence，CDS），登錄號(hào)見表1。從CodonUsageDatabase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）下載模式生物大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母（Saccharomyces cerevi-siae）斑馬魚（Daniorerio）小家鼠（Musmuscu-lus）等基因的密碼子偏好性數(shù)據(jù)。

1.2cdx2基因的密碼子偏好性分析

采用生物信息學(xué)工具CodonW對(duì)17條cdx2基因序列進(jìn)行計(jì)算和分析，獲取同義密碼子第3位上的T3s、C3s、A3s和G3s堿基含量，以及同義密碼子第3位上GC含量（GC3s）、整體密碼子平均 GC 含量、同義密碼子相對(duì)使用度（relative sy-nonymouscodonusage，RSCU）、有效密碼子數(shù)（effectivenumberofcodon，ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（codonadaptation index，CAI）、密碼子偏愛指數(shù)（codonbiasindex，CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（frequencyofoptimalcodons，F(xiàn)OP）等密碼子偏好性參數(shù)。

1.3 ENC-plot繪圖

使用EXCEL軟件，以17個(gè) cdx2 基因的ENC值 （y） 為縱坐標(biāo)，GC3s值 （x） 為橫坐標(biāo)，繪制期望曲線 和散點(diǎn)圖。

1.4cdx2基因的進(jìn)化分析及RSCU值的相關(guān)聚類分析

采用MEGA5.1軟件的組間鄰接法（neighbour-joining，NJ）構(gòu)建 cdx2 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，檢驗(yàn)方法采用bootstrapmethod，設(shè)置檢驗(yàn)次數(shù)為1000，分析各物種存在的親緣關(guān)系?；?9個(gè)密碼子（剔除AUG、TGG和3個(gè)終止密碼子）的相對(duì)使用度，通過SPSS軟件的組間聯(lián)結(jié)法對(duì)17個(gè)cdx2基因的RSCU值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。最終對(duì)比分析cdx2基因的密碼子偏好性與物種進(jìn)化之間的關(guān)系。

2結(jié)果

2.1cdx2基因同義密碼子相對(duì)使用度

RSCU是指某一特定的密碼子在編碼相應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對(duì)使用頻率。如果RSCU值為1，則說明無偏好性；如果RSCU值大于1，則說明該密碼子的相對(duì)使用頻率較高；如果RSCU值小于1，則反之[16]。ENC值能反映密碼子家族中同義密碼子非均衡使用的偏好程度，其范圍為20～61，ENC值越接近60，說明密碼子偏好性越弱，基因的表達(dá)水平越低。FOP值表示最優(yōu)密碼子占所有同義密碼子數(shù)的比例[17]，是衡量密碼子使用偏好性的常用指標(biāo)之一，其值在0.36～1.00^[18-19] 。FOP 值越大，表示密碼子偏好性越強(qiáng)；FOP值越小，則表示密碼子偏好性越弱[20] ○

CAI則表示編碼區(qū)同義密碼子與最佳密碼子使用頻率的相符程度。CAI值在 0～1.0 ，密碼子的CAI值越大，表示某基因中該密碼子的使用偏好性越強(qiáng)，表達(dá)水平較高；CBI值代表密碼子偏愛指數(shù)，反映了基因中高表達(dá)密碼子的組分情況，CBI值在0＼～1時(shí)，值越大表明密碼子偏好性越強(qiáng)[21]由于基因轉(zhuǎn)錄有不止1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄后會(huì)發(fā)生多種mRNA的選擇性剪接，最終產(chǎn)生不同序列的cDNA甚至不同編碼區(qū)組合，尤其是同分異構(gòu)體，大體序列相同，局部序列有差異，因此在研究分析時(shí)，一般選擇開放閱讀框完整且較長(zhǎng)的序列作為分析對(duì)象。本研究通過CodonW軟件分析9個(gè)物種的17個(gè) cdx2 基因的RSCU值，并將RSCU值標(biāo)準(zhǔn)化后獲得基于RSCU值的熱圖（見圖1），進(jìn)行密碼子相對(duì)使用度分析。在草魚cdx2基因的密碼子中，有26種密碼子的RSCU值大于1，是草魚cdx2基因的偏好密碼子，且A/T與G/C結(jié)尾相當(dāng)。其中草魚cdx2基因偏好性較強(qiáng)的有CUG、AGA和GAC，其RSCU值分別為3、2.63和2。9種動(dòng)物的17個(gè)cdx2基因中，RSCU均值大于1.6的密碼子有CUG、GUG、UCC、GGC、UAC、GAC、AGC等7個(gè)，最優(yōu)密碼子為CUG，其平均

注：1.草魚KC748025.1;2.牛NM_001206299.1;3.原雞NM_204311.2;4.智人AH007259.2;5.智人BC014461.1;6.智人U51096.1;7.小家鼠BC103516.1;8.小家鼠BC103517.1;9.小家鼠BC103519.1：10.小家鼠BC103520.1；11.小家鼠NM_007673.3;12.塞內(nèi)加爾多鰭魚Q522900.1;13.褐家鼠NM_023963.2;14.野豬GU017420.2;15.野豬NM_001278769.1;16.熱帶蟾蜍BC063344.1;17.熱帶蟾蜍NM_203878.1。

RSCU值為2.65。這7個(gè)高頻密碼子均以C或G結(jié)尾，說明對(duì)C/G結(jié)尾偏好程度高。其中野豬密碼子RSCU值大于1的密碼子數(shù)目最多，有27個(gè)。牛的最優(yōu)密碼子CUG的RSCU值達(dá)到了3.75，說明它的cdx2基因在表達(dá)時(shí)對(duì)CUG的偏好性較強(qiáng)。牛和野豬的密碼子RSCU值十分接近，二者RSCU值均大于1的密碼子有多個(gè)，具有一定相似的密碼子偏好性，說明在進(jìn)化過程中牛和豬的親緣關(guān)系較近。

2.2 草魚與其他動(dòng)物cdx2基因偏好性相關(guān)參數(shù)比較

表2列出了9個(gè)物種的17個(gè)cdx2基因編碼區(qū)核苷酸序列中密碼子第3位上各堿基和GC的含量，用以解釋不同物種 cdx2 基因密碼子使用偏好性與堿基組成的關(guān)系。草魚 T3s，C3s，A3s 和G3s的含量分別為 26.24%.31.19%.32.49% 31. 77% ；GC 和GC3s含量分別為52. 10% 、51.50% ，表明草魚cdx2基因第3位堿基對(duì) A/T 和 G/C 結(jié)尾的偏好程度相差不大；草魚cdx2基因編碼區(qū)的GC含量大于 50% ，表明草魚 cdx2 基因在整個(gè)CDS區(qū)序列中 G+C 含量大于 A+T 含量。17個(gè) cdx2 基因整體堿基組成分析顯示，T3s、C3s、A3s和G3s平均含量分別為 17.54%.46.45%

15.60% 和41. 44% ；GC和GC3s平均含量分別為63.19% 和 72.54% 。哺乳動(dòng)物 cdx2 基因的GC含量平均值為 65.78% ， GC3s 含量平均值為 77.38% ：非哺乳動(dòng)物（原雞除外） cdx2 基因的GC含量平均值為 52.90% ，GC3s含量平均值為 53.30% 。由此說明，哺乳動(dòng)物 cdx2 基因偏好使用以C/G結(jié)尾的密碼子，包括草魚在內(nèi)的大多數(shù)非哺乳動(dòng)物，其 cdx2 基因第3位堿基對(duì)A/T和 G/C 結(jié)尾的偏好程度相似。

為進(jìn)一步系統(tǒng)分析 cdx2 基因的密碼子使用偏好性程度，本研究分析比較了不同物種的17個(gè)cdx2基因的密碼子偏好性參數(shù)（見表3）。草魚cdx2基因的FOP值、CBI值和ENC值分別為 和54.16。由此可見，F(xiàn)OP值和CBI值偏小，說明草魚cdx2基因密碼子偏好性偏弱。ENC值偏大，表明草魚cdx2基因中各密碼子沒有明顯的偏好性，即各密碼子在編碼氨基酸時(shí)出現(xiàn)的頻率相差不大。從整體上看，哺乳動(dòng)物的ENC值為 37.75～46.58 ，平均值為42.27；非哺乳動(dòng)物的ENC值為 33.01～58.08 ，平均值為52.01，表明大多數(shù)動(dòng)物 cdx2 基因密碼子偏好性較弱，但哺乳動(dòng)物 cdx2 基因的密碼子偏好性高于非哺乳動(dòng)物。17個(gè) ?cdx2 基因的FOP值為0.438＼～0.564，表明各物種的 cdx2 基因密碼子使用偏好性不強(qiáng)。哺乳動(dòng)物CBI值為 0.198～0.260 ，表明密碼子偏好性較弱，非哺乳動(dòng)物（除原雞外）的CBI值為0.026～0.072 ，接近于0，說明cdx2基因密碼子在大多數(shù)非哺乳動(dòng)物中幾乎是完全隨機(jī)使用的。17個(gè)cdx2基因的CAI值為 0.186～0.274 ，分布較為集中，表明密碼子無較大的偏好性。綜上分析，多數(shù)動(dòng)物對(duì)cdx2基因的使用不存在絕對(duì)的偏好性。已有研究結(jié)果表明，密碼子偏好性對(duì)基因表達(dá)有兩方面的調(diào)控作用：一方面，通過順式調(diào)控直接調(diào)節(jié)使用該密碼子基因本身的表達(dá)量；另一方面，偏好性密碼子通過內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)tRNA資源，對(duì)基因組內(nèi)其他基因的表達(dá)形成間接影響[22]。基于cdx2較弱的密碼子偏好性，其在不同物種中的表達(dá)水平可能存在差異，但差異較小。

2.3 ENC-plot分析

密碼子偏好性的形成主要是受堿基突變還是自然選擇的影響，與各點(diǎn)與期望曲線的相對(duì)位置有關(guān)[23-24]。ENC-GC3s點(diǎn)分布離期望曲線越近，則某一基因的密碼子偏好性受突變的影響越大；分布的位置偏離期望曲線越遠(yuǎn)，則其受自然選擇的影響越大[25-26]。本研究 ENC-plot 圖顯示，野豬和熱帶蟾蜍的ENC-GC3s點(diǎn)分布于期望曲線附近，表明其 cdx2 基因密碼子偏好性的形成受自然選擇的影響很小，主要受突變的影響。其余cdx2基因均分布在離期望曲線較遠(yuǎn)的位置，表明大部分動(dòng)物cdx2基因密碼子偏好性的形成受自然選擇的影響大于受基因突變的影響。其中，草魚cdx2基因分布于離期望曲線最遠(yuǎn)的位置，說明草魚cdx2基因密碼子偏好性的形成很大程度上受自然選擇的影響（見圖2）。

2.4cdx2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及基于RSCU的聚類分析

為了判斷17個(gè)cdx2基因在進(jìn)化上的親緣關(guān)系，采用鄰接法構(gòu)建基于CDS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖3）。由圖3可以看出，17個(gè)cdx2基因被分為兩大類，從總體上看，脊索動(dòng)物在進(jìn)化過程中發(fā)生了哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的分化。第1大類由哺乳動(dòng)物cdx2基因組成，各cdx2基因按動(dòng)物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近聚為1支，其中野豬和牛表現(xiàn)出極近的親緣關(guān)系。非哺乳動(dòng)物聚為第2大類，草魚和塞內(nèi)加爾多鰭魚親緣關(guān)系最近，并與熱帶蟾蜍形成一小支，最終與原雞形成一大類。

各動(dòng)物cdx2基因的RSCU值聚類分析結(jié)果（見圖4）與基于CDS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果基本一致。RSCU聚類分析結(jié)果，17個(gè)cdx2基因也被分成兩大類：第1類，由哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物原雞的cdx2基因組成;第2類，由草魚、塞內(nèi)加爾多鰭魚和熱帶蟾蜍的cdx2基因組成。與系統(tǒng)進(jìn)化樹不同的是，歸屬于非哺乳動(dòng)物的原雞被分進(jìn)了第1類。以上結(jié)果表明，基于RSCU的聚類分析結(jié)果在一定程度上反映了動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系。

2.5 草魚cdx2基因與模式生物密碼子偏好性比較

通過比較草魚cdx2基因與模式生物，如大腸桿菌、酵母、斑馬魚和小家鼠的密碼子使用頻率，分析頻率差異較大（頻率比值小于0.5或大于2.0）的密碼子個(gè)數(shù)以確定最佳遺傳轉(zhuǎn)化受體和外源表達(dá)系統(tǒng)。由表4可見，草魚cdx2與酵母、大腸桿菌差異較大的密碼子個(gè)數(shù)分別為43和48個(gè)，說明酵母是草魚 cdx2 基因的最佳外源表達(dá)系統(tǒng)；與小家鼠、斑馬魚基因組使用頻率比較，差異較大的密碼子分別為48、49個(gè)，說明小家鼠和斑馬魚均可作為草魚cdx2的遺傳轉(zhuǎn)化受體，以斑馬魚為最佳。但在實(shí)際應(yīng)用過程中還需要對(duì)外源表達(dá)的 cdx2 基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，最終提高表達(dá)效率。

3 討論

本研究首先對(duì)草魚及其他動(dòng)物的17個(gè)cdx2基因進(jìn)行了密碼子偏好性整體分析，發(fā)現(xiàn)在草魚cdx2基因的密碼子中有26種密碼子的RSCU值大于1，具有密碼子偏好性，其中使用頻率最高的是CUG，其RSCU值為3，其次是AGA、GAC。不同種動(dòng)物間cdx2基因中有7個(gè)優(yōu)勢(shì)密碼子，其中CUG為最優(yōu)密碼子。對(duì)ENC值和CAI值分析發(fā)現(xiàn)，草魚的ENC值偏大，表明草魚cdx2基因中各密碼子在編碼氨基酸時(shí)出現(xiàn)的頻率比較一致。FOP值和CBI值偏小，說明草魚cdx2基因的密碼子偏好性偏弱。有效密碼子數(shù)（ENC）能反映密碼子家族中同義密碼子非均衡使用的偏好程度，其值在20＼～61，通常ENC值越接近于20，說明密碼子偏好性越強(qiáng)。哺乳動(dòng)物cdx2基因的ENC平均值為42.27，非哺乳動(dòng)物 cdx2 基因的 ENC 平均值為52.01。通常情況下，密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI與基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)，而ENC則相反。本研究中，17個(gè)cdx2基因序列的CAI均值為0.25，而ENC均值大于45，低CAI值和較高的ENC值，表明cdx2基因在動(dòng)物體內(nèi)尤其是非哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)水平較低，如果基因表達(dá)水平低，其對(duì)密碼子的偏好性也較低。GC和GC3s含量結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物cdx2基因?qū)/G結(jié)尾的密碼子偏好性更強(qiáng)，大多數(shù)非哺乳動(dòng)物cdx2基因第3位堿基對(duì)A/T和G/C結(jié)尾的偏好程度相似。綜上所述，ENC值和RSCU值分析結(jié)果均顯示，動(dòng)物cdx2基因的密碼子偏好性較弱，且哺乳動(dòng)物的偏好性要高于非哺乳動(dòng)物。ENC-plot分析結(jié)果表明，草魚和大部分動(dòng)物的cdx2基因偏好性受到自然選擇的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過突變壓力的影響，僅有少數(shù)物種（野豬和熱帶蟾蜍）的cdx2基因主要受到突變壓力或其他因素的影響。

各種生物由于自然選擇、堿基突變等影響因素，在進(jìn)化中出現(xiàn)不同的密碼子偏好性，因此，密碼子偏好性在一定程度上能夠反映出不同物種間的親緣關(guān)系[24]。生物進(jìn)化是物種最本質(zhì)的特征之一，在進(jìn)化過程中，物種對(duì)密碼子的使用模式是其進(jìn)化的重要證據(jù)體現(xiàn)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，基于cdx2基因CDS編碼區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹和RSCU聚類分析結(jié)果基本相似，僅有少數(shù)動(dòng)物cdx2基因的RSCU聚類結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果不一致，說明RSCU聚類結(jié)果在一定程度上能夠反映動(dòng)物進(jìn)化的關(guān)系，其中存在差異的具體原因還需進(jìn)一步研究。在RSCU聚類結(jié)果中有非哺乳動(dòng)物的原雞cdx2基因與哺乳動(dòng)物cdx2基因聚為一類的現(xiàn)象，究其原因，可能是cdx2基因在非哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物分化前較為保守，在哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物分化后，有部分cdx2基因在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生了進(jìn)化。

密碼子使用頻率比值是衡量不同物種間密碼子使用偏好性差異的指標(biāo)，如2個(gè)不同物種間的密碼子使用頻率比值大于0.5或小于2.0，說明密碼子使用特性較一致；反之則說明差異較大。因此，通常利用該指標(biāo)分析目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化受體及外源表達(dá)系統(tǒng)。通過對(duì)比分析草魚與幾種模式生物的密碼子使用頻率，發(fā)現(xiàn)斑馬魚是草魚最佳的遺傳轉(zhuǎn)化受體，大腸桿菌和酵母均可作為草魚 cdx2 的外源表達(dá)系統(tǒng)。上述結(jié)論有助于加強(qiáng)對(duì) cdx2 基因密碼子使用模式的認(rèn)識(shí)，對(duì)于指導(dǎo)cdx2基因進(jìn)行分子改造、遺傳轉(zhuǎn)化等具有重要的理論意義。

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Codon bias and evolutionary analysis of the cdx2 gene in grass carp （ Ctenopharyngodon idella）

LUO Junhan，LI Yanfang，GAO Xing，TANG Xiang，LUO Yanan， ZENG Peng，QING Yanling，WANG Chenhaoyang，CHEN Zhenfeng， LIU Jing，SONG Mengling，HE Zhimin

（Hunan Provincial Key Laboratory of Nutrition and Quality Control of Aquatic Animals ， Department of Biological and Chemical Engineering ， Changsha University，Changsha 410003，China）

Abstract：This study explored thecodon bias formed in the evolutionof cdx2 gene in grasscarp（Ctenopharyngodon idella）and its phylogenetic relationship with certain animals（Bos taurus，Galus gallus，Homo sapiens， Mus musculus，Polypterus senegalus，Rattus norvegicus， Sus scrofa， Xenopus tropicalis），providing insights into theheterologous expresion and molecular regulation research of the cdx2 gene in grasscarp. In this study，17 cdx2 genes from grasscarp and 8 other animals were utilized，employing Codon W and EMBOSS tools to make statistical analysis of the codon bias parameters.Subsequently，SPSS and MEGA tools were used to analyze codon bias and gene clustering，respectively.The results showed that the cdx2 gene in grass carp exhibited the strongest codon bias for CUG and there were 7 high-frequency codons of the cdx2 gene in 9 species，all of which ended in C/G，CUG being the optimal codon.The effective number of codons（ENC）for the cdx2 gene in 9 animals ranged from 33.01 to 58.O8，and the codon adaptation index（CAI）was much lessthan1，indicating weak codon preference.Natural selection is an important driving force behind thecdx2 codon usage biases in most animals. The cdx2 gene has different biases for synonymous codons either in different animal species orinthe same animal species.The clustering results based on the relative synonymous codon usage（RSCU）values of animal cdx2 genes were similar to those based on the phylogenetic tree，though slightly less accurate.

Key words：grass carp；caudal-related homeobox transcription factor cdx2 gene；codon bias；evolutionary analysis