草魚趨化因子基因ccl8的克隆、鑒定及其對嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲感染的表達響應

趨化因子是一類分子量較小的細胞因子，其主要作用是介導各種白細胞的細胞遷移和參與機體免疫應答反應以及趨化免疫細胞[1]。哺乳動物的大部分趨化因子具有4個保守的半胱氨酸殘基，可分為CXC、CC、CX3C和C共4個亞家族[2]。迄今已報道人類趨化因子48種，其中CC型趨化因子28種，CXC型趨化因子17種，C型趨化因子2種，CX3C 型趨化因子1種[3]。CCL8又稱單核細胞趨化蛋白-2，最早在人骨肉瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)，它通過結(jié)合趨化因子受體CCR2在各種炎癥細胞中發(fā)揮趨化因子的作用[4]。有研究表明，CCL8是某些疾病早期診斷的重要生物標記，在移植物抗宿主病的早期診斷方面扮演著重要角色[5]。另外，CCL8水平的升高與慢性腎臟病的發(fā)展和特發(fā)性肺纖維化密切相關[6-7]，因此對CCL8功能的研究成為熱點

近年來，隨著基因組學的發(fā)展，有關于魚類趨化因子的研究陸續(xù)被報道，這不僅為開發(fā)新型魚類免疫增強劑提供了線索，還為研究趨化因子的起源與進化提供了新視角[8-10]。草魚（Ctenopha-ryngodonidella）作為中國“四大家魚”之一，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，因其生長速度快、飼料成本低和蛋白質(zhì)利用率高而受到養(yǎng)殖戶的青睞，在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)著極其重要的地位。近年來，隨著養(yǎng)殖密度的增加和環(huán)境惡化，病害暴發(fā)問題給草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔。草魚病害主要有細菌性疾病和寄生蟲病，如赤皮病、出血病、腸炎病、爛鰓病和多子小瓜蟲病等。傳統(tǒng)中草藥和化學藥物治療具有藥物殘留和病原體耐藥性等副作用，制約了草魚的健康養(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。因此，深入探討草魚的免疫相關因子，并闡明其在生物免疫過程中的作用機制，有助于開展草魚新品種培育、提高養(yǎng)殖效率和推動漁業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

目前，草魚中僅見ccl4、ccl24和ccl19基因的報道[1-13]，而關于其他CC 型趨化因子的研究則非常缺乏。本研究成功克隆了草魚cc8基因的全長cDNA序列，通過系統(tǒng)進化樹和多重序列比對分析了 ccl8 基因在不同物種中的同源性與保守性。本研究還探討了健康草魚個體中ccl8基因的組織表達模式，以及在遭受嗜水氣單胞菌（Aero-monashydrophila）和多子小瓜蟲（Ichthyophthiriusmultifiliis）感染后的表達模式，揭示了草魚 ccl8 基因的功能，有助于深化對這一基因在免疫系統(tǒng)中作用機制的理解。

1 材料和方法

1. 1 試驗材料

試驗用魚為自廣州市花都區(qū)某魚類養(yǎng)殖場所購草魚幼魚，其體長為 （15±2）cm ，體質(zhì)量為（ 50± 。草魚幼魚飼養(yǎng)在 100L 的玻璃水缸中，水溫控制在 （28±2）^°C ，每日換水1次，換水量為原水量的 1/2 ，在實驗室暫養(yǎng)7d后開展試驗。

嗜水氣單胞菌株、大腸桿菌 DH5α 和多子小瓜蟲為本實驗室傳代培養(yǎng)。其他試驗材料主要有：SYBR Green（TOYOBO）;Gel Extraction Kit（OMEGA）；MLV Reverse Transcriptase 試劑盒（Promega）；KOD-Plus-Neo（TOYOBO）；瓊脂糖（Spanish）;預混型 Taq 酶 Premix TaqTM、DL2000Marker、SMARTer？ RACE 5^′/3^′ Kit試劑盒和pMD-18TVector（均來自 TaKaRa）;Eastep Super總RNA提取試劑盒（Promega）；國產(chǎn)分析純試劑。

1.2總RNA的提取和cDNA合成

選取4尾多子小瓜蟲感染的草魚，使用100mg/L 的MS-222麻醉后，分別取脾、皮膚和肝胰臟組織。按照Eastep Super總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，用于 ccl8 基因的克隆。提取的RNA樣品經(jīng)過質(zhì)量分數(shù) 1.2% 瓊脂糖凝膠分析，以確保其完整性和質(zhì)量。隨后，使用核酸蛋白定量分析儀器測定RNA的質(zhì)量濃度和純度。利用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒MLVReverse Tran-scriptase合成第1鏈cDNA。同時，根據(jù)TaKaRa的 SMARTer？ RACE 5^′/3^′ Kit試劑盒說明書，以草魚皮膚的總RNA為模板，合成用于擴增 5^′ 和 3^′ 非編碼區(qū)的cDNA（ 5^′ 和 3^′ RACE-Ready cDNA），將合成的cDNA置于 -80°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ccl8基因的克隆

以美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中獲取的草魚基因組（C.idella， GCA_- 019924925.1）中的 ccl8 基因的mRNA序列設計1對用于擴增 ccl8 基因編碼區(qū)的引物 ^ccl8-F1 和ccl8-R1（見表1）。以草魚皮膚的cDNA為模板擴增 ccl8 基因的編碼區(qū)。擴增反應體系為 25μL 2.5μL （20號 10×KOD 緩沖液， 2.5μL dNTPs（ 2mmol L），1. 5μL MgSO₄ （ 25mmol/L ），ccl8-F1和ccl8-R1 （ 10μmol/L 各 0.5μL ， cDNA 0.5μL ddH₂O 16. 75μL ，KOD-Plus-Neo 0.25μL 。PCR（聚合酶鏈式反應）擴增條件為： ：94%15s，50～60%30s，68%30s，30 個循環(huán);68^°C 延伸 保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠分析后，采用GelExtractionKit試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接至pMD-18T載體上，然后轉(zhuǎn)化至 DH5α 菌株，進行單克隆挑取。接著進行菌液PCR檢測，確認陽性克隆后送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。菌液PCR反應體系為25 Premix TaqTM，11.5 μL ddH₂0 ，M13F-47 和 M13R-48（ 10μmol/L ）各 0.5μL ，菌液 1μL 。PCR擴增條件為： 94%5min;94% 30s，56℃30 s 72°C30s，30 個循環(huán)； 72^°C 延伸 保存。

以測序得到的 _ccl8 基因的編碼區(qū)序列設計RACE 引物 ccl8-RACE-5GSP1/5GSP2和ccl8-RACE-3GSP1/3GSP2（見表1）。以 5^′ 和 3^′ RACE-ReadycDNA為模板，采用特異性引物與通用引物進行巢式PCR擴增。擴增反應體系為25μL：2.5μL （20 10×KOD 緩沖液， 2.5μL dNTPs（2mmol/L）， 1.5μL MgSO₄ （ 25mmol?L ），上、下游引物（ 10μmol/L 各 0.5μL ddH₂0 16.75μL ，KOD-Plus-Neo 0.25μL 。所得PCR產(chǎn)物同上操作，進行測序。

1.4 生物信息學分析

利用VectorNTI軟件對測序結(jié)果拼接，得到草魚cc8基因的全長cDNA序列。運用DNASTAR6.0軟件分析ccl8基因的開放閱讀框并將DNA序列翻譯成氨基酸序列。信號肽分析在SignalP 6.O（https：//services. healthtech. dtu.dk/services/SignalP-6.O/）上完成。CCL8蛋白的功能保守區(qū)由 SMART軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/分析。CCL8蛋白的三維結(jié)構(gòu)采用 AlphaFold2（https：//colab. research. google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo G4yBrceuFbf3）進行同源建模[14]。利用 Expasy（htp：//web.expasy.org/）分析CCL8蛋白的分子量大小、等電點等理化性質(zhì)。利用MEGA11軟件并基于鄰接法（neighbour-joiningmethod，NJ法）構(gòu)建 ccl8 基因的系統(tǒng)進化樹[15]，同時利用 ESPript 3.0 網(wǎng)站（htps：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進行氨基酸序列的多重比對。進化樹和多重序列比對所用到基因的氨基酸序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫下載

1.5 草魚ccl8基因的mRNA組織表達分析

采用RT-qPCR（實時熒光定量PCR）檢測ccl8基因在草魚10個組織中的相對表達量。根據(jù)已克隆得到cc8的基因序列，設計用于RT-qPCR的特異性引物 ^ccl8-F1 和 _ccl8-R1 。選取4尾健康的草魚，使用MS-222（ 100mg/L ）麻醉后，分別收集其肝胰臟、脾、頭腎、血、皮膚、腸、鰓、心臟、腦和肌肉10個組織。不同組織的總RNA提取和cDNA的合成方法同前。以不同組織的cDNA為模板，按照SYBRGreen的說明書在Bio-Rad CFX96TM Real Time System 平臺上進行RT-qPCR檢測。RT-qPCR反應體系為 20μL;0.4 μL 的cDNA 模板， 10μL 的SYBRGreen，上、下游引物各 0.4μL 以及DEPC 水 8.8μL 。反應條件為 94%2min;94%15s，58%15s，72%15s 共 40 個循環(huán)。 β -actin作為內(nèi)參基因[16]，采用 方法計算 ccl8 基因在各個組織中的相對表達量。

1.6嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲對草魚體內(nèi)ccl8mRNA 表達的影響

嗜水氣單胞菌對草魚 ccl8 表達的影響試驗設計如下：選取120尾健康的草魚，分成3個平行試驗組，每組40尾魚，維持水溫在 （26±2）^°C 。向魚體注射嗜水氣單胞菌（ ?2.7×10⁶ CFU/尾），該濃度可有效感染草魚且不致死亡[17]，感染后分別在0.3、6、9、12、24、48、72 和 96h 時間點每組取4尾魚的皮膚、肝胰臟、頭腎、脾和鰓5個組織，其總RNA提取和cDNA合成方法同上。使用RT-qPCR對不同組織在不同時間點的 ccl8 基因mRNA表達進行檢測，具體檢測方法與之前相同。

多子小瓜蟲對草魚 ccl8 表達的影響試驗設計如下：選取120尾健康的草魚，分為3個平行試驗組，每組40尾魚，維持水溫在 （26±2）^°C 。將試驗魚置于裝有 30L 水的大白桶中，進行感染試驗。按照1尾魚5000個多子小瓜蟲幼蟲的感染強度進行感染，感染 ^4h 后，將試驗魚轉(zhuǎn)移至 100L 的玻璃水缸中。感染后分別在 0h，6h，12h，24h. 36h，2d，3d，5d 和7d時間點每組取4尾魚的皮膚、肝胰臟、頭腎、脾和鰓5個組織，其總RNA提取和cDNA合成方法同上。使用RT-qPCR對不同組織在不同時間點的cc8基因mRNA表達進行檢測，具體檢測方法與之前相同。

1. 7 數(shù)據(jù)處理和分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值 ± 標準差表示。使用SPSS22.0軟件進行單因素方差方析和Duncan's多重比較分析來分析數(shù)據(jù)的顯著性差異。當 Plt; 0.05 時，表示差異具有顯著性。使用GraphpadPism9.5軟件繪制圖表。

2 結(jié)果和分析

2.1草魚ccl8基因的克隆及序列分析

通過克隆、測序獲得的草魚 ccl8 基因cDNA全長 675bp ，包括 172bp 的 5^′ 非編碼區(qū)（ 5^′ UTR） ?188bp 的 3^′ 非編碼區(qū)（ 3^′UTR^′ 以及編碼104個氨基酸殘基的 315bp 開放閱讀框（見圖1）。蛋白理化性質(zhì)分析表明，CCL8蛋白的分子量為 11.76kDa ，等電點（pI）為7.6，在組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基中絲氨酸（Ser）的含量最高，為12.5% ，其次是脯氨酸（Pro）和異亮氨酸（Ile），均占 7.7% 。CCL8蛋白的親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.055，屬于疏水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為62.09，歸類為不穩(wěn)定蛋白。

CCL8蛋白的前22個氨基酸是信號肽序列，在22與23位谷氨酸之間是信號肽和成熟肽的切割位點。蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，CCL8屬于CC型的趨化因子，含有趨化因子家族的SCY功能結(jié)構(gòu)域（見圖1）。CCL8蛋白三維空間結(jié)構(gòu)域主要由2個 ∝ 螺旋和3個β折疊組成（見圖2）。

2.2草魚ccl8基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

草魚ccl8基因氨基酸序列經(jīng)過多重序列比對和NCBI的Blast檢索表明，CCL8蛋白與其他魚類的CCL13、CCL8、CCL3、CCL4均有相似性，說明魚類CC型趨化因子家族的保守性很高。草魚的CCL8與團頭魴（Megalobrama amblycephala）的CCL8-like、安水金線鮑（Sinocyclocheilusanshuien-sis）的CCL13-like同源性最高，分別為 88.35% 和86.41% 。氨基酸多重序列比對發(fā)現(xiàn)，CCL8蛋白SCY功能結(jié)構(gòu)域比較保守，在氨基酸序列的第31、32、55和71位含有保守的4個半胱氨酸殘基（見圖3）。

構(gòu)建的氨基酸系統(tǒng)進化樹表明，魚類的趨化因子家族單獨聚為1簇，哺乳類也單獨聚為1簇。其中草魚的CCL8與團頭魴的CCL8-like聚為1個分支，二者在遺傳距離上最近，與其他魚類的CC型趨化因子家族的同源關系則較遠（見圖4）。

2.3 草魚 ccl8 基因的組織表達分布

對 ccl8 基因在健康草魚的各個組織（肝胰臟、脾、頭腎、血、皮膚、腸、鰓、心臟、腦、肌肉）中的表達進行檢測（見圖5），結(jié)果顯示， ccl8 基因在不同組織中的表達水平存在差異。具體而言，在肝胰臟中的相對表達量最高，其次是脾，這2個組織的相對表達量顯著高于其他組織（ Plt;0.05） 。此外，頭腎、皮膚和鰓中也呈現(xiàn)較高的表達水平，而腸和心臟中的相對表達量較低。腦、肌肉和血液中ccl8基因的相對表達量顯著低于其他組織（Plt;0.05） 。

注：柱狀圖上標不同字母表示組間差異顯著（ Plt;0.05 ），上標相同字母表示組間差異不顯著（ Pgt;0.05） ；各組樣本量 n 為4。

2.4嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲感染下 ccl8 的表達變化特征

試驗結(jié)果顯示，經(jīng)過嗜水氣單胞菌感染后，草魚肝胰臟中 ccl8 基因的相對表達量迅速增加，在6h 達到高峰（ Plt;0.05） ，而在脾組織中， ccl8 基因mRNA的表達量高峰出現(xiàn)在 12h（Plt;0. 05） ，頭腎組織中的 ccl8 基因在感染后 6h 開始出現(xiàn)表達上調(diào)， ^9h 達到峰值（ Plt;0.05） ；而鰓和皮膚中的 ccl8 基因mRNA表達量在感染后無明顯變化（見圖6）。經(jīng)多子小瓜蟲感染后，與多子小瓜蟲感染相關的組織中 ccl8 基因的mRNA水平出現(xiàn)顯著性上調(diào)，其中皮膚中 ccl8 基因的mRNA水平在感染 24h 后出現(xiàn)顯著性上升， ^48h 后達到峰值（ Plt;0.05 ），隨后逐漸降低。頭腎、鰓和脾中 ccl8 基因的mRNA水平在多子小瓜蟲感染后也出現(xiàn)顯著性上調(diào)，頭腎和鰓中 ccl8 基因的mRNA水平在感染 ^36h 后出現(xiàn)峰值，而脾中 ccl8 基因的mRNA水平在感染 48h 后才達到峰值（見圖7）。

2組感染試驗結(jié)果均表明， ccl8 基因在病原體感染后能夠迅速響應，在免疫相關組織中表達顯著上升，表明 ccl8 基因參與草魚抗病原感染免疫反應。

3 討論

CC型趨化因子通過引導免疫細胞的遷移和定位，在魚類免疫應答中起到重要的調(diào)節(jié)作用[18]。近年，有研究表明，CC 型趨化因子還類似抗菌肽（AMP）具有抗菌活性[19]。本試驗成功克隆并識別了草魚ccl8基因，該基因全長為 675bp 開放閱讀框為 315bp ，編碼104個氨基酸殘基，蛋白分子量為 11.76kDa 。氨基酸多重序列比對結(jié)果顯示，草魚CCL8趨化因子蛋白與其他動物的CCL8趨化因子蛋白具有相似性，其中包含了4個保守的半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸殘基位于靠近N端位置，其中2個半胱氨酸殘基相鄰存在，這將直接影響蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和功能活性[2]系統(tǒng)進化樹結(jié)果分析表明，魚類的CC型趨化因子單獨聚為一簇，草魚的CCL8與團頭魴的CCL8-like的遺傳距離最近，與其他魚類同源關系較遠，符合進化規(guī)律。大量研究表明，CCL8作為CC型趨化因子的成員，具有調(diào)節(jié)機體炎癥反應和免疫應答等方面的作用[20]。因此豐富對魚類的CCL8趨化因子的研究和認識，具有現(xiàn)實意義。

隨著對魚類免疫系統(tǒng)研究的逐步深入，魚類的趨化因子已經(jīng)引起了人們的普遍重視。魚類趨化因子的研究主要集中在CC型和CXC型，大部分研究僅限于基因克隆和表達分析[12-13]，對其功能研究較少。有研究表明，魚類的CC型和CXC型趨化因子在組織中廣泛表達，具有廣譜性[21-22]。在本研究中，這一現(xiàn)象也得到了驗證。試驗結(jié)果顯示，草魚 ccl8 基因在多種組織中都有表達，包括肝胰臟、脾、頭腎、血液、皮膚、腸道、鰓、心臟、腦和肌肉。這表明魚類趨化因子具有廣譜性的表達，它們不僅在免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色，還可能參與其他生理過程。此外，不同種類的魚類趨化因子在組織分布上存在差異，主要分布在免疫相關的組織，如皮膚、鰓、頭腎、肝胰臟和脾[11，22]，這與本研究中ccl8基因在草魚組織中的表達情況相一致。魚類免疫相關組織中免疫細胞存量多，這也是趨化因子的趨化功能與組織空間分布相適應的結(jié)果[19] O

注：柱狀圖上標不同字母表示組間差異顯著（ Plt;0.05 ），上標相同字母表示組間差異不顯著（ Pgt;0. 05 ；每個時間點各組樣本量 n 為4。

注：柱狀圖上標不同字母表示組間差異顯著（ Plt;0.05 ），上標含相同字母表示組間差異不顯著（ Pgt;0.05 ；每個時間點各組樣本量 n 為4。

羅了小瓜蟲怕首小氣牛胞函足伙小外阻魚夫的常見病原體，也是危害草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的常見病原。本研究通過草魚人工感染嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲后發(fā)現(xiàn)，草魚免疫組織中ccl8基因的mRNA表達水平明顯上升，這表明ccl8基因在草魚抵抗病原體感染的過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，趨化因子在對抗外部病原體侵襲引發(fā)的組織損傷（炎癥反應）中扮演關鍵角色，例如，牙鲆（Paralichthysolivaceus）的趨化因子CXCL9在遲緩愛德華氏菌（Edwardsiellatarda）和鰻弧菌（Vibrioanguillarum）感染后在肝臟、脾和頭腎組織中的表達顯著上調(diào)[22]。另外，脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（polyI：C）刺激以后可激活趨化因子，招募相關的免疫細胞如白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞遷移至炎癥部位或感染部位發(fā)揮作用[23-24]。本試驗表明，草魚經(jīng)人工感染嗜水氣單胞菌后，肝胰臟、脾和頭腎中 ccl8 基因的相對表達量迅速上升，而在多子小瓜蟲感染后，脾、頭腎、鰓和皮膚組織中 ccl8 基因的相對表達量也呈現(xiàn)顯著性上調(diào)。以上結(jié)果說明， ccl8 基因?qū)Σ≡w感染具有明顯的快速響應過程。根據(jù)組織的表達響應情況，嗜水氣單胞菌感染后，肝胰臟中ccl8基因的表達顯著上調(diào)，而皮膚組織中沒有明顯變化；而在多子小瓜蟲感染后，皮膚中 ccl8 基因的表達顯著上調(diào)，肝胰臟中則沒有明顯變化，這可能與不同病原體對宿主的感染途徑有關。根據(jù)表達時效性來看， ccl8 基因在細菌感染后迅速作出響應，相對表達量迅速上升并達到峰值，然后快速恢復正常水平；而在多子小瓜蟲感染后，ccl8基因相對表達量則緩慢上升，并且持續(xù)時間較長，這可能與人工感染方式相關。嗜水氣單胞菌的人工感染方式為腹腔注射，繁殖速度快，而多子小瓜蟲主要是浸泡感染，繁殖周期長。另外，在本試驗中，草魚肝胰臟和皮膚中cc8基因的表達量分別在其感染嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲后快速上升，這也表明了皮膚和肝臟是魚類非特異性免疫場所。病原體感染后，趨化因子迅速響應并表達上調(diào)，之后又恢復正常水平，表明趨化因子在機體抗病原體感染過程中，不僅參與非特異性免疫反應，還起到橋接先天性和特異性免疫反應的作用。

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Cloning， identification of chemokine gene ccl8 in grass carp （Ctenopharyngodon idella） and its expression responses to Aeromonas hydrophila and Ichthyophthirius multifiliis infections

HE Menghan1，2.3， LI Yue3， CEN Yiting3， GUO Shuquan3

（1. Innovation Technology Center of HAID Research Institute， Guangdong HAID Group Co. ，Ltd. ， Guangzhou 511442，China; 2. College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University，Changsha 410128， China； 3. Institute of Hydrobiology， Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Abstract： To enrich the related research on the immune regulatory mechanism of chemokines in grass carp （Ctenopharyngodon idella），the ccl8 gene was cloned. The full-length of cc8 cDNA is 675 bp，the open reading frame is 315 bp，and it encodes 104 amino acids.This gene displays typical characteristics of the chemokine superfamily，with four conserved cysteine residuesat amino acids positions 31，32，55，and71.Amino acid sequence homology analysis indicated that the ccl8 gene of grass carp had a relatively high homology （ 88.35% ）with the ccl8 -like gene of Megalobrama amblycephala. Real-time fluorescence quantitative PCR showed that the ccl8 mRNAwas expressed in1O diferent tissues ofhealthy grasscarp.The expression level was highest inthe immune tissues hepatopancreas and spleen，and relatively high inthe head kidney，skin，intestine，gillsand heart.However，the expression level was the lowest in the blood，brain and muscle.This indicates that the ccl8 gene is generally expressed in diffrent tissues of grasscarp. After being infected byAeromonas hydrophila，the expression of ccl8 mRNA in the hepatopancreas rapidly increased at 6 hours post-infection. In contrast，the peak expression levels in the head kidney and spleen were observedat9 hoursand12 hours post-infection，respectively.The expression levels in tissuessuch as skin and gils didn'tchange significantly.After being infected by Ichthyophthirius multifilis，the expressionof ccl8 mRNA in theskin and spleen tissues reached itspeak at 48 hours post-infection，while the peak expresson in thegilsand head kidney was observed at 36hours post-infection.The results indicated that thecl8 genes can promptly respond to infectionsby Aeromonas hydrophila and Ichthyophthiriusmultiflis indiffrent tissues，with responsesrelated tothe invasionsites.Thispromptresponse potentially contributes to immune regulation in grasscarp and plays a critical role in defending against pathogen infections.

Key words： grass carp ; ccl8 ；chemokine；gene cloning；expression analysis；Aeromonas hydrophila； Ichthyoph-thirius multifiliis