重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的應(yīng)用

Application of Recombinase-Mediated Nucleic Acid Amplification Technology for Detecting of Vibrio parahaemolyticus in Aquatic Products

ZHANG Xiaoyan12， XU Qiusheng12，LIU Jun12， XU Yemei12， SHEN Wei2* （1.Pinghu Food and Drug Testing Center， Jiaxing ， China; 2.Pinghu Product Quality Supervision and Inspection Institute， Jiaxing ， China）

Abstract： Vibrio parahaemolyticus is the main pathogen causing foodborneilness，and itisof great significance to establish arapid and accurate detection technology to prevent food poisoning causedby Vibrio parahaemolyticus. In this study，a highly effcient detection method for Vibrio parahaemolyticus was established basedonrecombinaseaided amplification （RAA）.By comparing the sensitivity and specificity of the traditional culture method with the RAA technique，and optimizing the experimental parameters，the applicability of the RAA method in the detection of Vibrio parahaemolyticus was verified.The results show that RAA technology can directly detect the sample，and the results can be obtained in only ^2h to ^3h .For the low bacterial volume samples， the total detection time could be controlled within 10h after 6h to 8h of bacterial enhancement pretreatment， which significantly shortened the detection time. The established RAA detection method has high specificity （ 100% ）and sensitivity，and is suitable for the on-site rapid detection of Vibrio parahaemolyticus in aquatic products and other foods.

Keywords： Vibrio parahaemolyticus; recombinase-aided amplification; quick detection

副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus）作為一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，其隸屬于變形菌門弧菌科弧菌屬，主要定殖于近海水體、港口及咸淡水交匯區(qū)域[]。該病原體具有雙重致病特性：通過污染海產(chǎn)品引發(fā)人類急性胃腸炎、腹瀉、創(chuàng)傷感染及敗血癥等食源性疾病[；可感染魚、蝦、蟹等甲殼類及貝類水產(chǎn)動(dòng)物，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，副溶血性弧菌已連續(xù)多年位列我國食源性疾病病原體首位，其中沿海地區(qū)由其引發(fā)的食源性中毒事件占比在 50%～70% ，公共衛(wèi)生影響顯著[4-5]。

現(xiàn)行副溶血性弧菌檢測(cè)方法為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB4789.7—2013）。該傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法雖特異性良好，但存在操作煩瑣、周期冗長（5～7個(gè)工作日）等局限性?！哆M(jìn)出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T2424—2010）[，雖將檢測(cè)周期縮短至 24h ，但仍受限于精密儀器配置、專業(yè)操作人員及高昂檢測(cè)成本，難以滿足基層現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)需求。

新型重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase-AidAmplification，RAA）突破傳統(tǒng)溫控限制，其核心機(jī)制在于重組酶-引物復(fù)合物的動(dòng)態(tài)作用：重組酶與特異性引物結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過靶向性掃描識(shí)別模板DNA同源序列，在單鏈DNA結(jié)合蛋白協(xié)同下解旋雙鏈結(jié)構(gòu)，最終在DNA聚合酶催化下完成指數(shù)級(jí)核酸擴(kuò)增。結(jié)合熒光探針標(biāo)記技術(shù)，可在恒溫條件下實(shí)現(xiàn) 5～15min 的快速檢測(cè)，并同步完成定量分析[。該技術(shù)兼具操作簡便、設(shè)備普適性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可為現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供創(chuàng)新解決方案。

1材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1 儀器與設(shè)備

GENCHEK熒光檢測(cè)儀（杭州眾測(cè)生物科技有限公司）；PCR專用離心機(jī)；金屬?。籗HP-250D生化培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DK-S12恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

3% 氯化鈉堿性蛋白脈水、TCBS選擇性瓊脂及營養(yǎng)瓊脂（青島海博生物科技有限公司）；DNA快速提取試劑（杭州眾測(cè)生物科技有限公司）、RAA檢測(cè)試劑盒（杭州眾測(cè)生物科技有限公司）。

1.1.3 菌株來源

副溶血性弧菌（ATCC17802）、鼠傷寒沙門菌（ATCC14028）、福氏志賀菌（CMCC51572）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、單增李斯特菌（ATCC19114），均購自青島海博生物科技有限公司標(biāo)準(zhǔn)菌種庫，復(fù)蘇后經(jīng)VITEK2Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)確認(rèn)種屬純度。

1.1.4樣品來源

于2020年6—8月采集平湖市當(dāng)湖街道農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)不同攤位各類水產(chǎn)品樣品50份。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

選取副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等6種標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別接種于相應(yīng)選擇性液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化增殖。完成復(fù)蘇后，采用四區(qū)劃線法將各菌液分別轉(zhuǎn)移至專屬鑒別培養(yǎng)基平板，置于 36°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24h 。隨后選取典型形態(tài)菌落進(jìn)行二次劃線純化，在營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行 24h 單菌落分離培養(yǎng)，獲得純化菌株備用。

1.2.2 菌落計(jì)數(shù)

針對(duì)副溶血性弧菌ATCC17802的 24h 純培養(yǎng)物，采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ?.5McFarland標(biāo)準(zhǔn)）配制初始菌懸液，通過連續(xù)10倍系列稀釋制備 10^-1 至 10^-7 梯度稀釋液。選取 10^-4 、 10^-5 、 10^-6 、 10^-74 個(gè)稀釋梯度，每個(gè)梯度設(shè)置雙平行樣，各取 1mL 菌液傾注于固體培養(yǎng)基平板。經(jīng) 36^°C 恒溫培養(yǎng) 48h ，觀察到 10^-5 、10^-6 、 10^-73 個(gè)稀釋梯度形成可計(jì)數(shù)的離散菌落。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定 10^-6 稀釋度（雙平板平均菌落數(shù)62個(gè)）為最佳計(jì)數(shù)區(qū)間，計(jì)算得出的原始菌液濃度為 6.2×10⁶CFU?mL^-1 。所有梯度稀釋樣品經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后于 4^°C 冷藏待用。

1.2.3 模板DNA制備

根據(jù)DNA快速提取試劑盒說明書提取DNA，吸取 1mL 樣品培養(yǎng)物，放人裝有 0.5mL Lysis Buffer的試劑管中，蓋緊試劑管蓋， 70% （金屬?。┘訜?0min （加熱過程中每隔 2～3min 用手輕彈混勻），加熱后冷卻室溫，離心 1～2min ，上清液即為DNA模板。根據(jù)此方法進(jìn)行樣品DNA提取，并置于-20^qC 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4RAA檢測(cè)

根據(jù)副溶血性弧菌分子檢測(cè)試劑（RAA-熒光型）使用說明書進(jìn)行樣本檢測(cè)。 ① 向裝有干粉酶制劑的檢測(cè)單元管中加入 45.5μL 的Buffer A 。 ② 向檢測(cè)單元管中加入 2.0μL 按1.2.3項(xiàng)方法處理得到的待測(cè)DNA、陽性對(duì)照或陰性對(duì)照。 ③ 向單元管加入2.5μL BufferB，蓋上管蓋，上下顛倒混勻 5～6 次，低速離心 10s 。 ④ 將檢測(cè)單元管放人GENCHEK熒光檢測(cè)儀中，選擇“RAA”檢測(cè)程序，開始檢測(cè)，20min 后自動(dòng)判定檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果判定方法。 ① 陽性對(duì)照。有典型的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，出峰時(shí)間 ?15min ，為有效結(jié)果。 ② 陰性對(duì)照：無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，或出峰時(shí)間 ?20min ，為有效結(jié)果。 ③ 檢測(cè)樣本：若出峰時(shí)間 ?17.5min ，可判斷為陽性；若 17.5minlt; 出峰時(shí)間 lt;20min ，則需重復(fù)檢測(cè)確認(rèn)。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

將副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等6種標(biāo)準(zhǔn)菌株按照1.2.3項(xiàng)方法處理并提取DNA，再按照1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行RAA檢測(cè)，對(duì)RAA檢測(cè)副溶血性弧菌特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

采用連續(xù)10倍系列稀釋法開展實(shí)驗(yàn)，評(píng)估RAA檢測(cè)體系的靈敏度。以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為對(duì)象，制備濃度梯度為 10^-1 至 10^-7 的菌懸液。隨后，按照1.2.3項(xiàng)方法對(duì)各濃度菌懸液進(jìn)行基因組DNA提取，并進(jìn)行RAA擴(kuò)增分析，以此確定該檢測(cè)方法的檢測(cè)下限。同時(shí)，設(shè)置傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將相同濃度梯度的稀釋液采用四區(qū)劃線法接種至TCBS選擇性培養(yǎng)基，在 36^°C 恒溫條件下培養(yǎng)24h 后，記錄最小可見菌落形成單位。

2 結(jié)果與分析

2.1特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用熒光型RAA檢測(cè)體系對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株（副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌等）進(jìn)行交叉驗(yàn)證。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，僅副溶血性弧菌樣本呈現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線（熒光信號(hào)增長值 gt;40 000 ），其余菌株的終點(diǎn)熒光值均 lt;500 （判定閾值10000），表明該體系具有高度特異性（ 100% ）。檢測(cè)結(jié)果詳見圖1。

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

借助瓊脂平板計(jì)數(shù)法，測(cè)得副溶血性弧菌原菌液的細(xì)菌濃度為 6.2×10⁷CFU?mL^-1 。采用RAA方法，對(duì)經(jīng)過系列10倍梯度稀釋的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，RAA法在 10^-4～10^-1 的稀釋度范圍內(nèi)均能夠有效地檢出副溶血性弧菌，且陽性反應(yīng)時(shí)間會(huì)隨著菌液濃度的降低而逐漸延長。經(jīng)計(jì)算，該檢測(cè)方法對(duì)副溶血性弧菌的靈敏度達(dá) 6.2×10³ CFU mL^-1 。相關(guān)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。而采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其靈敏度為6.2×10⁴CFU?mL^-1 。對(duì)比兩種檢測(cè)方法的敏感度可知，RAA法的靈敏度較傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法更高，具體數(shù)據(jù)見表1。

2.3 方法優(yōu)化

RAA產(chǎn)品說明書要求前增菌時(shí)間參考國家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行操作，但檢測(cè)副溶血性弧菌前增菌所需時(shí)間較長，為了優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間，本文將人工模擬樣品，精確稱取經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)副溶血性弧菌呈陰性的蝦肉餡樣品，每份 25g ，共準(zhǔn)備4份。分別取 1mL 10^-4 、 10^-5 、 10^-6 ！ 10^-7 的副溶血性弧菌菌懸液，加入4份蝦肉餡中（編號(hào)A1、A2、A3、A4），并充分混合均勻。此時(shí)，4份人工染菌蝦肉餡樣品的染菌量依次為 6.2×10³ 、 6.2×10² 、 6.2×10¹ ！ 6.2×10⁰CFU/25g 。

隨后，將4份人工染菌的蝦肉餡樣品按照 1：10 加入含有 3.0% 氯化鈉的堿性蛋白肺水增菌液中。分別在增菌前以及在 36^°C 條件下培養(yǎng)2、4、6、8h后，依照1.2.3項(xiàng)方法提取DNA，并進(jìn)行RAA檢測(cè)。通過比較樣品從培養(yǎng)前到培養(yǎng) 8h 期間RAA檢測(cè)結(jié)果的變化情況，分析不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。檢測(cè)結(jié)果顯示，在增菌 2h 后可以檢出 10² 數(shù)量級(jí)的染菌量，增菌 ^4h 后可檢出 10¹ 數(shù)量級(jí)的染菌量，增菌 6h 后可檢測(cè)到 lt;10CFU/25g 的樣本，詳見表2。

按照優(yōu)化的前增菌培養(yǎng)時(shí)間，采用RAA法檢測(cè)流通環(huán)節(jié)收集的50批次水產(chǎn)品樣品中的副溶血性弧菌檢測(cè)，同時(shí)用傳統(tǒng)方法（GB4789.7—2013）進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法共檢出副溶血性弧菌陽性樣本9份（ 18.0% ），RAA法檢出副溶血性弧菌陽性樣本9份（ 18.0% ）。采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法檢出陽性的樣品在RAA法檢測(cè)中均為陽性，兩者陽性符合率達(dá) 100.0% ，未出現(xiàn)假陽性和漏檢的情況。

3結(jié)論與討論

本研究通過系統(tǒng)比較RAA與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測(cè)效能，揭示RAA技術(shù)在副溶血性弧菌檢測(cè)中的顯著應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，具體體現(xiàn)在以下方面。 ① 特異性優(yōu)勢(shì)?；诟比苎曰【禺愋曰蛟O(shè)計(jì)的引物-探針組合，通過雙重特異性保障實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌株的精準(zhǔn)識(shí)別。50份臨床樣本的平行檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽性樣本的符合率達(dá) 100% ，且與其他常見致病菌無交叉反應(yīng)，表明其特異性極高。 ② 靈敏度優(yōu)勢(shì)。定量分析表明，RAA檢測(cè)靈敏度較傳統(tǒng)培養(yǎng)法提升一個(gè)數(shù)量級(jí)。結(jié)合優(yōu)化的前增菌方案（ （6～8h ），可穩(wěn)定檢測(cè) lt;10CFU/25g 的低載量樣本，有效提升了微量病原體檢出能力。 ③ 檢測(cè)時(shí)效性。傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括培養(yǎng)基制備、增菌培養(yǎng)（ 24～48h ）、生化鑒定等多步驟，耗時(shí) 5～7d. 。RAA技術(shù)通過整合核酸擴(kuò)增與實(shí)時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn) 2～3h 快速檢測(cè)；對(duì)低菌量樣本采用6h前增菌聯(lián)用方案，總耗時(shí)可控制在 ^10h 內(nèi)。 ④ 操作安全與自動(dòng)化。密閉式全自動(dòng)檢測(cè)體系可有效規(guī)避氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，集成化設(shè)備可實(shí)現(xiàn)“擴(kuò)增－檢測(cè)-分析流程”一體化，降低人工操作誤差。實(shí)際應(yīng)用數(shù)據(jù)顯示，該方法可明顯減少人工操作步驟，顯著提升檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化程度。

基于上述優(yōu)勢(shì)，本研究建立“RAA初篩－靶向培養(yǎng)確認(rèn)”的二級(jí)檢測(cè)模式：經(jīng)6h前增菌處理后，RAA初篩陽性樣本進(jìn)行靶向培養(yǎng)驗(yàn)證，陰性樣本直接排除。該策略明顯縮短了檢測(cè)周期，提升了陽性檢出率，降低了假陰性率。RAA技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)是一種理想的檢測(cè)方法，尤其適用于以下場(chǎng)景： ① 食品安全日常監(jiān)測(cè)中可實(shí)現(xiàn)高通量篩查（日處理量 gt;200 樣本）； ② 食源性疾病暴發(fā)應(yīng)急處置時(shí)，"^4h"內(nèi)完成病原體溯源?，F(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，該方法在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)的操作培訓(xùn)時(shí)間僅需8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)學(xué)時(shí)，設(shè)備便攜性滿足流通環(huán)節(jié)快檢需求，具有顯著的公共衛(wèi)生應(yīng)用價(jià)值。

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