人子宮腺肌病相關(guān)原代細胞培養(yǎng)的研究進展

[摘要] 子宮腺肌病是一種常見的雌激素依賴性婦科良性疾病，是子宮內(nèi)膜（包括腺體和間質(zhì)）侵入子宮肌層生長而產(chǎn)生的病變。盡管子宮腺肌病是良性疾病，但其發(fā)展過程與惡性腫瘤的生物學(xué)行為相似，發(fā)病機制復(fù)雜，具有易復(fù)發(fā)及難治性的特點，目前仍缺乏有效的治療藥物。近年來子宮腺肌病的發(fā)病率呈上升趨勢，且趨于年輕化，但其發(fā)病機制至今仍不清楚。子宮腺肌病患者的在位和異位子宮內(nèi)膜原代細胞培養(yǎng)是子宮腺肌病研究中必要且廣泛使用的工具。本文通過文獻檢索，闡述子宮腺肌病在位和異位子宮內(nèi)膜原代細胞培養(yǎng)的各種方法，旨在獲得人子宮腺肌病原代子宮內(nèi)膜細胞最高效和最簡便的方法，為進一步探索人子宮腺肌病的發(fā)病機制和藥物篩選研究提供有價值的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

[關(guān)鍵詞] 原代細胞培養(yǎng)；子宮腺肌??；子宮內(nèi)膜

[中圖分類號] R711.71" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.18.023

子宮腺肌病是一種常見的雌激素依賴性婦科良性疾病，是指具有活性的子宮內(nèi)膜遷移至子宮肌層并繼續(xù)生長、增殖，病灶呈局灶性或彌漫性改變^[1]。子宮腺肌病的主要癥狀是疼痛（進行性加重的痛經(jīng)、盆腔疼痛）和異常子宮出血，繼發(fā)貧血及不孕。子宮腺肌病還與較低的臨床妊娠率、較高的流產(chǎn)率和妊娠并發(fā)癥有關(guān)，這些癥狀嚴重影響育齡期女性的身心健康^[2]。子宮腺肌病雖為良性疾病，但具有惡性腫瘤的生物學(xué)行為及一定的惡變潛能，是婦科和醫(yī)療保健經(jīng)濟學(xué)中的臨床挑戰(zhàn)之一^[3]。盡管有大量關(guān)于子宮腺肌病的文獻，但人們對這一疾病的發(fā)病機制仍不清楚，目前尚無有效的治療藥物。大多數(shù)子宮腺肌病的重點研究主要依賴臨床樣本提供描述性研究，對功能或機制理解的實施有限。根據(jù)目前被廣泛接受的子宮內(nèi)膜內(nèi)陷理論，獲取子宮腺肌病患者的在位和異位子宮內(nèi)膜原代細胞是該疾病研究中必要且廣泛使用的工具。

近年來，細胞生物學(xué)發(fā)展迅速，細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)在實驗室程序和實驗條件的支持下，為體外研究健康和疾病狀態(tài)的病理和生理學(xué)過程提供廣泛機會^[4]。原代細胞體外培養(yǎng)使人們能更深入地理解細胞生物學(xué)、疾病機制領(lǐng)域的知識，并在藥物測試方面發(fā)揮巨大作用^[5]。實驗室培養(yǎng)的患者來源原代細胞是用以研究疾病過程簡單且具有成本效益的方法，這些原代細胞常用于婦科醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究^[6]。相對于細胞系而言，原代培養(yǎng)的細胞更加接近和反映機體生長的特性。然而，原代細胞培養(yǎng)存在不易培養(yǎng)、存活率低等不足，且在有限數(shù)量的體外傳代后無法

存活。此外，來自非癌組織的原代細胞在體外培養(yǎng)時壽命有限，增殖能力降低^[7]。大部分文獻報道子宮腺肌病病灶原代細胞培養(yǎng)產(chǎn)物均為異位子宮內(nèi)膜上皮細胞、間質(zhì)細胞及平滑肌細胞等混合細胞。關(guān)永格等^[8]報道人子宮腺肌病病灶細胞的原代培養(yǎng)和鑒定，然而未后續(xù)進行人子宮腺肌病病灶異位上皮細胞和間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)。細胞的分離純化方法有離心分離法、過濾分離法和基于細胞表面特征的免疫磁珠分離法及流式細胞術(shù)。免疫磁珠分離法和流式細胞術(shù)因技術(shù)要求和成本較高，目前還未應(yīng)用于原代子宮腺肌病病灶細胞的分離和純化。流式細胞術(shù)需細胞高速流動，影響細胞活性，且操作過程中難以嚴格無菌操作，分選后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)存活困難易被污染。針對這些難點問題，通過識別和采集人子宮腺肌病病灶的異位子宮內(nèi)膜組織，采用Ⅰ型膠原酶消化法對已獲得的異位子宮內(nèi)膜組織進行消化及后續(xù)原代細胞培養(yǎng)，通過簡單可操作的無菌細胞濾網(wǎng)過濾法分離培養(yǎng)的原代細胞，最后經(jīng)流式細胞術(shù)進行細胞類型鑒定、純度和活性分析，成功分離出活性好、純度高的異位上皮和間質(zhì)細胞^[9]。

1" 人子宮腺肌病在位子宮內(nèi)膜原代細胞培養(yǎng)

1.1" 標本的采集和處理

選取接受宮腔鏡手術(shù)或全子宮切除術(shù)的子宮腺肌病患者標本，收集在位子宮內(nèi)膜組織。子宮全切手術(shù)標本離體后用刀片Y型剖開子宮，另取干凈無菌刀片輕輕刮取在位子宮內(nèi)膜組織保存于達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）/F12（Ham’s F-12）中，4℃下24h內(nèi)進行細胞分離和培養(yǎng)。將全部標本及培養(yǎng)基倒入10cm無菌培養(yǎng)皿中，PBS洗滌3次，用無菌眼科剪將在位子宮內(nèi)膜組織剪成1～2mm³大?。籔BS再次沖洗剪碎的內(nèi)膜并用巴氏管吸取至50ml離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清液。整個過程需嚴格無菌操作。

1.2" 標本的消化

對處理后的標本進行消化。用于消化在位子宮內(nèi)膜組織的酶類主要為膠原酶，部分研究聯(lián)合脫氧核糖核酸酶進行組織消化。酶類工作濃度各異，大部分文獻的酶類濃度為0.10%～0.25%，消化所需時間約1h，Wang等^[10]消化標本的方法是加入含0.2%Ⅰ型膠原酶和含0.005%脫氧核糖核酸酶的混合液，37℃下完全消化40～50min。戚瑩瑩等^[11]消化標本的方法是在處理好的標本中滴入0.1%的Ⅰ型膠原酶后置入37℃溫箱5h，消化完畢后滴入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的完全培養(yǎng)基并過濾和離心，1000轉(zhuǎn)/min離心3次，每次8min。Che等^[12]采用1mg/ml的Ⅲ型膠原酶37℃下消化60min。Yokomizo等^[13]用100μg/ml的Ⅰ型膠原酶將剪碎的子宮內(nèi)膜組織置37℃振蕩培養(yǎng)箱中消化2h。Guo等^[14]將處理后的標本放入含有Ⅰ型膠原酶（0.25%）、羥乙基哌嗪乙磺酸（0.02mol/L）和胰蛋白酶（0.006%）的混合液中37℃消化60min。

1.3" 原代細胞的分離和培養(yǎng)

大部分研究報道原代子宮內(nèi)膜細胞的分離均通過無菌細胞過濾器完成。該方法操作簡便，成本低；而關(guān)于哪種孔徑細胞濾網(wǎng)分離的細胞純度高目前并無相關(guān)報道。Che等^[12]通過200μm和70μm細胞過濾器連續(xù)2次過濾分離子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞；隨后將子宮內(nèi)膜上皮細胞重懸于原代上皮生長培養(yǎng)基中，并在補充含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。Yokomizo等^[13]通過100μm和40μm尼龍網(wǎng)過濾并分離細胞，離心收集細胞沉淀重懸于含有1%青霉素–鏈霉素及10% FBS的DMEM中培養(yǎng)。Guo等^[14]使用100μm和70μm尼龍細胞過濾器過濾細胞，分離出的上皮和間質(zhì)細胞在含抗生素及5% FBS的DMEM/F12中培養(yǎng)。

2" 人子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜原代細胞培養(yǎng)

2.1" 標本的采集和處理

選取因子宮腺肌病行子宮腺肌病灶剔除術(shù)或全子宮切除術(shù)患者的病灶組織標本。既往文獻報道在無菌條件下取直徑1～2cm的新鮮子宮腺肌病灶組織標本后置入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中低溫保存，盡早轉(zhuǎn)移至超凈臺處理。用PBS洗滌3次以去除碎片和多余血細胞。用無菌刀片及眼科剪將組織剪碎至0.5～1.0mm³大小轉(zhuǎn)移至另一無菌50ml離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清液。Fang等^[9]對標本的處理過程較子宮腺肌病病灶組織簡單，可極大縮短處理標本的時間，確保細胞活性。

2.2" 標本的消化

Wang等^[15]將處理后子宮腺肌病病灶組織以2mg/ml Ⅳ型膠原酶（體積比為1：4）37℃恒溫下緩慢振蕩消化4h后，加入3倍體積的完全培養(yǎng)基（含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基）終止消化。Huang等^[16]則采用Ⅱ型膠原酶和脫氧核糖核酸酶Ⅰ于室溫下消化4～5h。姜心禪等^[17]加入適量0.1%Ⅰ型膠原酶，置于37℃恒溫箱消化5～6h。韓妍等^[18]將處理后組織置于終濃度為2.5g/L的Ⅳ型膠原酶溶液中37℃消化4～6h，反復(fù)震蕩，待組織呈云霧狀時終止消化。上述文獻的標本消化方法均是對子宮腺肌病病灶組織的消化方法。Fang等^[9]將處理后子宮腺肌病病灶中的異位內(nèi)膜組織加入0.2%Ⅰ型膠原酶（體積比為1：3）置于37℃恒溫搖床上緩慢振蕩30～60min，消化時間由標本量決定，證實該方法可極大縮短消化時間，減少消化酶對細胞的損傷，提高細胞活性和存活率。

2.3" 原代細胞的分離和培養(yǎng)

大部分研究將子宮腺肌病病灶異位混合細胞簡單過濾去除雜質(zhì)后直接種皿進行培養(yǎng)，最后經(jīng)免疫細胞化學(xué)法（角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白）鑒定用于后續(xù)實驗研究。另有研究將消化后的細胞懸液用尼龍網(wǎng)過濾去除未消化的組織碎片，離心后將細胞重懸于含10%～15% FBS的DMEM中，5% CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)用于后續(xù)實驗^[15-16]。

子宮腺肌病病灶組織較硬，消化時間長，常導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)損傷，細胞培養(yǎng)成活率降低或無法貼壁。韓妍等^[18]將細胞混懸液接種于鋪有多聚賴氨酸的蓋玻片上培養(yǎng)，利用差速脫壁法分離和純化細胞，但最終未實現(xiàn)子宮腺肌病病灶中異位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞的高度純化，提示子宮腺肌病病灶中異位細胞種類較多不易分離提純。Fang等^[9]應(yīng)用100μm和40μm無菌細胞濾網(wǎng)過濾法成功分離和培養(yǎng)子宮腺肌病病灶異位上皮和間質(zhì)細胞，其中上皮細胞培養(yǎng)成功率62.5%，間質(zhì)細胞成功率87.5%，異位上皮和間質(zhì)細胞純度均在90%以上。

3" 小結(jié)與展望

目前，子宮腺肌病的具體發(fā)病機制不明確，與之相關(guān)臨床癥狀嚴重威脅女性身心健康。人子宮腺肌病在位和異位子宮內(nèi)膜培養(yǎng)物是研究子宮腺肌病的有力工具。細胞系的培養(yǎng)程序簡單，易于培養(yǎng)，但缺乏個體間差異，具有局限性。當前子宮腺肌病在位子宮內(nèi)膜原代細胞分離和培養(yǎng)程序已較成熟。現(xiàn)有文獻報道分離子宮內(nèi)膜細胞的最常用方法是使用濃度0.1%～0.2%的Ⅰ型膠原酶對組織消化60min，應(yīng)用細胞濾網(wǎng)過濾法對細胞進行分離培養(yǎng)。該方法存在一定的局限性，特別是對子宮內(nèi)膜上皮細胞，培養(yǎng)困難、數(shù)量少、壽命有限、不能正常擴增；也不能增殖并獲得更高的融合；無法后續(xù)傳代。組織標本消化時間的掌控至關(guān)重要，不宜過度消化，一旦消化過度將嚴重影響原代細胞的活性及貼壁能力；但若消化不足，細胞產(chǎn)量嚴重減少，過濾后細胞所剩無幾，無法滿足實驗要求。因此有待進一步研究具體使用哪種膠原酶及其最佳作用時間和濃度培養(yǎng)出數(shù)量最多、純度和活力更好的細胞。此外對在位子宮內(nèi)膜細胞的分離，大部分研究均采用細胞濾網(wǎng)過濾法分離細胞，該方法操作簡便、成本低，但不同研究使用濾網(wǎng)的孔徑不同，何種孔徑尺寸能分離出更高純度的細胞亦有待進一步研究對比。

與既往文獻報道的細胞培養(yǎng)方法相比，F(xiàn)ang等^[9]報道的子宮腺肌病異位內(nèi)膜的細胞培養(yǎng)方法在處理和消化標本方面程序簡易、耗時短，可極大縮短細胞種皿前時間，提高細胞活性，并可分離純化子宮腺肌病病灶異位上皮和間質(zhì)細胞，最后流式細胞術(shù)進行鑒定及純度分析，結(jié)果顯示異位上皮和間質(zhì)細胞純度均高達90%以上。這為子宮腺肌病的研究提供一個簡單、可行、快速的體外細胞培養(yǎng)方法，并在理論上提供子宮腺肌病靶向治療研究的新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1]"" 王宇慧， 武俊麗. 雌激素介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在子宮腺肌病中的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述， 2022， 28（1）： 34–39.

[2]"" DEDES I， KOLOVOS G， ARRIGO F， et al. Radio- frequency ablation for adenomyosis[J]. J Clin Med， 2023， 12（9）： 3069.

[3]"" CHE X， WANG J， SUN W， et al. Effect of mifepristone vs placebo for treatment of adenomyosis with pain symptoms： A randomized clinical trial[J]. JAMA Netw Open， 2023， 6（6）： e2317860.

[4]"" GRADI?NIK L， BO?NJAK R， BUNC G， et al. Neurosurgical approaches to brain tissue harvesting for the establishment of cell cultures in neural experimental cell models[J]. Materials （Basel）， 2021， 14（22）： 6857.

[5]"" BRYJA A， POPIS M， BOROWIEC B， et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells[J]. J Biol Regul Homeost Agents， 2019， 33（2）： 397–401.

[6]"" ROMANO A， GUO S W， BROSENS J， et al. ENDOCELL- Seud： A Delphi protocol to harmonise methods in endometrial cell culturing[J]. Reprod Fertil， 2022， 3（3）： G1–G8.

[7]"" WANG Y， CHEN S， YAN Z， et al. A prospect of cell immortalization combined with matrix microenvironmental optimization strategy for tissue engineering and regen- eration[J]. Cell Biosci， 2019， 9： 7.

[8]"" 關(guān)永格， 李坤寅， 何昱雯， 等. 子宮腺肌病病灶細胞的培養(yǎng)與鑒定[J]. 中國婦幼健康研究， 2013， 24（6）： 827–829， 838.

[9]"" FANG Z， WANG J， LI T， et al. A method for isolating and culturing ectopic epithelial and stromal cells to study human adenomyosis[J]. Arch Gynecol Obstet， 2023， 309（2）： 551–563.

[10] WANG Y Y， DUAN H， WANG S， et al. Talin1 induces epithelial-mesenchymal transition to facilitate endometrial cell migration and invasion in adenomyosis under the regulation of microRNA-145-5p[J]. Reprod Sci， 2021， 28（5）： 1523–1539.

[11] 戚瑩瑩， 何月明， 明方華， 等. 基于JAK2/STAT3信號通路探討高強度聚焦超聲治療子宮腺肌病機制的實驗研究[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2023， 31（20）： 3722–3729.

[12] CHE X， WANG J， HE J， et al. A new trick for an old dog： The application of mifepristone in the treatment of adenomyosis[J]. J Cell Mol Med， 2020， 24（2）： 1724–1737.

[13] YOKOMIZO R， FUJIKI Y， KISHIGAMI H， et al. Endometrial regeneration with endometrial epithelium： Homologous orchestration with endometrial stroma as a feeder[J]. Stem Cell Res Ther， 2021， 12（1）： 130.

[14] GUO Y， WANG J， JIA C， et al. SKP2 regulates ZEB1 expression and stimulates eutopic endometrial stromal cell invasion and proliferation of adenomyosis[J]. Reprod Biol， 2022， 22（1）： 100578.

[15] WANG Z， CUI F， CHEN Y， et al. Establishment of an immortalized cell line derived from human adenomyosis ectopic lesions[J]. Tissue Cell， 2024， 86： 102284.

[16] HUANG J H， DUAN H， WANG S， et al. Estrogen 17β?estradiol accelerates the proliferation of uterine junctional zone smooth muscle cells via the let?7a/Lin28B axis in adenomyosis[J]. Mol Med Rep， 2021， 23（5）： 337.

[17] 姜心禪， 陳曉波， 郭宇丹. 加味芍藥甘草湯調(diào)控β-catenin/EGFR對子宮腺肌細胞凋亡的影響[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志， 2020， 26（12）： 1833–1836， 1842.

[18] 韓妍， 李莉， 王贊宏， 等. 子宮腺肌病異位內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)及鑒定[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2008， 39（5）： 474–476， 封3.

（收稿日期：2025–01–30）

（修回日期：2025–06–08）