基于NP基因的禽流感疫苗研究進(jìn)展

1禽流感概述

禽流感（Avianinfluenza），是由A型流感病毒引起禽類(lèi)的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病。禽流感病毒（AIV）的宿主較廣，只有少數(shù)血清型高致病力毒株才能引起禽類(lèi)發(fā)病，如H5、H7、H9等亞型，根據(jù)不同的病毒毒力和宿主情況，禽流感感染的表現(xiàn)形式包括急性敗血癥死亡、呼吸道病型或隱性感染性帶毒等，不同的H抗原和不同的N抗原之間很少發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，而不同的毒株在感染不同家禽時(shí)也表現(xiàn)出不同程度的毒力4。A型流感病毒基因組由分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成，其病毒粒子為球形，有時(shí)呈絲狀體等多形態(tài)，基因組由分子量大小不同的8個(gè)節(jié)段所構(gòu)成（如圖1所示），共編碼11種蛋白，其中8個(gè)是組成病毒顆粒的重要部分，如聚合酶蛋白（PolymeraseProtein）、血凝素（Hemagglutinin，HA）、核蛋白（Nucleoprotein，NP）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）等。

1878年，禽流感在意大利的雞群中被首次發(fā)現(xiàn)，緊接著從1955年一1996年，全球進(jìn)入了禽流感的時(shí)代。根據(jù)國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)記載，20世紀(jì)期間，北美、北非、中東及歐洲等多個(gè)地區(qū)都曾暴發(fā)過(guò)禽流感2。每一次禽流感的大規(guī)模暴發(fā)都會(huì)對(duì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生巨大影響。例如，在1983一1984年，美國(guó)暴發(fā)的禽流感造成了超6000萬(wàn)美元的損失。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2003—2023年，關(guān)于人感染H5N1型流感病毒的病例，全球有23個(gè)國(guó)家共報(bào)告882例，其中包括461例死亡案例，可見(jiàn)其給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了嚴(yán)重危害。

我國(guó)針對(duì)禽流感感染采取了綜合性的防控措施：將撲滅與免疫結(jié)合起來(lái)。實(shí)踐證明，在臨床上接種禽流感疫苗是預(yù)防該疾病最為科學(xué)和高效的手段。然而，在研究中，因禽流感具有較強(qiáng)的變異性，往往疫苗研制的速度趕不上毒株變異的速度，但近年來(lái)，隨著科技的發(fā)展，我國(guó)在禽流感疫苗研發(fā)領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，有效遏制了禽流感的傳播和感染[3。禽流感病毒是一個(gè)全球性挑戰(zhàn)，一旦疫情暴發(fā)，全球禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)會(huì)受到重創(chuàng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)威脅人類(lèi)的生命安全。因此對(duì)禽流感病毒進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)測(cè)和鑒定顯得尤為重要，而迅速診斷和及時(shí)監(jiān)控是控制禽流感的首要舉措。據(jù)資料顯示，疫苗免疫是預(yù)防禽流感最為有效的方法之一，而確保疫苗的安全性和有效性則是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。

2禽流感病毒NP基因

核蛋白（NP）是禽流感病毒的重要組成部分，不僅在病毒復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用，還在宿主免疫應(yīng)答中扮演重要角色。禽流感病毒NP基因是一種單體的磷酸化多肽，它的含量在病毒粒子中僅次于最高者，在流感病毒的各個(gè)基因中最為保守。它的開(kāi)放閱讀框架（ORF）長(zhǎng)度為1497個(gè)堿基對(duì)，編碼498個(gè)氨基酸，其編碼的核蛋白是病毒核糖核蛋白復(fù)合體的核心成分，參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程，其結(jié)構(gòu)主要包括N端和C端兩個(gè)功能區(qū)，其中N端通常承擔(dān)著與RNA分子的結(jié)合，而C端主要負(fù)責(zé)促進(jìn)NP蛋白的多聚化。

在宿主的免疫應(yīng)答機(jī)制中，NP蛋白具有顯著的免疫原性，能夠觸發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。據(jù)研究結(jié)果顯示，NP蛋白是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）攻擊的主要目標(biāo)之一，因此，NP基因在疫苗研發(fā)過(guò)程中常被視為一個(gè)至關(guān)重要的靶點(diǎn)。同時(shí)，禽流感病毒核蛋白NP是一個(gè)十分保守的蛋白質(zhì)，在不同亞型禽流感間的保守度超過(guò) 90% 。更重要的是，NP蛋白的單克隆抗體被廣泛應(yīng)用于禽流感血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)中，研究NP蛋白能夠?yàn)锳IV檢測(cè)治療提供參考。

3基于NP基因的禽流感疫苗類(lèi)型

3.1DNA疫苗

DNA疫苗，即“裸”DNA疫苗，也被稱(chēng)為基因疫苗、核酸疫苗或多核苷酸疫苗，在基因治療研究中，是一個(gè)衍生并發(fā)展起來(lái)的新的研究領(lǐng)域。這類(lèi)疫苗的原理是將編碼特定蛋白質(zhì)抗原的基因整合進(jìn)真核表達(dá)載體中，隨后通過(guò)直接或間接的方式注人動(dòng)物體內(nèi)，使該基因在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的抗原。這一過(guò)程能使機(jī)體產(chǎn)生特定的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而提供長(zhǎng)期的免疫力。值得注意的是，DNA疫苗無(wú)需增加劑量即可提升接種者的依從性。DNA疫苗作為第三代疫苗，該疫苗不僅具有減毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)，還具備成本低廉、易于操作和免疫時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)5，因此DNA疫苗被用于治療由許多病原體引起的疾病，也引起了眾多學(xué)者的關(guān)注，并對(duì)它展開(kāi)大量的研究，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與同一種疫苗免疫相比時(shí)，聯(lián)合免疫刺激機(jī)體能產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)和更高的抗體效價(jià)[。

因DNA分子較穩(wěn)定，DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全持久、制作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本較低、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，2020年馮亞亞等通過(guò)對(duì)BALB/c小鼠接種基于NP的疫苗，研究結(jié)果顯示，當(dāng)BALB/c小鼠接種NP疫苗后，與接種PB1和M1疫苗的小鼠相比，它們對(duì)PR8病毒展現(xiàn)出了更強(qiáng)的抵抗力。根據(jù)現(xiàn)有資料，如果將基質(zhì)蛋白、NP和PB1這三種質(zhì)粒組合起來(lái)用于免疫，通常能夠有效地保護(hù)小鼠、豬和弼猴免受異源病毒的挑戰(zhàn)。孫蘭以禽流感NP基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pET32a-rTX-NP。經(jīng)細(xì)胞融合后，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，又采取亞克隆的方法制得單克隆抗體，并對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，結(jié)果顯示，其廣譜性好、綜合性好，在禽流感流行病學(xué)中有一定的價(jià)值。

3.2基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗又被稱(chēng)為生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，其制備方法是將具有中和表位的抗原基因在原核或真核系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)，這一方法利用多種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)保護(hù)性抗原基因，并將所得表達(dá)產(chǎn)物與佐劑結(jié)合制成疫苗。

在生產(chǎn)過(guò)程中，基因工程亞單位疫苗可以將細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞等作為表達(dá)系統(tǒng)，這些系統(tǒng)在一定程度上能夠高效表達(dá)保護(hù)性抗原基因，進(jìn)而制備出大量純化的疫苗蛋白，因此該疫苗具備易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的特點(diǎn)，同時(shí)它的優(yōu)點(diǎn)也包括安全性高、免疫持久、純度高、穩(wěn)定性好，為此常被認(rèn)為是最安全的疫苗類(lèi)型之一。

鑒于基因工程亞單位疫苗具備出色的安全性和免疫原性，能夠有效激發(fā)機(jī)體生成針對(duì)NP蛋白的特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，目前已有多種針對(duì)禽流感病毒NP基因的基因工程亞單位疫苗被研發(fā)出來(lái)。2022年楊景等8把前期分離到的1株三源重組的Y280系H9N2亞型禽流感NP基因作為原材料，利用基因工程的手段，進(jìn)行原核表達(dá)，將禽流感NP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆鑒定（菌落PCR + 測(cè)序）等方法，先后連接克隆載體、原核表達(dá)載體，成功構(gòu)建了禽流感NP重組蛋白，進(jìn)一步從誘導(dǎo)劑濃度、時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了蛋白的表達(dá)量，并經(jīng)過(guò)鎳柱純化得到較純的NP重組蛋白，經(jīng)試驗(yàn)證明其免疫原性良好，特異性好。

此外，目前多個(gè)研究機(jī)構(gòu)和疫苗生產(chǎn)公司將提取的H5N1亞型禽流感病毒NP基因作為原料，利用基因工程技術(shù)使其在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，得到NP蛋白，對(duì)該蛋白進(jìn)行純化，將純化后的蛋白與佐劑結(jié)合，最終制成H5N1亞型的禽流感NP基因工程亞單位疫苗。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NP蛋白的特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)為接種者提供對(duì)H5N1亞型禽流感病毒的免疫保護(hù)。然而，需要注意的是，雖然禽流感NP基因相關(guān)的基因工程亞單位疫苗在研究中展現(xiàn)出良好的免疫效果和安全性，但目前這類(lèi)疫苗可能仍處于臨床試驗(yàn)或研發(fā)階段，尚未廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

3.3重組病毒載體疫苗

重組病毒載體疫苗采用基因工程技術(shù)，將編碼有效抗原的特定基因片段插入載體病毒基因組中并進(jìn)行表達(dá)，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過(guò)模擬自然感染過(guò)程，該疫苗可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)抗原的免疫反應(yīng)。由于病毒基因組具有較高的穩(wěn)定性，此類(lèi)疫苗無(wú)需添加佐劑就可產(chǎn)生高免疫原性和持久免疫應(yīng)答，此外，重組病毒載體疫苗安全性、高效性以及快速生產(chǎn)上還展現(xiàn)出良好的優(yōu)勢(shì)。

在禽流感疫苗研發(fā)中，重組病毒載體疫苗占據(jù)重要地位。此類(lèi)疫苗是將禽流感病毒的抗原基因整合到病毒載體中，常用的載體有火雞皰疹病毒（HerpesTurkeyvirus，HVT）、新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）和腺病毒（adenovirus，AdV）等[，當(dāng)這些疫苗進(jìn)人宿主細(xì)胞后，可以有效表達(dá)相應(yīng)抗原，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

3.4病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（VLPs）疫苗，一種由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝而成的空心微粒疫苗，其粒徑通常在 15～400nm ，這些顆粒在外形上與天然病毒一樣，但它們?nèi)狈α瞬《镜倪z傳信息，因此不具備感染性和復(fù)制功能。VLPs疫苗可以模擬病毒的天然構(gòu)造，并且還保留了病毒的自然結(jié)構(gòu)特征，這使VLPs疫苗可以有效地激活B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高濃度的中和抗體。更重要的是，VLPs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，為該疫苗長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸提供了有力保障。

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，VLPs疫苗的生產(chǎn)效率和純度不斷提高，其作為一種新型疫苗技術(shù)，在禽流感等傳染病中也發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報(bào)道，科研人員利用重組桿狀病毒表達(dá)了AIV（A型流感病毒）的結(jié)構(gòu)蛋白（包括NP），發(fā)現(xiàn)自動(dòng)組裝形成的VLPs免疫SPF雞，可以誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生高效價(jià)的抗禽流感的特異性抗體。在將NP蛋白應(yīng)用于VLPs疫苗的制備的過(guò)程中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將保守性NP蛋白整合到VLPs中能夠顯著增加疫苗的免疫原性。

結(jié)語(yǔ)

禽流感疫苗在不同動(dòng)物模型中的保護(hù)效果不同，拿小鼠做實(shí)驗(yàn)時(shí)，基于NP基因的禽流感疫苗展現(xiàn)出了理想的保護(hù)效果，然而當(dāng)家禽成為實(shí)驗(yàn)對(duì)象時(shí)，它的防護(hù)能力明顯減弱，難以達(dá)到理想狀態(tài)。由于禽流感的高變異性，不同地區(qū)的禽流感病毒已經(jīng)分化出不同的基因型，如H5N2亞型流感在亞洲、歐洲以及非洲的流行株存在明顯的差異，沒(méi)有針對(duì)性設(shè)計(jì)研發(fā)的禽流感疫苗在處理同種亞型的流行株時(shí)也可能出現(xiàn)免疫效果差、疫苗失活的情況。不僅如此，禽流感疫苗在激發(fā)細(xì)胞免疫時(shí)效果十分明顯，在體液免疫應(yīng)答中卻相對(duì)較弱。

目前國(guó)內(nèi)許多科研人員致力于探索多種新型疫苗技術(shù)，包括核酸疫苗、亞單位疫苗以及病毒樣顆粒（VLP）疫苗，為了增強(qiáng)疫苗的免疫效果，他們也將探索多種疫苗平臺(tái)的聯(lián)合使用，如DNA疫苗與重組病毒載體疫苗的結(jié)合、亞單位疫苗與VLP疫苗的結(jié)合。目前，疫苗研發(fā)技術(shù)在不斷進(jìn)步，科研人員對(duì)疫苗研究也在不斷深入，相信未來(lái)會(huì)有更多新型疫苗進(jìn)入市場(chǎng)。針對(duì)疫苗的價(jià)格，企業(yè)為搶占市場(chǎng)進(jìn)行降價(jià)銷(xiāo)售，但禽流感疫苗的接種率仍未明顯提高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2024年我國(guó)流感疫苗的報(bào)廢率高達(dá) 40% ，相關(guān)政策表明，為了提高疫苗可及性，政府大力推動(dòng)新型疫苗技術(shù)，降低成本。在技術(shù)、政策的支持下，相信未來(lái)禽流感防控工作也將邁向新的高度。

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作者簡(jiǎn)介：楊漫漫（2002—），女，漢族，本科。研究方

向：微生物學(xué)。*通訊作者：胡曉亮（1984—），男，漢族，博士，講師。

研究方向：野生動(dòng)物傳染病防控。