基于特征指紋圖譜的金線風生物堿提取物質量評價

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007－8517（2025）11-0055-05

DOI： 10.3969/j .issn.1007-8517.2025.11. zgmzmjyzz202511012

QualityEvaluationofAlkaloidExtracts ofCyclea Hypoglauca Basedon CharacteristicFingerprint

ZHANG Yunyun12YANG Haichuan1.2*ZHOU Qi³ LAI Bingxia3 1.Guangxi Institution of chinese Medicine Pharmaceutical Science，Nanning 53OO22，China; 2.Key Laboratory forResearchon Quality Standards of Traditional Chinese Medicinein Guangxi，Nanning 530022，China; 3.YoujiangMedicalUniversityForNationalities，Baise533OOO，China

Abstract：ObjectiveToestablishthecharacteristicfingerprintofalkaloidextractofCyclea hypoglauca，anddevelopHPLC method for determination of ⊥- curarine content. Method The chromatography was performed on Agilent ZORBAX XDB -C （4.6 ¹⁸ mm×75mm 3.5μm） column，Acetonitrile（A） -0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution containing 0.2% triethylamine （ pH=3 ）（B）waselutedbymobilephasegradient， λ=210 nmwasused toanalyzeand determine.ResultsHPLC fingerprint of alkaloidextractofCycleahypoglaucawasestablished，2Ocommonpeakswereidentified，and11batches werehighlysiilar.L curarine showed a good linear relationship in a certain concentration range，with R=0 .9998.The precision，repeatability，stability and RSD of sample addition recovery tests were all less than 3.0% ，and the average recovery rate of sample addition recovery was 98.11% .Conclusion Themethod hashigh precision，goodrepeatabilityand stability，and theresultsareacurateand reliable， which is suitable for the quality control and evaluation of alkaloid extract of Cyclea hypoglauca .

Key words： AlkaloidExtracts of Cyclea hypoglauca;Fingerprints；L -curarine；HPLC

金線風為防己科輪環(huán)藤屬（CycleaAm.exWight）植物粉葉輪環(huán)藤的Cycleahypoglauca（Schauer）Diels的干燥根。其壯藥名為勾機騰，瑤藥名為僅線崩，是廣西壯瑤特色民族藥材之一，具有清熱解毒、祛風止痛的功效。民間多用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、扁桃腺炎、風火牙痛、胃皖痛、腸炎等[1-3]。金線風藥材藥用歷史悠久，在廣西區(qū)內地域分布廣泛，化學成分豐富，研究者從中分離得到多種異喹啉類生物堿[4-6]，異喹啉生物堿是以異喹啉或四氫異喹啉為母體的最大生物堿類，對多種疾病顯示突出的藥理活性，如抗腫瘤、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、抗炎等[7-9]，具有極高的研究價值。金線風藥材中左旋箭毒堿為一種雙芐基異喹啉類生物堿，有研究[10-1]報道，其經(jīng)修飾成為二甲基左旋箭毒堿碘甲鹽，被應用于臨床實驗，具有明顯的肌肉松弛作用，且具有藥物安全性，同時左旋箭毒堿可不同程度地抑制LPS激活的RAW264.7細胞釋放NO、IL-1β、TNF- ∝ 和IL-6等炎癥因子，具有較好的抗炎活性。本實驗室前期實驗發(fā)現(xiàn)，金線風生物堿提取物有較突出的抗腫瘤及抗炎活性，本文以金線風生物堿提取物為研究對象，建立其高效液相色譜特征指紋圖譜及左旋箭毒堿的含量測定方法，為金線風生物堿提取物建立準確、有效的質量控制方法，為今后的深人研究與開發(fā)提供技術依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器 Agilent1260 Infinity II高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]、Milli-Q超純水儀、FA1004型電子天平（上海精科儀器有限公司）。1.2材料左旋箭毒堿對照品，實驗室自制（純度 98% ，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測，質量分數(shù)為 98.87% ）。乙腈、甲醇均為色譜純，其他化學試劑為分析純，水為超純水。11批金線風生物堿提取物由中藥化學實驗室提取，原藥材收集自廣西南寧、柳州、玉林等地，經(jīng)黃云峰研究員鑒定為防己科植物粉葉輪環(huán)藤［Cycleahypoglauca（Schauer）Diels］的根莖。

2方法與結果

2.1金線風生物堿提取物制備取金線風藥材50g，加氨水試液使充分潤濕，靜置過夜，加乙酸乙酯 150mL 回流提取2次，每次 30min ，濾過，合并濾液，濃縮并揮干溶劑，即得。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件色譜柱：AgilentZORBAXXDB-C₁₈ （ 4.6mm×75mm3.5μm） 。流動相：乙腈（A）-含 0.2% 三乙胺的 0.05mol/L 磷酸二氫鉀溶液（磷酸調 pH=3 ）（B）梯度洗脫；流速：0.8mL/min ；進樣量： 5μL ；柱溫： 25°C ；檢測波長（入） 210nm 。梯度洗脫程序： 0～25min ，A由

12% 升至 18% ； 25～35min ，A由 18% 升至20% ； 35～45min ，A由 20% 升至 25% ； 45～65 min ，A由 25% 升至 45% ； 65～66min ，A由 45% 跳轉至 12% ，保持 10min 。

2.2.2供試品溶液的制備稱取金線風生物堿提取物樣品 50mg ，精確稱量，置于 5mL 量瓶中，加入適量的甲醇以溶解樣品，并置于超聲裝置中處理 15min （設定功率為 1 0 0 W"，頻率為 40Hz ）。超聲處理完成后，使用甲醇定容至量瓶刻度線，充分搖勻使溶液均勻。最后，通過 0.45μm 微孔濾膜過濾該溶液，即得所需的金線風生物堿提取物溶液。

2.2.3對照品溶液的制備精密稱取左旋箭毒堿對照品 16.125mg ，置于 25mL 容量瓶中，加入甲醇使其完全溶解，并用甲醇定容至刻度，確保溶液體積準確。搖勻溶液，用 0.45μm 微孔濾膜進行濾過。這樣制得的左旋箭毒堿對照樣品溶液中，每 1mL 將含有 0.645mg 的左旋箭毒堿對照品。2.2.4測定方法分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各 10μL 注入液相色譜儀，在“2.2.1”色譜條件下，測定并記錄液相色譜圖，對照品及供試品色譜圖如圖1。

2.2.5方法學考察

2.2.5.1精密度試驗取同一批（S6）供試品溶液，按“2.2.2”項下的方法制備，“2.2.1”項色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，以9號峰為參照物峰，結果各共有峰相對峰面積的RSD為 1.26%～3.45% ，相對保留時間的RSD為0.09%～1.7% ，表明儀器精密度良好。2.2.5.2重復性試驗取同一批（S6）供試品溶液，按照“2.2.2”項下條件平行制備6份，“2.2.1”項色譜條件測定，檢測指紋圖譜，以9號峰為參照物峰，結果各共有峰相對峰面積的RSD為 2.32%～3.61% ，相對保留時間的RSD為0.11%～0.31% ，表明該方法重復性好。

2.2.5.3穩(wěn)定性試驗取同一批（S6）供試品溶液，按“2.2.2”項下的方法制備，分別于 0h 、 ^2h 、 ^5h 、^7h ！ ^12h 、 24h 按“2.2.1”項下條件測定，以9號峰為參照物峰，結果各共有峰相對峰面積的RSD為0.68%～3.3% ，相對保留時間的RSD為 0.06% ＼～0.26% ，表明供試品溶液在 24h 內穩(wěn)定。

2.2.6特征圖譜的建立在本研究中，針對11批次的金線風生物堿提取物，采用了“2.1.2”項下的方法來制備供試品溶液，并運用“2.2.1”項下的色譜條件進行分析測定。筆者記錄了每批次的色譜圖，并導入了國家藥典委員會發(fā)布的《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行全譜匹配。通過中位數(shù)法生成共有模式，共確定了20個共有色譜峰（如圖2和圖3所示）。為了進一步確認這些共有峰的組成成分，與對照品圖譜進行了對比，最終指認了9號峰為左旋箭毒堿（如圖4所示）。因其具有適中的保留時間和良好的分離度，故選擇9號峰為參照峰，通過計算，11批圖譜中各共有峰相對保留時間的RSD值均小于 1.24% ，結果表明各共有色譜峰保留時間穩(wěn)定。

2.2.7指紋圖譜相似度分析采用國家藥典委員會發(fā)布的《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），計算11批金線風生物堿提取物的相似度。以S1號色譜圖為參照圖譜，采用多點較正法進行色譜峰的精確匹配，并通過中位數(shù)法構建共有模式（R）。結果顯示，各批次提取物的相似度值在0.801～0.954 之間，這一范圍表明各批次提取物之間具有良好的一致性。因此，本研究構建的特征指紋圖譜可應用于金線風生物堿提取物的質量控制中。

綜上所述，通過對金線風生物堿提取物的色譜分析，不僅構建了特征指紋圖譜，還通過全譜匹配和中位數(shù)法確定了共有色譜峰的數(shù)量，以及通過與對照品圖譜的對比，指認了左旋箭毒堿的色譜峰。此外，各共有色譜峰的保留時間穩(wěn)定性也得到了驗證，這為后續(xù)的質量控制與評價提供了堅實的基礎。

2.3金線風生物堿提取物中左旋箭毒堿含量測定

2.3.1 方法學考察

2.3.1.1線性關系試驗分別精密吸取“2.2.3”項下左旋箭毒堿對照品溶液各 1μL ！ 3μL ！ 5_μL 、7μL 、 10μL 、 20μL 注入液相色譜儀，在“2.2.4”項下色譜條件下進行測定，記錄左旋箭毒堿色譜峰峰面積。以進樣量作為橫坐標 （X） ，峰面積作為縱坐標（Y）繪制標準曲線，建立回歸方程。結果表明左旋箭毒堿對照品在 0.645～12.900μg 進樣量范圍內有良好的線性關系，線性回歸方程為 Y= 10733X-2621 （ r=0.9998 ）。結果如圖5所示。

2.3.1.2 精密度試驗取“2.2.2”項下同一份供試品溶液（S6），在“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄左旋箭毒堿峰面積。結果左旋箭毒堿峰面積的RSD 為 1.97% ，表明儀器精密度良好。2.3.1. 3 重復性試驗精密稱取S6樣品6份，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下測定，計算樣品溶液中左旋箭毒堿含量。結果平均含量為 44.3027mg/g ，RSD為 1.76% 。表明該方法重復性良好，2.3.1.4穩(wěn)定性試驗取同一批（S6）供試品溶液，按“2.2.2”項下的方法制備，分別于 ^0h 、2h、 ^5h 1 ^7h 、 ^12h ！ 24h 測定，記錄左旋箭毒堿峰面積。結果顯示RSD為 1.61% ，表明供試品溶液在 24h 內基本穩(wěn)定。2.3.1.5加樣回收試驗精密稱取已知含量的S6樣品 25mg ，置 5mL 容量瓶中，精密加入左旋箭毒堿對照品溶液（ 0.645mg/mL ） 2mL ，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行6份，測定左旋箭毒堿含量。結果表明平均回收率為98.11% 。RSD為 2.39% 。測定結果見表1。

計算公式為：回收率 %= （測試量-已知量）÷ 加人量 ×100%

2.3.2樣品的含量測定分別稱取金線風生物堿提取物樣品（ [s1～s11 ）約 50mg ，至 5mL 容量瓶，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液測定，記錄左旋箭毒堿峰面積并計算含量。結果見表2。

3結論與討論

本研究成功構建了金線風生物堿提取物的特征指紋圖譜，確定了20個共有峰，反映了金線風生物堿提取物中各化學成分的獨特組合和分布，圖譜揭示了各批次提取物在化學組成上的細微差別，為我們提供了評估其質量一致性的量化指標。通過對照品和相關數(shù)據(jù)對比分析，確認9號峰為左旋箭毒堿，但圖譜中6號、10號、15號峰雖然相對峰面積較大，仍然尚未能確定其為何種化合物。同時，本研究還建立了金線風生物堿提取物中左旋箭毒堿的HPLC測定方法，通過這種方法，得以準確測定不同批次提取物中左旋箭毒堿的含量，并發(fā)現(xiàn)不同批次提取物中左旋箭毒堿的含量存在顯著差異，為金線風生物堿提取物的質量控制與科學評價奠定了堅實的數(shù)據(jù)基礎。

基于本研究，筆者將深入挖掘金線風生物堿提取物的成分，運用多樣化的現(xiàn)代色譜技術和光譜學方法，結合文獻調研與數(shù)據(jù)庫比對，以識別圖譜中未知峰所對應的天然產(chǎn)物或已知化合物，以期迅速鎖定目標結構，進行深入的結構鑒定。同時，考慮到生物堿的復雜性和多樣性，筆者將探索不同的提取條件對金線風生物堿提取物成分的影響，以期發(fā)現(xiàn)更多潛在的生物活性成分，并優(yōu)化提取工藝，以提高目標化合物的提取效率。最后，筆者將評估所鑒定出的化合物的生物活性，以期揭示金線風生物堿提取物在醫(yī)藥或保健品領域的潛在應用價值。通過這些綜合研究策略，筆者期望全面揭示金線風生物堿提取物的化學組成與生物活性，為其進一步的開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

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