黑米花青素對克氏原螯蝦生長、抗氧化能力、免疫酶活和腸道健康的影響

中圖分類號 S966.12 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2025）03-0128-08

克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）俗稱紅螯蝦或淡水小龍蝦[1]，是我國重要的淡水經濟物種?！?023年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數據顯示其年產量已達到316.1萬t[2]。但克氏原螯蝦飼養(yǎng)過程中受環(huán)境污染、低質量飼料等因素的影響，體內的自由基逐漸增加，引發(fā)各種疾病和健康問題[3]，加之我國全面禁止在飼料中添加抗生素引發(fā)了對于抗生素替代方案的迫切需求?；ㄇ嗨貫樘烊凰苄渣S酮類化合物（C6-C3-C6骨架），廣泛存在于紫甘薯、黑米等植物中[4]，具有抗氧化5、抗炎6及延長水產品保質期7等作用。黑米作為重要來源，其種皮富含以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為主的18種花青素[8]，兼具營養(yǎng)與功能特性，可顯著提升水生動物的生長性能、抗氧化和免疫相關基因的表達水平[9]，但不同的添加形式[10]和添加量[11]直接影響了花青素的生物利用度。

目前黑米花青素應用于克氏原螯蝦養(yǎng)殖的研究較少，基于其天然抗氧化、抗炎特性及原料的易得性，推測花青素可能會成為解決克氏原螯蝦養(yǎng)殖問題的重要添加劑。本研究通過評估飼料中添加黑米花青素對克氏原螯蝦生長性能、免疫性能和腸道健康的影響，探究黑米花青素的適宜添加形式和添加量，旨在為克氏原螯蝦飼料配方的優(yōu)化提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、菜籽粕、發(fā)酵豆粕、進口雞肉粉為蛋白源，豆油為脂肪源。在此基礎上分別添加不同劑量的黑米（華中農業(yè)大學華墨香黑米監(jiān)利生產基地生產；花青素含量為 968.79mg/kg? 或黑米花青素提取物（秦皇島必愛爾生物科技有限公司生產；純度25% ）。試驗配置5種不同飼料，分別為基礎飼料（對照，control group，CON）、基礎飼料中添加 200g/kg 黑米（blackrice 200g/kg ，BR200；花青素含量200mg/kg ）、基礎飼料中添加 400g/kg 黑來（BR400；花青素含量 400mg/kg ）、基礎飼料中添加 200mg/kg 黑米花青素提取物（blackriceanthocyaninextract200mg/kg ，AC200）和基礎飼料中添加 400mg/kg 黑米花青素提取物（AC400）。飼料配方及其營養(yǎng)成分詳見表1。飼料制備后，于 50^°C 恒溫烘箱中烘干至水分含量小于 10% ，隨后使用密封袋密封置于-20^°C 冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設計和飼養(yǎng)管理

試驗用克氏原螯蝦由華中農業(yè)大學雙水雙綠科研基地（湖北省監(jiān)利市）提供，養(yǎng)殖試驗于湖北省武漢市華中農業(yè)大學健康淡水養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心實施，試驗開始前，在實驗室養(yǎng)殖環(huán)境中暫養(yǎng)1周，期間投喂基礎飼料。暫養(yǎng)結束后，挑選體格健碩、附肢健全、規(guī)格均一的克氏原螯蝦450尾，隨機分成5組：CON、BR200、BR400、AC200、AC400，每組設3個重復。

克氏原螯蝦分組后轉移到裝有曝氣、碳過濾和脫氯自來水的玻璃水族箱（ 60cm×80cm×60cm， ，每個水族箱放入5根PVC管（ 25cm×7.5cm 為試驗蝦提供庇護。每天08：00和17：00投喂試驗飼料，初始投喂量為幼蝦總質量的 3% 。試驗蝦不再進食后將食物殘渣撈出，飼喂 2h 后，采用虹吸法將糞便吸出。食物殘渣置于烘箱烘干至恒質量，對試驗蝦的進食量進行統(tǒng)計，用于養(yǎng)殖試驗后期調整投喂量。試驗期間，持續(xù)觀察記錄試驗蝦的進食情況以及死亡情況，水溫控制在 （24±2）^°C ，每個試驗缸每2d更換1/5的水量以維持水質穩(wěn)定。養(yǎng)殖試驗為期8周。

1.3樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗結束后，試驗蝦禁食 24h ，采樣前擦干體表水分稱質量，冰水浴中麻醉 15min 使用 1mL 無菌注射器從蝦的頭胸甲后部刺入心臟，抽取 0.5mL 血淋巴，放入 1.5mL 裝有等量抗凝劑的離心管內，4^°C 靜置 ^4h 后 12000r/min 離心 20min ，取上清液用于部分生理生化指標測定。隨后解剖分離肝胰腺和腸道轉移至 2mL 離心管中在液氮中快速冷凍，保存于 -80^°C 用于酶活性的測定；一部分中腸置于裝有克氏原螯蝦組織固定液的 2mL 離心管中固定，用于制作組織切片。

1.4 指標測定與方法

稱測試驗蝦初始體質量（initialbodyweight，IBW）和終末體質量（finalbodyweight，FBW），用于計算增重率（weightgainrate，WGR）、飼料系數（feedconversionratio，FCR）和特定生長率（specificgrowthrate，SGR），增重率、飼料系數、特定生長率和存活率（survivalrate，SR）的計算公式參照文獻[12]。

分別對試驗蝦血淋巴、肝胰腺和腸道組織的超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、總抗氧化能力（totalantioxidantcapacity，T-AOC）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）和酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）的活性進行定量分析。試劑盒均采購自中國南京建成生物工程研究所，并嚴格按照對應的試劑盒說明書進行測定。

腸道組織樣本在通用組織固定液中固定 24h 后，依次通過乙醇溶液進行脫水處理和二甲苯透明化處理，用石蠟包埋，LeicaRM2235半自動切片機（Leica公司，德國）連續(xù)切片，厚度為 5μm ，樣品采用標準蘇木精-伊紅 （Hamp;.E） 染色法染色，NikonH600L顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數據用Excel2010軟件整理，采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據先經過One-wayANOVA程序進行單因素方差分析，影響顯著的數據再用Duncan's多重比較法進行差異統(tǒng)計學意義檢驗，結果以“平均值士標準差\"表示， Plt;0.05 表示有顯著差異。

2 結果與分析

2.1克氏原螯蝦的生長性能

飼料中黑米和黑米花青素不同添加水平下克氏原螯蝦的生長性能見表2。由表2可見，BR400組的WGR、SGR最高，與AC200和AC400組間沒有顯著差異 （Pgt;0.05 ）。BR200組的 FCR（0.91±0.02） 最低，其次是BR4OO和AC2O0組，均顯著低于對照組L （Plt;0.05 ）。BR400、AC200和AC400組的FBW、WGR、SGR和SR均顯著高于對照組 （Plt;0.05） ，BR400、AC200和AC400組間沒有顯著差異（ Pgt; 0.05）；BR400和AC400組的SR顯著高于對照組（Plt;0.05 ）。

2.2克氏原螯蝦的抗氧化性能

表3顯示飼料中黑米和黑來花青素不同添加水平下克氏原螯蝦血淋巴、肝胰腺和腸道的抗氧化酶活性。AC4O0組試驗蝦血淋巴的T-AOC水平最高，為 （4.48±0.8） 二 U/mL ，處理組試驗蝦血淋巴的T-AOC水平均顯著高于對照組 （Plt;0.05 ，但處理組之間T-AOC水平無顯著差異 （Pgt;0.05 ；AC400組試驗蝦血淋巴的SOD水平最高，為 （171.22±5.17 ）U/mL ，顯著高于其他各組（ （Plt;0.05） ），BR200、BR400、AC200組的SOD活性與對照組沒有顯著差異 Pgt;0.05 。

AC400組試驗蝦肝胰腺的T-AOC水平最高，顯著高于其他各組（ （Plt;0.05） ，而BR4OO組肝胰腺的T-AOC水平也顯著高于對照組 （Plt;0.05 。AC400組試驗蝦肝胰腺的SOD水平最高，BR4OO組次之，二者間無顯著差異 （-Pgt;0.05 ，但均顯著高于對照組（ Plt; 0.05）。BR200和AC200組試驗蝦肝胰腺的T-AOC和SOD活性均與對照組無顯著差異 （Pgt;0.05 。

BR200組試驗蝦腸道的 T -AOC水平最高，為（237.72±33.37 ） U/mL ，與BR400和AC200組無顯著差異 （Pgt;0.05） ，三者均顯著高于對照組 （Plt; 0.05）。BR200組試驗蝦腸道的SOD水平最高，與BR400和AC200無顯著差異 （Pgt;0.05） ，但均顯著高于AC400組和對照組（ ?Plt;0.05 ，AC400組試驗蝦腸道的SOD的活性也顯著高于對照組 （Plt;0.05） 。提示添加黑米和黑米花青素對克氏原螯蝦抗氧化性能的影響差異較大。

2.3克氏原螯蝦的免疫酶活性

飼料中黑米和黑米花青素不同添加水平下克氏原螯蝦的免疫酶活水平見表4。由表4可見，BR400組試驗蝦血淋巴的PPO、ACP和AKP活性最高，其中ACP活性顯著高于其他各組！ （Plt;0.05） 。飼料中添加黑米和黑米花青素對血淋巴的ACP和AKP活性有增強作用，處理組血淋巴的ACP和AKP活性均顯著高于對照組（ （Plt;0.05） 。

BR4OO組試驗蝦肝胰腺的PPO和AKP活性最高，均顯著高于對照組（ 1lt;0.05， ，但與其他處理組之間無顯著差異（ Pgt;0.05 ；AC400組試驗蝦肝胰腺的ACP活性最高為 （196.74±24.31 ） U/mg ，與BR400無顯著差異（ Pgt;0.05 ，顯著高于對照組（ Plt; 0.05）；處理組試驗蝦肝胰腺的ACP活性均顯著高于對照組 （Plt;0.05 ）。

BR4OO組試驗蝦腸道的PPO活性最高，且顯著高于AC200、AC400組和對照組 （Plt;0.05） ；試驗蝦腸道的ACP活性在各處理組間沒有顯著差異（ Pgt;

0.05），但均顯著高于對照組（ .Plt;0.05 ）;AC400組試驗蝦腸道的AKP活性最高，BR4OO組次之，二者均顯著高于BR200、AC200組和對照組（ （Plt;0.05） ，并且所有處理組均顯著高于對照組 （Plt;0.05） ）。

2.4克氏原螯蝦的腸道健康

1）克氏原螯蝦的腸道消化酶活性。飼料中黑米和黑米花青素不同添加水平下克氏原螯蝦的腸道消化酶活性見表5。由表5可知，AC400組試驗蝦腸道的淀粉酶活性最高，為 （12.00±0.32 ） U/mg ，與BR400和AC200組間無顯著差異 Pgt;0.05 ），但均顯著高于BR2O0組和對照組（ （Plt;0.05） ；BR200組試驗蝦腸道的脂肪酶活性最高，與其他處理組之間無顯著差異 （Pgt;0.05 ），處理組的脂肪酶活性均顯著高于對照組（ （Plt;0.05 ；AC200試驗蝦腸道的胰蛋白酶活性最高，與AC400組無顯著差異 （-Pgt;0.05 ，但顯著高于BR400、BR200和對照組 Plt;0.05 ）。

2）克氏原螯蝦的腸道形態(tài)。表6顯示飼料中黑米和黑米花青素不同添加水平下克氏原螯蝦的腸道

絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度比值。AC200組試驗蝦的腸道隱窩深度值最大，與其他處理組之間沒有顯著差異 （-Pgt;0.05 ，處理組均顯著高于對照組 （Plt;0.05 ）。各組之間絨毛高度沒有顯著差異 （-Pgt;0.05 ）；BR200、BR400和AC400組的絨毛高度/隱窩深度比值顯著大于對照組 （Plt;0.05 。

3討論

3.1花青素對克氏原螯蝦生長性能的影響

研究發(fā)現黑米花青素是一種有益的飼料添加劑，可以顯著提高水生動物生長性能[9]。本研究中以黑來及其提取物形式添加花青素且劑量為400mg/kg時，能顯著提高克氏原螯蝦的終末體質量、增重率、特定生長率和存活率。Hoseinifar等[13]在飼料中添加紅菜苔和甜菜根皮提取的花青素，觀察到橙劍尾魚（Xiphophorushelleri）的皮膚色澤顯著加深，同時其生長性能和飼料轉化率也有所提高，與本研究結果一致。有研究指出給大鼠灌喂 100mg/kg 的黑米花青素時，其進食量和體質量與對照組相比無顯著差異[14]，也與本研究結果一致，本研究中以黑米形式添加 200mg/kg 的花青素時，該組的增重率、特定生長率和存活率與對照組之間無顯著差異，說明黑米花青素對生長性能的影響可能與黑米花青素的添加劑量密切相關。

3.2花青素對克氏原螯蝦抗氧化酶活的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是機體中重要的抗氧化酶[15]，對于水生動物而言，總抗氧化能力（T-AOC）可以反映機體的抗氧化能力，并與健康狀況息息相關[16]。研究發(fā)現 0.03mg/mL 的紫薯花青素對斑馬魚（Daniorerio）體內羥基自由基清除率達到了99.55% ，并且SOD和CAT活性隨著紫薯花青素添加濃度升高而提高[17]，與本研究結果一致，本研究中隨著黑米花青素濃度的增加，試驗蝦肝胰腺的T-AOC和SOD活性顯著提升，并且添加 400g/kg 黑米的試驗組抗氧化能力更好，這表明飼料中添加黑米及黑米花青素提取物能增強克氏原螯蝦的抗氧化能力。但不同添加形式的黑米花青素對機體抗氧化性能的影響存在顯著差異，本研究中添加 200g/kg 黑米的試驗組克氏原螯蝦腸道的T-AOC和SOD活性顯著高于添加黑米花青素提取物 400mg/kg 處理組和對照組的酶活性，張麗麗等[18]通過對包括黑米在內的多種稻米進行主成分分析及綜合評價，發(fā)現黑來中除了花青素外還含有必需氨基酸、花色昔等營養(yǎng)物質，據此推測，黑米中的其他營養(yǎng)成分可能有助于提升克氏原螯蝦腸道的抗氧化性能。

3.3花青素對克氏原螯蝦免疫酶活的影響

多酚氧化酶（PPO）參與甲殼類動物多種生理功能如參與宿主防御反應、角質層的硬化作用[19]，并且PPO活性反映了甲殼動物的機體健康狀況[20]；蝦類自身的防御技能是通過血細胞的吞噬作用、SOD、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）等共同完成的[21]。在Linh等[9]的研究中， 4～8g/kg 的黑米花青素可以顯著提高尼羅羅非魚（OryzasatiuaL.）皮膚黏膜免疫酶活性，與本研究結果一致。本研究中，添加 400g/kg 黑米及 400mg/kg 黑米花青素提取物均可以顯著提升克氏原螯蝦肝胰腺和血淋巴的PPO活性、血淋巴和腸道的ACP和AKP活性，這說明黑米花青素可以增強克氏原螯蝦免疫功能，減少發(fā)病率，但黑米花青素提升克氏原螯蝦免疫機能的具體機制仍需要進一步探究。

3.4花青素對克氏原螯蝦腸道健康的影響

絨毛高度與隱窩深度比值與動物的消化和吸收能力呈正相關[22]，研究者發(fā)現在日糧中添加花青素可有效提高肉雞腸道的絨毛高度和隱窩深度比[23]，與本研究的結果相同， 400g/kg 的黑米或 400mg/kg 的黑米花青素提取物能顯著提高試驗蝦的絨毛高度和隱窩深度的比值，這表明飼料中添加黑米花青素可以提高克氏原螯蝦的消化功能。研究表明黑米花青素改善腸道的微生物環(huán)境并且能促進來源于隱窩基部的腸細胞不斷向絨毛尖端發(fā)生轉移和分化[14]，從而促進動物的消化和吸收?；ㄇ嗨嘏c蛋白質結合形成復合物，從而影響蛋白質的消化并且抑制腸道蛋白酶活性[24]，但本研究中添加 400g/kg 的黑米或400mg/kg 的黑米花青素提取物可以顯著提升腸道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性；此外，本研究中添加 200g/kg 黑米提取物能顯著提升腸道淀粉酶和胰蛋白酶活性，但添加 200mg/kg 黑米花青素提取物卻無顯著作用，這表明花青素對腸道健康的影響可能還受到花青素添加形式和劑量的影響。

綜上所述，建議克氏原螯蝦養(yǎng)殖中黑米花青素的添加量以 400mg/kg 最佳。

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ZHANG Qian1，HU Wendi1，MO Aijie2，YANG Huijun1，GU Zemao12，YUAN Yongchac ^1，2

1.College ofFisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan 43007O，China; 2.Shuangshui Shuanglii Research Institute，Huazhong Agricultural University/ Engineering Research Center ofMinistry of Education for Green Development of Aquatic Biological Industry in Yangtze River Economic Belt/Hubei Hongshan Laboratory， Wuhan 43Oo70，China

AbstractTo comprehensively evaluate the applicability of black rice and black rice anthocyanin extract in the feed of Procambarus clarkii，45O juvenile crayfish were randomly allocated into five groups. These groups were fed diets supplemented with O（control group，CON）， 200g/kg black rice（BR200）， 400g/kg black rice（BR400）， 200mg/kg anthocyanin extract （AC200），or 400mg/kg anthocyanin extract （AC4OO） for 8 weeks.The effcts of diferent forms and supplementation levels of black rice anthocyanins in feed on growth performance，antioxidant capacity，immune response，and intestinal health were nves tigated.The results revealed that ： （1） The BR4OO group achieved the highest weight gain rate（WGR） and specific growth rate （SGR），showing no significant difference from AC4OO，and both were significantly higher than those of the control group.（2） Antioxidant enzyme activities in the hemolymph，hepatopancreas，and intestine were elevated across al treatment groups.AC4OO exhibited the highest total antioxidant capacity（T-AOC） and superoxide dismutase（SOD）activity in both the hemolymph and hepatopancreas， with no significant difference observed compared to BR4OO.Notably，BR2OO displayed the highest intestinal T-AOC and SOD activity，significantly surpassing both AC4OO and CON groups.（3） Acid phosphatase （ACP）and alkaline phosphatase （AKP）activities in hepatopancreas and intestine were significantly elevated across alltreatment groups.BR4OO exhibited the highest levels of polyphenol oxidase（PPO），ACP，and AKP activities in the hemolymph.（4） AC4OO demonstrated the highest intestinal amylase activity，while AC2OO showed the highest trypsin activity.Additionally，crypt depth in all treatment groups was significantly greater than in CON.These findings indicate that dietary supplementation with either 400g/kg of black rice or 400mg/kg of black rice anthocyanin extract effectively enhances growth performance ，antioxidant capacity，immune function，and digestive efficiency in P .clarkii.Optimal supplementation levels are recommended at 400g/kg of black rice or 400mg/kg of black rice anthocyanin extract.

KeywordsProcambarus clarkii； growth performance; intestinal health;； black rice；anthocyanins

（責任編輯：邊書京）