光熱劑Cy7-TCF對人胰腺癌細胞氧化應激及凋亡的影響

[中圖分類號] R735.9;R454 [文獻標志碼] A

Effect of the photothermal agent Cy7-TCF on oxidative stress and apoptosis in human pancreatic cancer celsJIANG Wanyan， JING Xue， ZHOU Xianfeng，TIAN Zibin（Department of Gastroenterology，The Affiated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266oo3，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the efect ofthephotothermal agent Cy7-TCFonoxidative stressand apoptosis in human pancreaticcancercels.MethodsMiaPaCa-2cellswere divided intocontrol group，Cy7-TCF group（treated with Cy7- TCF alone），and Cy7-TCF + laser group （treated with Cy7-TCF followed by 808nm laser irradiation）. CCK-8 assay was used to measurecellviabilityunderdiferentconcentratiosofCy-TCFwithorwithoutlaseriradiation；fluorescecemicroscopywasused toobservetheuptakeofCy7-TCFbycels，andconfocal microscopycombined withalysosomalprobewas usedtoobserve thesubcelular localizationofCy7-TCF；the DCFH-DA fluorescent probewasused tomeasurethelevelof reactiveoxygenspecies（ROS） in cels；flowcytometrywasused tomeasurecellapoptosisrate.ResultsCCK-8assayshowedthatunderlaserirrdiatio，el viability significantly decreased with the increasing concentrationof Cy7-TCF in aconcentration-dependent manner（ Plt;0.05 ）. Fluorescence microscopyshowed that Cy7-TCF was efectivelytakenupby Mia PaCa-2cels，andconfocal microscopy showed that Cy7-TCF was mainly localized within lysosomes. DCFH-DA probe detection showed that under 808nm laser irradiation，Cy7-TCF significantly increased the level of ROS in Mia PaCa-2 cells ?q=19.07，16.84，Plt;0.05） . Flow cytometry showed that the Cy7- TCF+laser group had a significantly higher apoptosis rate than the control group and the Cy7-TCF group （ ?q=28.78，24.89，Plt; 0.05）. ConclusionCy7-TCF is effectivelytakenupbyMiaPaCa-2celsandislocalizedinlysosomes，andthrough itsphotothermal effect，itinduces the increase inthe levelof ROS incells，reduces cellviability，and promotes cellapoptosis.

[KEY WORDs]Pancreatic neoplasms； Photothermal therapy；Theranostic nanomedicine；Reactive oxygen species；Cel line，tumor；Nanoparticle drug delivery system

胰腺癌患者預后極差，5年生存率僅約 10%^[1] （2只有約 20% 的患者在確診時符合手術切除標準[2]，但術后復發(fā)率高達 80%^13] 。除了手術治療外，吉西他濱和白蛋白結合紫杉醇是胰腺癌化療的標準治療方案[4]。然而，胰腺癌腫瘤微環(huán)境的高度纖維化特征導致藥物在腫瘤組織中的蓄積不足，削弱了化療的效果[5-6]，同時腫瘤細胞的多藥耐藥性也是導致化療效果不佳的另外一個原因[]。

光熱療法是近幾年來新興的一種腫瘤治療方法，其原理是光熱劑被近紅外光照射后，能將光能轉化為熱能，使腫瘤組織局部溫度升至 42～50^°C ，通過高溫環(huán)境降解腫瘤細胞外基質，促進腫瘤細胞凋亡[8-12]。光熱療法具有治療位置精準、非侵人性和起效速度快的特點[13]。近年來，納米級光熱劑的研發(fā)成為研究熱點?；谀[瘤組織特有的增強通透性和滯留效應，粒徑范圍為 20～200nm 的納米顆?？蓛?yōu)先積聚于腫瘤組織內，而其在正常組織中的分布較少[11，14]

Cy7-TCF是本課題組前期開發(fā)出的一種新型光熱劑，屬于七甲川花菁衍生物，在水溶液中可自組裝形成直徑 40～70nm 的超分子納米顆粒[15]，在前期的乳腺癌細胞系（4T1細胞）和宮頸癌細胞系（HeLa細胞）的實驗中，Cy7-TCF顯示出高效的光熱轉換效率、良好的光熱穩(wěn)定性和優(yōu)異的生物相容性[15]，然而Cy7-TCF對胰腺癌細胞是否具有同樣的作用目前尚不明確。因此，本研究使用人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2細胞，探討Cy7-TCF對于MiaPaCa-2細胞氧化應激及凋亡的影響，旨在為Cy7-TCF臨床應用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，胰蛋白酶、細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、溶酶體綠色熒光探針以及AnnexinV-FITC/7-AAD試劑盒購自大連美侖生物科技有限公司，DCFH-DA熒光探針購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司， Cy7-TCF 由本課題組（青島科技大學材料科學與工程學院生物醫(yī)用材料智能材料實驗室）前期研發(fā)合成[15]

1.2 細胞培養(yǎng)

MiaPaCa-2細胞接種于含 2.5% 馬血清、 10% 胎牛血清和 1% 青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于含體積分數(shù) 0.05CO₂ 的 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8法檢測MiaPaCa-2細胞的存活率

取對數(shù)生長期的Mia PaCa^-2 細胞接種于96孔板中，每孔5000個細胞，培養(yǎng) 24h 。根據(jù)前期研究篩選的有效藥物濃度[15]，設置最高Cy7-TCF濃度為 25.00μmol/L ，按照此濃度的2/3倍依次遞減，最終確定的Cy7-TCF濃度梯度為0、2.19、3.29、4.94、7.41、11.11、16.67和 25.00μmol/L 。分別用含有上述濃度Cy7-TCF的培養(yǎng)基再繼續(xù)培養(yǎng)細胞 12h ，每個濃度設置10個復孔，其中每個濃度的5個復孔置于黑暗環(huán)境中培養(yǎng) 10min （黑暗組），另外5個復孔使用 808nm 激光 （2.8W/cm² 照射 10min? （激光組）。將原培養(yǎng)基更換為含有 10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng) 1.5h 后，使用酶標儀檢測各組細胞450nm 波長處吸光度值，計算細胞存活率。以黑暗組中Cy7-TCF濃度 0μmol/L 為對照組。細胞存活率 （實驗組吸光度均值一空白組吸光度均值）/（對照組吸光度均值一空白組吸光度均值） ×100% 。

1.4熒光顯微鏡觀察細胞對藥物的攝取情況

將處于對數(shù)生長期的Mia PaCa^-2 細胞，以每孔2×10⁵ 個的密度接種于12孔板中。培養(yǎng) 24h 后，移除原培養(yǎng)基，每孔里加入含有 11μmol/L 的 Cy7- TCF的完全培養(yǎng)基處理細胞。每組設置3個復孔，分別于黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 0，2，4，8h 以后，用預冷的PBS清洗細胞3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察Cy7-TCF的紅色熒光在細胞內的分布情況。

1.5 共聚焦顯微鏡觀察藥物的亞細胞定位

將處于對數(shù)生長期的Mia PaCa-2 細胞，以每皿1×10⁵ 個細胞的密度接種于直徑 29mm 的培養(yǎng)皿中，每組設置3個培養(yǎng)皿。培養(yǎng) 24h 以后，使用含11μmol/LCy7/CF 的新鮮培養(yǎng)基于黑暗環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng) ^12h 。移除原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，加入含有Lyso-Tracker的培養(yǎng)基孵育 30min .以標記溶酶體。再次用PBS清洗3次后，使用 4% 多聚甲醛固定 15min 。然后用預冷的PBS再次清洗，用DAPI染色 5min 以標記細胞核。最后，將細胞置于共聚焦顯微鏡下觀察Cy7-TCF的紅色熒光在細胞內的分布情況，以及其與溶酶體和細胞核的共定位情況。

1.6 DCFH-DA探針檢測細胞中ROS水平

將處于對數(shù)生長期的Mia PaCa-2 細胞以每孔1×10⁵ 個的密度接種于6孔板中培養(yǎng) 24h 后，分為A～C 組，每組設置3個復孔。A組細胞在原培養(yǎng)基于黑暗環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng) 12h+8min;E 組細胞用含有 11μmol/LCy7-TCF 的新鮮培養(yǎng)基于黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 12h+8min;C 組細胞用含有 11μmol/L Cy7-TCF的新鮮培養(yǎng)基先于黑暗環(huán)境下培養(yǎng) ^12h 以后，再以波長 808nm 的激光 （0.28W/cm² ）照射8min 。處理結束后，將各組細胞的原培養(yǎng)基均更換為含有 10μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，避光培養(yǎng) 30min 后，以無血清培養(yǎng)基清洗3次，置于熒光顯微鏡下檢測各組細胞中綠色熒光強度，以細胞中熒光強度反映細胞中ROS水平。

1.7AnnexinV-FITC/7-AAD染色試劑盒檢測細 胞凋亡情況

將處于對數(shù)生長期的MiaPaCa-2細胞，以每孔1×10⁵ 個細胞的密度接種于6孔板當中，培養(yǎng) 24h 后，分為 D～F 組。D組細胞在原培養(yǎng)基中于黑暗環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng) 12h+10min;E 組細胞用含有11μmol/L Cy7-TCF的新鮮培養(yǎng)基于黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 12h+10min;F 組細胞用含有 11μmol/L Cy7-TCF的新鮮培養(yǎng)基于黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 12h 后，再以波長 808nm 激光 （2.8W/cm² ）照射 10min 。處理結束后，移除各組細胞的原培養(yǎng)基，每孔中加入1mL 不含EDTA胰蛋白酶于 消化 3min ，以1000r/min 離心 5min 后收集細胞沉淀。按照AnnexinV-FITC/7-AAD試劑盒說明書進行操作，即用預冷的PBS洗滌細胞2次，重懸于 100μL 1× 結合緩沖液，依次加入 5μL Annexin V-FITC 以及5μL 7-AAD，避光孵育 15min 后補充 400μL 結合緩沖液。使用流式細胞儀檢測熒光信號，并計算各組細胞的凋亡率。細胞凋亡率 （早期凋亡細胞比例 + 晚期凋亡細胞比例） ×100% 。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS27和GraphPadPrism9軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以 表示。多組間比較采用單因素方差分析，進一步多重比較采用Tukey'sHSD檢驗；兩因素間的交互作用采用雙因素方差分析進行分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 Cy7-TCF對MiaPaCa-2細胞存活率的影響

雙因素方差分析結果顯示，Cy7-TCF濃度、有無激光照射和濃度與激光交互作用對MiaPaCa-2細胞的存活率均具有顯著性影響 F_???=2 415.52，F(xiàn)_???*??=334.38，Plt;0.05） 。單獨效應結果顯示，與對照組相比較，黑暗組細胞隨著Cy7-TCF濃度的升高，各濃度組的細胞存活率無顯著差異（ ΔPgt;0.05） ；與對照組相比，激光組細胞隨著Cy7-TCF濃度的升高，各濃度組的細胞存活率逐漸降低 （Plt;0.05） ；Cy7-TCF濃度從 3.29μmol/L 開始，隨著Cy7-TCF濃度的升高，與黑暗組相比較，激光組的細胞存活率均顯著降低（ ?Plt;0.05） 。其中，Cy7-TCF濃度為 11.11μmol/L 時，激光組的細胞存活率最接近 50% ；濃度為 25.00μmol/L 時，激光組的細胞存活率幾乎為0。見圖1。

2.2MiaPaCa-2細胞對Cy7-TCF的攝取及其亞細胞定位情況

Mia PaCa-2 細胞與Cy7-TCF在黑暗環(huán)境當中培養(yǎng)第0、2、4、8小時時，倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞中Cy7-TCF的紅色熒光逐漸增強。見圖2。

MiaPaCa-2細胞與Cy7-TCF在黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 12h 后，共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，Cy7-TCF主要定位于細胞的溶酶體當中。見圖3。圖中紅色熒光為Cy7-TCF，綠色熒光為染色的溶酶體，藍色熒光為染色的細胞核，合并圖中的紅色（Cy7-TCF）與綠色（溶酶體）熒光在細胞質中呈高度重疊（黃色區(qū)域）。

2.3 Cy7-TCF對MiaPaCa-2細胞中ROS的影響

DCFH-DA熒光探針檢測結果顯示， A～C 組細胞中ROS水平分別為 0.25±0.18，0.21±0.12 和2.03±0.26 ，三組間比較差異有顯著性 （F=113.33 ， ；其中，B組與A組比較，細胞中ROS水平差異無顯著性 （Pgt;0.05），C 組與A組、B組比較，細胞中ROS水平均顯著升高 Ω_{（q=19.07，16.84}^Ω Plt;0.05） 。見圖4。

2.4 Cy7-TCF 對 Mia PaCa^-2 細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示， D～F 組的細胞凋亡率分別為 （4.53±0.94）% 、 （14.14±1.47）% （75.62±7.20）% ，三組間比較差異有顯著性（ F= 243.79，Plt;0.05） ；其中，E組與D組比較，細胞凋亡率差異無顯著性 （Pgt;0.05） ；F組與D、E組比較，細胞凋亡率顯著升高 （q=28.78，24.89，Plt;0.05） 。

3討論

胰腺癌是全球人群當中腫瘤死亡的第七大原因[16]。由于早期臨床癥狀隱匿，約 50% 的胰腺癌患者在確診時已進展至晚期[17]。吉西他濱聯(lián)合白蛋白結合紫杉醇是目前臨床治療晚期胰腺癌的標準化療方案[4]，然而腫瘤微環(huán)境的高度纖維化特征導致藥物遞送效率低下，加之腫瘤細胞多藥耐藥機制的存在，嚴重限制了臨床療效[18-19]。近年來，光熱療法因其精準的局部熱效應和微創(chuàng)特性受到了廣泛關注。

光熱療法通常使用生物相容性良好的光熱劑，它們可以高效地吸收光能并將光能轉化為熱能，能夠選擇性誘導腫瘤組織消融[20-21]，但其在胰腺癌治療中的應用機制仍需深入研究。

本研究以人胰腺癌MiaPaCa-2細胞為模型，評估了七甲川花菁衍生物Cy7-TCF的體外光熱效應。CCK-8實驗結果顯示，在黑暗條件下，即使Cy7-TCF的濃度達到 25.00μmol/L ，細胞存活率仍然大于 90% ，證實其具有良好的生物相容性。在經(jīng)波長808nm 激光照射 10min 后，細胞存活率呈顯著濃度依賴性下降；當Cy7-TCF濃度為 25.00μmol/L 時，在激光照射 10min 時的細胞存活率幾乎為0，即顯示出顯著光熱殺傷效應。在Cy7-TCF濃度為11.11μmol/L 時，在激光照射 10min 時細胞存活率最接近 50% ，且處于劑量效應曲線的線性響應區(qū)，處于這種狀態(tài)的細胞，更便于觀察其細胞凋亡和其內ROS水平的變化情況，是研究光熱誘導的細胞凋亡機制的理想實驗條件。因此以 11μmol/L 作為后續(xù)實驗的Cy7-TCF濃度。

研究顯示，Cy7-TCF是基于七甲川花菁骨架設計的近紅外熒光衍生物，可在特定波長激發(fā)光的照射下發(fā)射近紅外熒光，無需外源染色劑輔助[15]。本研究通過熒光顯微鏡觀察顯示，隨著Cy7-TCF孵育細胞時間的延長，細胞中Cy7-TCF的紅色熒光逐漸增強，表明Cy7-TCF可被MiaPaCa-2細胞有效攝取，且攝取量呈時間依賴性。共聚焦顯微鏡觀察顯示，在Cy7-TCF（紅色）、溶酶體探針（綠色）、DAPI（藍色）三通道合并后的圖像中，Cy7-TCF的紅色熒光與溶酶體探針的綠色熒光重疊，在細胞中呈現(xiàn)為黃色，表明Cy7-TCF主要定位于MiaPaCa-2細胞的溶酶體當中。本課題組的前期研究也顯示，Cy7-TCF主要定位于乳腺癌4T1細胞的溶酶體中[15]。以上結果均提示，Cy7-TCF可能是通過損傷溶酶體發(fā)揮光熱治療作用。溶酶體作為細胞內重要的降解和信號調控中心，其功能障礙可觸發(fā)多種細胞死亡途徑[22-23]。Cy7-TCF在激光照射下引發(fā)的局部溫度升高可能導致溶酶體膜通透性增加[24]，致溶酶體內的蛋白酶釋放至細胞質中，激活caspase依賴性凋亡通路[25]。此外，溶酶體內容物的泄漏也打破了細胞內的pH穩(wěn)態(tài)，導致線粒體膜電位下降和ATP合成障礙[26]。綜合以上研究結果，推測溶酶體損傷可能是光熱治療誘導細胞凋亡的關鍵起始事件。

本研究通過倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示，相比對照組（A組）、Cy7-TCF組（B組）， Cy7-TCF+ 激光組（C組）細胞中綠色熒光（ROS）明顯增多，提示Cy7-TCF在激光照射時能誘導MiaPaCa-2細胞內的ROS水平升高。細胞內ROS水平升高可能有多種機制，比如光熱效應誘導線粒體電子傳遞鏈異常，導致超氧陰離子泄漏[27]；溶酶體損傷釋放游離鐵離子，通過Fenton反應催化過氧化氫轉化為高活性羥基自由基[28]；內質網(wǎng)應激激活NADPH氧化酶，進一步升高細胞中的ROS水平等[29]。ROS的過量積累可以引發(fā)DNA雙鏈斷裂、脂質過氧化及蛋白質變性，最終通過激活Bax/Bcl-2通路誘導細胞凋亡[30-31]。綜上推測，ROS 在Cy7-TCF 誘導細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，是導致細胞死亡的重要因素之一。

本研究中流式細胞術的檢測結果顯示，相比于對照組（D組）和Cy7-TCF組（E組），Cy7-TCF + 激光組（F組）的細胞凋亡率明顯增加，提示Cy7-TCF在激光照射下能有效誘導Mia PaCa^-2 細胞的凋亡。結合溶酶體共定位和ROS檢測結果，我們推測，Mia PaCa-2 細胞凋亡途徑可能為： ① ROS能夠激活JNK和p38MAPK通路; ② 溶酶體所釋放的組織蛋白酶，可以誘導線粒體細胞色素C釋放并進而激活caspase-9/3級聯(lián)反應。然而，本研究未明確凋亡的具體信號通路，后續(xù)需通過Westernblotting或抑制劑實驗進一步驗證。

綜上所述，Cy7-TCF可被人胰腺癌MiaPaCa-2細胞有效攝取并定位于細胞的溶酶體內；在波長808nm 激光照射下，Cy7-TCF能夠通過光熱效應提升細胞內的ROS水平，降低細胞存活率并促進細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Cy7-TCF的光熱殺傷效應呈現(xiàn)濃度依賴性，CCK-8的結果為后續(xù)治療劑量優(yōu)化提供了直接依據(jù)，并且ROS水平升高與胰腺癌細胞凋亡存在顯著關聯(lián)性，但需進一步研究揭示其下游分子通路。盡管本研究初步驗證了Cy7-TCF的體外治療效果，但臨床轉化仍需要系統(tǒng)評估Cy7-TCF在胰腺癌原位模型中的靶向效率、光熱療效及生物安全性?？紤]到胰腺癌的復雜性，未來研究應探索Cy7-TCF與化療藥物或者與免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合應用潛力，為胰腺癌的臨床治療提供新策略。

作者聲明：姜宛言、田字彬、荊雪、周現(xiàn)峰參與了研究設計；姜宛言、荊雪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）