一種人類巨細(xì)胞病毒間接ELISA檢測(cè)方法的建立

[中圖分類號(hào)] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

Establishment of an indirect ELISA method for detection of human cytomegalovirusLI Xu，WANG Shan，HUANG Huan，WANG Bin，QIAN Dongmeng （School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjetiveToestablish an indirect ELISA method forthe detection of human cytomegalovirus（HCMV） basedon HCMVIE1/pp65/ppl50recombinant protein.MethodsFrom Juneto December 2024，5 serum samples from HCMV IgG-positive patients，50 serumsamples from HCMV IgG-negative patients，as wellas8 serum samples each from the patients with positive herpessimplexvirus-1（HSV-1），herpessimplex virus-2（HSV-2），andEpstein-Barr virus（EBV），and349 serum samplesfromvoluntersundergoingphysical examinationwerecolectedfromQingdaoMunicipal Hospital.AnindirectELISA method for HCMVwas establishedbyoptimizingthedetectionconditionssuchasserumdilutionratioand thetypeofblocking solution，and the cut-off value of this method was determined;coefficient of variation （ CV_? ）wascalculated to verifythe repeatability of themethod;thesensitivityandspecficityof themethodwereassessdbydetectingtheserumsamplesfromthepatientswithpositive HCMV IgG，HSV-1，HSV-2，andEBVatvarious dilutionratios；theconsistencyrate between HCMVindirectELISA and cytomegalovirus IgGELISAkitwasassessedbyanalyzing theserumsamplesof349healthyvoluntersundergoing physicalexamination atthe outpatient service.ResultsThe optimal antigen-coating concentration of HCMV indirect ELISA assay was 3.0mg/ （204號(hào) L，with an optimal serum dilution ratio of 1：200 ，an optimal blocking solution of 5% bovine serum albumin，an optimal blocking time of 2h ，an optimal serum incubation time of 90min ，an optimal dilution ratio of the second antibody of 1：8 000 ，an optimal incubation time of the second antibody of 30min ，and an optimal color development time of 15min . The cut-off value of HCMV indirect ELISA assay was O.36O，with an intra- or inter-batch CV of 10% and a sensitivity of 1：3 200 ，and the absorbance values of serumsamplesfrom HSV-1，HSV-2，andEBV-positive patients wereallbelowthecut-off value.Theoverallconsistencyrate between HCMV indirect ELISA and cytomegalovirus IgG ELISA was 94.0% .ConclusionAn indirect ELISA method is successfull establishedfordetecting HCMVwithHCMVIE1-pp65-ppl50recombinant proteinasthecoatingantigen，andthis method has good repeatability，specificity，sensitivity，and consistency rate.

[KEY WORDs]Cytomegalovirus; Immediate-early proteins;Phosphoproteins; Recombinant proteins； Serologic tests;Enzyme-linked immunosorbent assay

人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）是一種線性雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒的 β 亞家族，在人群當(dāng)中流行廣泛，對(duì)于宿主物種具有嚴(yán)格的趨向性[1-3]。

HCMV的原發(fā)性感染和再激活可能會(huì)導(dǎo)致免疫功能低下的患者出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡。因此，選擇具有較高診斷效能的抗原標(biāo)志物對(duì)于實(shí)現(xiàn)HCMV感染的早期精準(zhǔn)鑒別至關(guān)重要。HCMV即刻早期蛋白1（IE1）是調(diào)控病毒早期及晚期基因時(shí)序性表達(dá)的分子開關(guān)，其功能缺失將導(dǎo)致病毒基因組沉默及感染進(jìn)程中斷[4]；磷蛋白 65（pp65） 在不同HCMV株間高度保守，在病毒顆粒的組裝和釋放過(guò)程中起重要作用[5]；pp150是病毒衣殼蛋白，幾乎100% 與HCMV血清陽(yáng)性個(gè)體的 IgG 抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他皰疹病毒蛋白質(zhì)沒(méi)有同源性。本研究基于HCMV IE1/pp65/pp150 重組蛋白，旨在建立一種檢測(cè)人類血清中HCMVIgG抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

2024年6一12月于青島市市立醫(yī)院收集HC-MVIgG陽(yáng)性患者血清樣本5份和HCMVIgG陰性患者血清樣本50份（經(jīng)巨細(xì)胞病毒核酸檢測(cè)和巨細(xì)胞病毒IgGELISA試劑盒檢測(cè)驗(yàn)證），單純皰疹病毒（HSV）-1型、HSV-2型、人類皰疹病毒4型（EBV陽(yáng)性患者血清樣本各8份，門診健康體檢志愿者血清樣本349份。

1.2 主要試劑和耗材

96孔聚乙烯微量反應(yīng)板購(gòu)買于美國(guó)Costar公司，HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體（二抗）購(gòu)買于武漢愛博泰克生物科技有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)買于德國(guó)BMGLABTECH公司，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液購(gòu)買于浙江彼安德生物科技有限公司，巨細(xì)胞病毒 IgG ELISA試劑盒購(gòu)買于珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司。 HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白，濃度為 0.5g/L ，為本實(shí)驗(yàn)室保存，其具體蛋白序列如下：SPMTTTSTSQKPVLGKRVATPHASAR-AQTVTSTPVQGRLEKGGSGGGSGSSMLSSASP-SPAKSAPPSPVKGRGSRVGVPSLKGGSGGGSG-SSRAASTTPTYPAVTTVYPPSSTAKSSVSNAPP-VASPSILKPGGGSGGGSGSGSAGMGGAKTPSD-AVQNILQKIEKGGSGGGSGSEPMSIYVYALPL-KMLNIPSINVHHYGGSGGGSGSISHIMLDVAF-TSHEHGGSGGGSGSYQEFFWDANDIYRIFGGS-GGGSGSQIKVRVDMVRHRIKEHMLKKGGSG-GGSGSMLAKRPLITKPEVISVMKRRIEEICMK-VFAQY.

1.3 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法優(yōu)化

1.3.1HCMV間接ELISA 檢測(cè)方法初始步驟將HCMV IE1/pp65/pp150 重組蛋白用 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 （pH9.6） 稀釋為濃度 3.0mg/L 的工作液，以 100μL/ 孔包被于96孔聚乙烯微量反應(yīng)板中， 4^°C 孵育過(guò)夜。而后每孔加入 200μL5% 牛血清白蛋白（BSA），于 下封閉 ²h ;待測(cè)血清用5% BSA按 1：200 比例稀釋，每孔加入 100μL ，于 下孵育 ¹h ；二抗用PBST按 1：8 000 比例稀釋，每孔加入 100μL ，于 下孵育 ¹h 。而后每孔加入 100μL TMB顯色液，于 下避光反應(yīng)15min 后，每孔加入 100μL1mol/L 磷酸溶液終止顯色。使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 450nm 下檢測(cè)每孔的吸光度值 （A₄₅₀） 。

1.3.2 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的確定采用棋盤滴定法篩選最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)。將 HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白用 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 （pH9.6） 稀釋為濃度 0.5，1.0，3.0，5.0，7.0mg/L 的工作液，縱向包被于96孔聚乙烯微量反應(yīng)板中，每孔 100μL 4^°C 孵育過(guò)夜；將 HCMVIgG 陽(yáng)性和陰性患者血清樣本用 5% BSA按照 1：200.1：400.1：800.1 ：1600 比例稀釋，橫向加入封閉后的96孔聚乙烯微量反應(yīng)板中，每孔 100μL，37^°C 孵育 ;其余步驟同1.3.1。陽(yáng)性血清吸光度值與陰性血清吸光度值的比值（ ΔP/N 值） 陽(yáng)性血清 A₄₅₀ /陰性血清 A₄₅₀ 。以 P/N 值大于2.1且為最大值時(shí)所用的抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)。

1.3.3最佳封閉液和最佳封閉時(shí)間的確定將HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以 100μL/ 孔包被于96孔聚乙烯微量反應(yīng)板中， 4^°C 孵育過(guò)夜，分別用 5% 脫脂奶粉、 5% BSA、酪蛋白封閉液、 5% 雞卵白蛋白（OVA）和無(wú)蛋白快速封閉液作為封閉液，每孔 200μL，37^°C 分別孵育 1.2.3.4h ，將待測(cè)血清以最佳血清稀釋倍數(shù)稀釋，每孔加入 100μL，37^°C 孵育 ，其他步驟同1.3.1。每個(gè)條件均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，結(jié)果取均值，用于計(jì)算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時(shí)所用的封閉液和封閉時(shí)間為最佳封閉液和最佳封閉時(shí)間。

1.3.4最佳血清孵育時(shí)間的確定將 HCMVIE1/pp65/pp150重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以最佳封閉液按照最佳封閉時(shí)間進(jìn)行封閉。將待測(cè)血清以最佳血清稀釋倍數(shù)稀釋，每孔中加入 100μL 下分別孵育 10，20，30，60，90，120min ，其余步驟同1.3.1。每個(gè)條件均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，結(jié)果取均值，用于計(jì)算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時(shí)所用的血清孵育時(shí)間為最佳血清孵育時(shí)間。

1.3.5 最佳二抗稀釋倍數(shù)和最佳二抗孵育時(shí)間的確定 將 HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以最佳封閉液按照最佳封閉時(shí)間進(jìn)行封閉，將待測(cè)血清以最佳血清稀釋倍數(shù)稀釋，按照血清最佳孵育時(shí)間進(jìn)行孵育。將二抗用PBST按 1：2000，1：4 000，1：6 000，1：8 000. 1：10 000 比例稀釋，每孔加入 100μL，37^°C 下分別孵育 10，20，30，60，90，120min ，其余步驟同1.3.1。每個(gè)條件均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，結(jié)果取均值，用于計(jì)算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時(shí)的二抗稀釋倍數(shù)和孵育時(shí)間為最佳二抗稀釋倍數(shù)和最佳二抗孵育時(shí)間。

1.3.6最佳顯色時(shí)間的確定將HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以最佳封閉液按照最佳封閉時(shí)間進(jìn)行封閉，將待測(cè)血清以最佳血清稀釋倍數(shù)稀釋，按照血清最佳孵育時(shí)間進(jìn)行孵育，以最佳稀釋倍數(shù)稀釋二抗，按照二抗最佳孵育時(shí)間進(jìn)行孵育。各孔加入 100μL TMB顯色液于 下避光顯色1、5、10、15和 20min ，其余步驟同1.3.1。每個(gè)條件均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，結(jié)果取均值，用于計(jì)算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時(shí)的顯色時(shí)間作為最佳顯色時(shí)間。

1.4HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的臨界值確定

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)5O份HCMVIgG陰性患者血清樣本吸光度值，每份血清樣本重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值 和標(biāo)準(zhǔn)差（s），臨界值 。若待測(cè)樣本吸光度值高于臨界值則判定為HCMV感染陽(yáng)性，反之則為HCMV感染陰性。

1.5 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的重復(fù)性分析

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法，采用5份HCMVIgG陽(yáng)性患者血清樣本測(cè)定批內(nèi)和批間變異系數(shù) （CV） 。使用同一批次的HC-MVIE1/pp65/pp150 重組蛋白檢測(cè)血清樣本吸光度值，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算批內(nèi) CV 。使用3個(gè)不同批次的HCMVIE1/pp65/ppl50重組蛋白檢測(cè)血清樣本吸光度值，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算批間 CV 。 CV=s/π×100% 。

1.6 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的靈敏度和特異度檢測(cè)

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法，將HCMVIgG陽(yáng)性患者血清樣本從 1：200 倍比稀釋至 1：12 800 ，檢測(cè)吸光度值時(shí)，每個(gè)稀釋度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值，將吸光度值大于臨界值的最高稀釋度視為HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的靈敏度。

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)HSV-1型、HSV-2型和EBV 陽(yáng)性血清吸光度值，每個(gè)血清樣本重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。將HCMVIgG陽(yáng)性患者和陰性患者血清分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。通過(guò)比較HSV-1型、HSV-2型和EBV陽(yáng)性血清吸光度值與臨界值的大小來(lái)考察HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的特異度。

1.7 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法符合率檢測(cè)

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法和巨細(xì)胞病毒IgGELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)349份門診健康體檢志愿者血清樣本，最終根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算兩種方法的陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總體符合率。陽(yáng)性符合率 真陽(yáng)性樣本數(shù)/（真陽(yáng)性樣本數(shù) + 假陰性樣本數(shù)） ×100% ；陰性符合率 真陰性樣本數(shù)/（真陰性樣本數(shù) + 假陽(yáng)性樣本數(shù)） x 100% ；總體符合率 （真陽(yáng)性樣本數(shù) + 真陰性樣本數(shù)）/總樣本數(shù) ×100% 。上述計(jì)算公式中，真陽(yáng)性樣本為兩種方法檢測(cè)結(jié)果均呈現(xiàn)陽(yáng)性的血清樣本，真陰性樣本為兩種方法檢測(cè)結(jié)果均呈現(xiàn)陰性的血清樣本，假陰性樣本為HCMV間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性而巨細(xì)胞病毒 IgG ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性的血清樣本，假陽(yáng)性樣本為HC-MV間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性而巨細(xì)胞病毒IgGELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性的血清樣本。

2結(jié)果

2.1最佳抗原包被濃度以及最佳血清稀釋倍數(shù)的確定

HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白的包被濃度 為 0.5mg/L ，血清的稀釋倍數(shù)為 1：200.1：400 、 1：800.1：1 600 時(shí)， P/N 值分別為9.470、8.400、 5.400.4.250 ；包被濃度為 1.0mg/L ，上述各稀釋倍 數(shù)對(duì)應(yīng)的 P/N 值分別為 9.740，7.380，6.020，4.540 包被濃度為 3.0mg/L ，上述各稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的 P/N 值分別為11.170、10.180、7.770、4.380；包被濃 度為 5.0mg/L ，上述各稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的 P/N 值 分別為 10.960，9.160，6.880，4.500 ；包被濃度為 7.0mg/L ，上述各稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的 P/N 值分別為 10.740、9.580、7.770、4.690。

2.2最佳封閉液和最佳封閉時(shí)間的確定

使用 5% 脫脂奶粉、 5% BSA、酪蛋白封閉液、5% OVA、無(wú)蛋白快速封閉液作為封閉液時(shí)，各封閉液所對(duì)應(yīng)的 P/N 值分別為6.801、8.895、4.778、7.640、6.322。使用 5% BSA封閉 1，2，3，4h 后，計(jì)算的 P/N 分別為 8.096，9.004，7.821，7.858，

2.3最佳血清孵育時(shí)間的確定

血清孵育時(shí)間為 10，20，30，60，90，120min 時(shí)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的 P/N 值分別為4.700、7.078、8.490、8.215、8.648、7.930。

2.4最佳二抗稀釋倍數(shù)以及最佳二抗孵育時(shí)間的確定

二抗采用 1：2000，1：4000，1：6000，1： 8000及 1：10 000 比例稀釋時(shí)，各稀釋比所對(duì)應(yīng)的P/N 值分別為8.312、8.424、8.951、9.290、7.888；二抗孵育時(shí)間為 10，20，30，60，90，120min 時(shí)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的 P/N 值分別為5.864、8.041、8.394、7.675、7.574、7.576。

2.5 最佳顯色時(shí)間的確定

在顯色1、5、10、15和 20min 時(shí)，各個(gè)顯色時(shí)間所對(duì)應(yīng)的P/N值分別為5.557、6.324、8.599、9.843、9.477。

2.6 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的臨界值確定

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)50份HCMV IgG 陰性患者血清樣本，檢測(cè)結(jié)果顯示吸光度值 為 0.269，s 為0.030，臨界值為0.360。

2.7 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法重復(fù)性分析

以本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)5份 HCMVIgG 陽(yáng)性患者血清樣本，檢測(cè)結(jié)果顯示該方法的批內(nèi) CV 分別為 4.138%.4.115% 2.825%.3.879%.8.401% ，該方法的批間 CV 分別為 4.363%.7.270%.5.227%.7.167%.9.115% 。

2.8 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的靈敏度和特異度分析

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法， HCMVIgG 陽(yáng)性患者血清樣本采用 1：200 、1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1： （204號(hào)12800比例稀釋時(shí)，吸光度值分別為2.399、1.671、1.319、0.892、0.591、0.313、0.242。

使用本研究所建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)HCMVIgG陽(yáng)性患者血清樣本的吸光度值為1.337，HCMVIgG陰性患者血清樣本的吸光度值為0.234，HSV-1型、HSV-2型及EBV陽(yáng)性血清樣本吸光度值分別為0.226、0.220、0.193。

2.9 HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的符合率檢測(cè)

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法和巨細(xì)胞病毒 IgG ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)349份門診健康體檢志愿者血清樣本。其中，真陽(yáng)性樣本276份，真陰性樣本52份，假陽(yáng)性樣本13份，假陰性樣本8份。經(jīng)計(jì)算，上述兩種方法的陽(yáng)性符合率為 97.2% ，陰性符合率為 80.0% ，總體符合率為 94.0% 。

3討論

HCMV是一種感染率極高的皰疹病毒，其血清陽(yáng)性率因不同國(guó)家的社會(huì)經(jīng)濟(jì)背景而異，其中發(fā)達(dá)國(guó)家人群的HCMV血清陽(yáng)性率為 45%～85% ，而發(fā)展中國(guó)家人群的HCMV血清陽(yáng)性率則幾乎可達(dá)100%^[6-8] 。與其他皰疹病毒相比，HCMV可以感染大多數(shù)類型細(xì)胞或器官，并具有較高的發(fā)病率和病死率[9]。HCMV感染可分為原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染兩種臨床類型，其中繼發(fā)性感染又包括再激活感染和再感染[10-12]。免疫功能正常人群感染 HC-MV后不會(huì)表現(xiàn)出明顯病癥[13-14]，但免疫功能不全人群（如艾滋病患者和實(shí)體器官/骨髓移植受者）體內(nèi)病毒處于再激活階段時(shí)容易發(fā)生肝炎、結(jié)腸炎、食管炎等疾病甚至導(dǎo)致死亡[15]

病毒分離培養(yǎng)法是HCMV感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[16]，但該方法靈敏度低、陽(yáng)性率低、操作復(fù)雜，不利于早期快速診斷。許多新型HCMV檢測(cè)方法（HCMV抗原血癥測(cè)定[4]、定量聚合酶鏈反應(yīng)[17-18]]ELISA[19-20]、靶向質(zhì)譜[21-23]等）被陸續(xù)開發(fā)出來(lái)，應(yīng)用于HCMV感染的早期診斷。在上述各種方法中，ELISA是應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足大批量樣品檢測(cè)的需求[24]

HCMV在宿主細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)呈現(xiàn)一定時(shí)序性，可分為3個(gè)階段：即刻早期、早期和晚期[7]。其中，病毒IE1 基因產(chǎn)物的表達(dá)對(duì)于病毒基因表達(dá)的時(shí)間級(jí)聯(lián)至關(guān)重要， IEI 基因表達(dá)后，病毒早期基因和晚期基因才開始轉(zhuǎn)錄。已有研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染單核/巨噬細(xì)胞 4～5 d后產(chǎn)生可達(dá)到檢測(cè)水平的IE1蛋白，而病毒晚期蛋白在7d左右才開始積累[25]。因此，在晚期蛋白 pp65 和 pp150的基礎(chǔ)上添加IE1蛋白作為包被抗原，可能有助于縮短HCMV感染檢測(cè)的空窗期。

本研究基于HCMV IE1/pp65/pp150 重組蛋白，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種檢測(cè)人類血清當(dāng)中HCMVIgG抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件：最佳抗原包被濃度為 3.0mg/L ，最佳血清稀釋倍數(shù)為 1：200 ，最佳封閉液 5% 為BSA，最佳封閉時(shí)間為 ，最佳血清孵育時(shí)間為 90min ，最佳二抗稀釋倍數(shù)為 1：8 000 ，最佳二抗孵育時(shí)間為 30min 最佳顯色時(shí)間為 15min 。

對(duì)本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行性能驗(yàn)證，結(jié)果顯示，批內(nèi)、批間CV均小于10% ，表明該方法具有良好的重復(fù)性；陽(yáng)性患者血清樣本稀釋度為 1：3 200 時(shí)的吸光度值為0.591，仍高于臨界值0.360，表明該方法具有良好的靈敏度；檢測(cè)HSV-1型、HSV-2型及EBV 陽(yáng)性患者血清樣本的吸光度值均小于臨界值，表明該方法不會(huì)與其他皰疹病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，有良好的特異度。

本研究建立的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法與臨床上廣泛使用的巨細(xì)胞病毒IgGELISA試劑盒的總體符合率為 94.0% ，此結(jié)果表明兩種方法具有較高的符合率。兩種方法在檢測(cè)患者HCMV感染情況過(guò)程中存在部分檢測(cè)結(jié)果不一致，其可能原因如下： ① 患者正處于HCMV早期感染，還未產(chǎn)生與巨細(xì)胞病毒 IgG ELISA試劑盒包被的晚期蛋白特異性結(jié)合的HCMV抗體，從而造成假陰性； ② 巨細(xì)胞病毒 IgG ELISA試劑盒包被蛋白與血清中的抗體發(fā)生了非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性； ③ 患者免疫應(yīng)答較弱，產(chǎn)生的抗體未達(dá)到最低檢測(cè)限從而導(dǎo)致假陰性。還有其他的因素會(huì)影響HCMV間接ELISA檢測(cè)方法的結(jié)果，如檢測(cè)樣本是否溶血、人工洗板時(shí)是否造成各孔間污染、酶標(biāo)板使用前是否進(jìn)行校準(zhǔn)等。

綜上所述，本研究成功建立了一種以HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白為包被抗原的HCMV間接ELISA檢測(cè)方法，該方法具有良好的重復(fù)性、靈敏度、特異度和符合率，有望應(yīng)用于大規(guī)模人群HCMV感染的檢測(cè)中，以提高HCMV感染的檢出效率。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)科學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QDU-HEC-2024442）。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：李旭、王珊、黃歡參與了研究設(shè)計(jì)；李旭、錢冬萌、王斌參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 李京蔓 厲建強(qiáng)）