丁酸鈉對EB病毒陽性胃癌細(xì)胞EB病毒活化的影響及其機(jī)制

[中圖分類號] R394；R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

Effect and mechanism sodium butyrate on the activation Epstein-Barr virus in Epstein-Barr virus-positive gastric cancer cellsTIAN ， CHEN ，LIU （ ， ， ， ，）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate theeffectand mechanism sodium butyrate（NaB）ontheactivation EpsteinBarr virus（EBV）inEBV-positivegastriccancercells.MethodsEBV-positivegastriccancercells（AGS-EBVcells）weredivided nto groups A，B，andC，and thecels in groupA were culturedroutinelyfor12 hours，while those in groups Band C were treated withNaBfor12and 24hoursrespectively.Transcriptomesequencingwas performedforthe genes AGS-EBVcelsand theEBV genes，and groups A，B，andCwerecomparedinterms therelative expressionlevelskeylatent genes and keylytic genes EBVincels.Dierentiallyexpressed genes（DEGs）were identifiedbetweengroupsA，B，andC，andthe top5upregulated DEGs and the top 5 downregulated DEGs with smaller P values were considered significant DEGs，while RT-qPCR was used to measuretherelativeexpresionlevels significantDEGs.TheGOfunctionalenrichmentanalysisandthe KEGG pathwayenrichmentanalysis were performed forallDEGs identified，andthe proteins enriched in significant pathways（the pathways with Plt;0.05 in the KEGG pathway enrichment analysis）were considered key pathway proteins，while Western blotting was used to mea-sure therelative expression levels key pathway proteinsin groups A， B，and C.TheDEGs in groupsA，B，andCwere comparedwith the transcription factors in the AnimalTFDB/PlantTFDB database，and the top5 transcription factors with smaler P values were se lectedascoretranscriptionfactors，whileRT-qPCR wasused tomeasuretherelativeexpresionlevelscoretranscriptionfactors in groups A，B，andC.ResultsCompared with group A，groups Band Chad significantincreases in therelative expresionlevels key latent genes（EBNA-1，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA- 3C ，EBNA .LP LMP-I ，LMP-2A，LMP-2B and RPMS1） and lytic period genes（BZLF1，BRLF1 and BHLF1）（ ：t=2.67-14.36，Plt;0.05） ，and group C had significantly higher expression levels these genes than group B （t=2.21-6.97，Plt;0.05） .Compared with group A，groupB had significant increases in the relative expression levels SCN1A，RFPL4AL1， RORB ，and CACNG7 in cells （t=2.81-13.93，Plt;0.05） and significant reductions in the relative expression levels MIR205HG ， PLAAT4 ， and OAS2 （t=4.47-623.30，Plt;0.05） ; compared with group A，group C had significant increases in the relative expression levels NLRP5 ，SCN1A，RFPL4AL1，RORB，CACNG7，and PLA2G2E Ω_t=4.32-7.43 Plt;0.05 ）and significant reductions in the relative expresson levels RS17P11，MIR205HG， PLAAT4 ，and OAS2 .Compared with group A in terms the core transcription factors，groups B and C had significant increases in the relative mRNA expression levels EGR1， PGR ，and SOX2 （ t=3.22-16.60，Plt;0.05） and significant reductions in the relative mRNA expression levels CEBPD andE2F3（ t=4.18-28.59，Plt;0.05） .Compared with group A，group B had significant reductions in the relative expression levels p65，p-p65，AKT，and p-AKT 0.05），and compared withgroupA，groupChadsignificantreductions intherelativeexpresionlevels p65，p-p65，AK，and p-AKT and a significant increase in the expression level p -ERK ?t=5.72-8.92，Plt;0.05） .ConclusionNaB promotes the activation EBV inEBV-positive gastric cancercels byactivating the MAPK signaling pathwayand inhibiting the NF- κB pathway， andthecoretranscriptionfactorEGRlpromotestheactivationthevirusbyfacliatingthetranscriptiontheEBVlyticgenes BZLF1 and BRLF1.

[KEY WORDs]Herpesvirus 4，human; Butyric acid; Virus activation;Gene expression regulation; Stomach neoplasms； In vitro techniques

EB病毒相關(guān)胃癌（Epstein-Barr virus-associa-tedgastriccancer，EBVaGC）是胃癌的一種獨(dú)特的分子亞型[1-2]。EB 病毒（EBV）主要感染口咽部上皮細(xì)胞和B細(xì)胞，并在外周血記憶B細(xì)胞中建立長期潛伏感染狀態(tài)[3]。EBV處于潛伏感染狀態(tài)時(shí)復(fù)制被抑制，僅有少數(shù)潛伏期基因表達(dá)，以維持其潛伏狀態(tài)[4-5]。在某些特定條件下，如機(jī)體免疫功能減弱或受到某些物理化學(xué)因素刺激后，病毒基因的啟動(dòng)子可能會被重新活化，啟動(dòng)病毒進(jìn)人裂解期，并表達(dá)大量的裂解期基因[]。丁酸鈉（NaB）是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，屬非細(xì)胞毒類抗癌化合物，可影響細(xì)胞內(nèi)多種表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，包括組蛋白的超乙酰化、DNA的甲基化及非組蛋白的修飾等過程]有研究顯示，NaB能夠誘導(dǎo)EBV從潛伏期進(jìn)入裂解期[8-10]。但目前關(guān)于NaB誘導(dǎo)EBV活化的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過對NaB處理不同時(shí)間點(diǎn)的EBV陽性胃癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出差異表達(dá)基因（DEGs）并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)對分析的結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證，以全面了解NaB誘導(dǎo)EBV裂解復(fù)制的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞的分組和處理

將EBV陽性胃癌AGS-EBV細(xì)胞（中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院贈(zèng)予）置于含有 10% 胎牛血清、青霉素（0.1U/L） 和鏈霉素 （100mg/L） 的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度約達(dá) 70% 時(shí)分為 A～ C組，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。A組細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng) 12h ；分別于B組和C組的完全培養(yǎng)基中加入 3mmol/L 的NaB后，B組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12h，C 組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24h 。

1.2 A～C 組細(xì)胞中EBV基因的檢測、轉(zhuǎn)錄組測序 和DEGs的富集分析

各組細(xì)胞處理結(jié)束后，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心后收集至凍存管中。委托北京和元生物技術(shù)有限公司對AGS-EBV細(xì)胞基因以及EBV基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)。測定 A～C 組細(xì)胞中的EBV關(guān)鍵潛伏期基因（EBNA-1、EBNA-3A，EBNA-3B+EBNA-3C，EBNA-LP，RPMSl， LMP-2A、LMP-2B和LMP-1）以及關(guān)鍵裂解期基因 （BZLF1+BRLF1 和BHLF1）的相對表達(dá)量，對A組與B組、A組與C組、B組與C組間病毒基因的相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中EBNA-3B與 EBNA–3C，BZLFI 與BRLF1有部分重疊序列，因此檢測的是它們合并后基因的相對表達(dá)量，分別用 EBNA-3B+EBNA-3C 和 BZLF1+BRLF1 表示。收集 A～C 組AGS-EBV細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，并篩選出A組與B組、A組與C組細(xì)胞間的DEGs，按照 P 值從小到大排序，分別選取表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的前5個(gè)DEGs為顯著DEGs，作為后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測的目標(biāo)基因。對于上述篩選出的所有DEGs進(jìn)行GO功能分析、KEGG通路分析，將富集于顯著通路（KEGG通路分析中 Plt;0.05 的通路）中的蛋白（關(guān)鍵通路蛋白）作為后續(xù)Westernblotting檢測目標(biāo)蛋白。將 A～ C組細(xì)胞中所有的DEGs與AnimalTFDB/Plant-TFDB數(shù)據(jù)庫中收錄的轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行比對，分析獲得DEGs涉及的所有轉(zhuǎn)錄因子基因及轉(zhuǎn)錄因子家族，將轉(zhuǎn)錄因子基因按照 P 值從小到大排序，選取前5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)楹诵霓D(zhuǎn)錄因子基因，作為后續(xù)RT-qPCR檢測的目標(biāo)基因。

1.3RT-qPCR檢測 A～C 組細(xì)胞中顯著DEGs和核心轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)

將處理結(jié)束后的 A～C 組細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化并離心后，使用TRIzol法從各組細(xì)胞當(dāng)中提取總RNA。測定RNA濃度及純度后，使用湖南艾科瑞生物有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過LightCycler96序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為： 95°C 預(yù)變性 10min ；然后 95°C 變性 10s，60^°C 退火 10s，72^°C 延伸 15s ，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)試劑盒說明書上的要求配制反應(yīng)體系，以 β actin作為內(nèi)參，使用 2^-ΔΔCT 公式計(jì)算各樣本中目標(biāo)基因相對表達(dá)量。引物名稱及其序列見表1。

1.4Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中關(guān)鍵通路蛋白的表達(dá)

將處理結(jié)束后的 A～C 組細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化離心。用含有 1%PMSF 和 1% 磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液充分裂解細(xì)胞后，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；使用SDS-PAGE法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜；將膜以 5% 脫脂牛奶室溫封閉 ^2h ，加入目的蛋白一抗后4°C 孵育過夜；第2天加入二抗室溫孵育 后，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色液，置于蛋白曝光儀中顯示蛋白條帶。以 β? -actin為內(nèi)參，使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)量資料以 x±s 表示，兩組間比較采用Student Ψ_t 檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1AGS-EBV細(xì)胞中EBV關(guān)鍵潛伏期基因和關(guān) 鍵裂解期基因的表達(dá)情況

B組與A組、C組與A組比較，細(xì)胞中EBV關(guān)鍵潛伏期基因（EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B+EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B和 RPMSl ）以及關(guān)鍵裂解期基因 （BZLF1+ BRLF1和BHLF1）的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)（ ?_t= 2.67～14.36，Plt;0.05），C 組上述基因相對表達(dá)量顯著高于B組 （t=2.21～6.97，Plt;0.05） 。見表2。

2.2各組間DEGs的GO功能分析、KEGG通路分析和轉(zhuǎn)錄因子基因分析

轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果顯示，A、B組細(xì)胞間的DEGs共4843個(gè)，其中上調(diào)基因3001個(gè)，下調(diào)基因1842個(gè)；GO功能分析顯示，這些DEGs主要富集于多細(xì)胞生物體過程、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號等過程；KEGG通路分析顯示，這些DEGs主要參與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、 NF-κB 通路、MAPK通路和PI3K-AKT通路。A、C組細(xì)胞之間的DEGs共6577個(gè)，其中4761個(gè)上調(diào)，1816個(gè)下調(diào)；GO功能分析顯示，這些DEGs主要富集于多細(xì)胞生物體過程、細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育過程等；KEGG通路分析顯示，這些DEGs主要參與蛋白質(zhì)消化與吸收、胰島素分泌、MAPK通路和PI3K-AKT通路。按照 P 值從小到大排序后， A～C 組細(xì)胞中上調(diào)的前5個(gè)顯著DEGs為NLRP5、SCN1A、RF-PL4AL1、RORB和CACNG7；下調(diào)的前5個(gè)顯著DEGs分別為RS17P11、PLA2GRE、MIR205HG、PLAAT4和OAS2。

轉(zhuǎn)錄因子基因分析結(jié)果顯示，A、B組細(xì)胞之間DEGs所涉及的轉(zhuǎn)錄因子基因共358個(gè)，其中178個(gè)上調(diào)，180個(gè)下調(diào)；A、C組細(xì)胞之間DEGs所涉及的轉(zhuǎn)錄因子基因共414個(gè)，其中273個(gè)上調(diào)，141個(gè)下調(diào)。上述所有轉(zhuǎn)錄因子基因主要屬于zf-C2H2、Homeobox和bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族。 P 值最小的前5個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)镃EBPD、EGR、E2F3、PGR和 SOX2。

2.3 A～C 組細(xì)胞中顯著DEGs以及核心轉(zhuǎn)錄因子 基因表達(dá)量比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，B組與A組比較，細(xì)胞中SCN1A、RFPL4AL1、RORB以及CACNG7的相對表達(dá)量均顯著上調(diào) （t=2.81～13.93，Plt; 0.05），MIR205HG、PLAAT4以及 OAS2 的相對表達(dá)量顯著下調(diào) （t=4.47～623.30，Plt;0.05），NL^- 建RP5、PLA2GRE以及 RSl7PlI 無顯著差異（ Pgt; 0.05）;C組與A組相比較，NLRP5、SCN1A、RF-PL4AL1、RORB、CACNG7以及PLA2GRE的相對表達(dá)水平顯著上調(diào) Ω：t=4.32～7.43，Plt;0.05） RS17P11、MIR205HG、PLAAT4和OAS2相對表達(dá)量下調(diào)（ 。見表3。

與A組相比較，B組、C組中核心轉(zhuǎn)錄因子基因EGR1、PGR和 的相對表達(dá)量顯著上調(diào) （t=3.22～16.60，Plt;0.05），CEBPD 和 E2F3 mRNA的相對表達(dá)量則顯著下調(diào)（ t=4.18～28.59 .Plt;0.05） 。見表4。

2.4 A～C 組細(xì)胞中關(guān)鍵通路蛋白相對表達(dá)量比較

Westernblotting檢測結(jié)果顯示，與A組相比，B組中 p65，p-p65 、AKT和p-AKT的相對表達(dá)量顯著下調(diào) Ω^′t=2.87～5.93 ， Plt;0.05 ），ERK 和pERK的表達(dá)無顯著差異 （Pgt;0.05） ;C組與A組比較，p65、p-p65、AKT、p-AKT相對表達(dá)量顯著下調(diào)，p-ERK相對表達(dá)量顯著上調(diào) （t=5.72～8.92，Plt; 0.05），ERK相對表達(dá)量差異無顯著性 （Pgt;0.05） 。見圖1和表5。

3討論

本研究在NaB處理AGS-EBV細(xì)胞 12，24h 時(shí)，對AGS-EBV細(xì)胞內(nèi)的EBV基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。研究結(jié)果顯示，隨著NaB處理時(shí)間的延長，細(xì)胞中EBV關(guān)鍵潛伏期基因（EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B和RPMS1）以及關(guān)鍵裂解期基因（BZLF1、BRLF1和BHLF1）表達(dá)量均顯著上調(diào)。EBV重新活化時(shí)BZLF1和BRLF1編碼的即早蛋白Zta和Rta發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。研究表明，這兩種病毒轉(zhuǎn)錄因子通過啟動(dòng)下游病毒基因的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn) EBV 從潛伏期進(jìn)入裂解性復(fù)制周期[14]。EBV活化期間，BHLF1基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，成為病毒基因組中表達(dá)最為豐富的基因之一。因此，目前BHLF1表達(dá)水平已被用作臨床上診斷EBV 是否處于活化狀態(tài)的指標(biāo)[15]。本研究同時(shí)對NaB處理 ^12，24h 的AGS-EBV細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出A、B組和A、C組細(xì)胞之間所有DEGs，并進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析，并對A、B組和A、C組間細(xì)胞的顯著DEGs進(jìn)行RT-qPCR檢測。結(jié)果顯示，B組與A組比較，細(xì)胞中SCN1A等基因表達(dá)顯著上調(diào)， MIR205HG 等基因表達(dá)水平顯著下調(diào);C組與A組相比較，NLRP5等基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，RS17P11等基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。GO功能分析結(jié)果顯示，這些顯著DEGs主要富集于多細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育過程等，提示NaB可以顯著影響參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與DNA復(fù)制的 DEGs表達(dá)水平。

KEGG通路分析顯示，A、B組和A、C組細(xì)胞之間所有DEGs主要參與了 NF?RB 通路、MAPK通路和PI3K-AKT通路等。通過Westernblotting實(shí)驗(yàn)對關(guān)鍵通路蛋白的檢測結(jié)果顯示，與A組相比，B組中 NF-κB 通路的效應(yīng)蛋白 p65.p-p65 以及PI3K-AKT通路的效應(yīng)蛋白AKT和p-AKT的相對表達(dá)量顯著下調(diào)，MAPK通路相關(guān)蛋白ERK以及p-ERK的表達(dá)無顯著性差異;C組與A組比較，（20號 p65.p7p65 、AKT和 -AKT相對表達(dá)量顯著下調(diào)，p-ERK的表達(dá)量顯著上調(diào)，ERK的表達(dá)無顯著差異。上述結(jié)果提示NaB激活了MAPK通路，并抑制 NF-κB 通路和PI3K-AKT通路。目前，研究報(bào)道MAPK通路的激活能夠促進(jìn)EBV的活化。LI等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在AGS-EBV 細(xì)胞中EBV所編碼的潛伏期蛋白LMP1通過上調(diào) p -ERK等MAPK通路效應(yīng)蛋白，誘導(dǎo)p53磷酸化并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而促進(jìn)EBV進(jìn)入裂解期；在EBV陽性的淋巴瘤細(xì)胞系中EBV編碼蛋白BGLF2可以誘導(dǎo)MAPK通路的激活，增強(qiáng)EBV裂解復(fù)制[17」。 NF-κB 通路的抑制也被證實(shí)與EBV的復(fù)制密切相關(guān)。研究報(bào)道，NF-κB 通路抑制劑BAY11-7082和Z-LLF-CHO以劑量依賴性的方式激活EBV的復(fù)制[18-19]。MORI等[20]研究表明在EBV陽性的伯基特淋巴瘤細(xì)胞系中，PI3K-AKT通路抑制劑可以降低EBV衣殼抗原表達(dá)，并且抑制EBV裂解基因BRLF1的表達(dá)，提示PI3K-AKT通路可能促進(jìn)了EBV的活化。然而NaB活化EBV的同時(shí)又抑制了PI3K-AKT通路，表明NaB介導(dǎo)的EBV激活可能與PI3K-AKT通路并無顯著關(guān)系。綜上，EBV的活化可能受到MAPK通路激活以及 NF-κB 通路抑制的協(xié)同調(diào)控，而關(guān)于PI3K-AKT通路在EBV復(fù)制過程中的作用目前研究較少，本研究結(jié)果為后續(xù)研究提示了新的研究方向。

本研究結(jié)果顯示，與A組相比，B、C組中核心轉(zhuǎn)錄因子基因EGR1、PGR和SOX2的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，CEBPD和E2F3的相對表達(dá)量顯著下調(diào)。其中，EGR1以及PGR編碼的蛋白均是屬于bHLH家族，SOX2編碼的蛋白屬于HMG家族，CEBPD以及E2F3編碼的蛋白屬于zf-C2H2家族。目前，關(guān)于zf-C2H2家族在人類中的研究報(bào)道較少。有研究通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在人類卵巢癌樣本中鑒定出了該家族相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；同時(shí)有研究結(jié)果表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員在鼻咽上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平與EBV編碼的蛋白LMP1存在顯著相關(guān)性[21-23]。然而，還尚未見 zf-C2H2 和bHLH這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族與EBV活化過程之間潛在關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道。既往研究表明HMG家族成員HMGB1能夠增強(qiáng)EBV即早蛋白Rta介導(dǎo)的BHLF1轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與EBV的活化過程[24]。在上述5個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子基因中，EGR1和SOX2已被證實(shí)與EBV的活化相關(guān)。EGR1是EBV陽性B細(xì)胞中EBV活化所需的轉(zhuǎn)錄因子之一，EGR1與B細(xì)胞表面受體結(jié)合以后，在MAPK通路的誘導(dǎo)下，可以通過上調(diào)EBV裂解基因BZLF1以及BRLF1的表達(dá)，從而激活EBV的復(fù)制[25-27]。除此之外，WANG等[28]通過對EBV活化的鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中SOX2的表達(dá)水平相較未活化的鼻咽癌細(xì)胞顯著上調(diào)，但SOX2在EBV活化中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，NaB通過復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，激活EBV由潛伏期進(jìn)入裂解期，其可能通過抑制NF-κB 通路并激活MAPK-ERK通路來實(shí)現(xiàn)的；同時(shí)，核心轉(zhuǎn)錄因子基因EGR1通過上調(diào)EBV裂解基因BZLF1和BRLF1的表達(dá)進(jìn)一步活化EBV，而SOX2可能與EBV的活化存在關(guān)聯(lián)，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

作者聲明：田昭鑫、陳鈺英參與了研究設(shè)計(jì)；田昭鑫、劉雯參與了論文的寫作與修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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