EB病毒調(diào)控SARM1表達對胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

[中圖分類號] R735.2 [文獻標(biāo)志碼] A

Effects of Epstein-Barr virus regulating SARM1 expression on the proliferation and migration of gastric cancer cellsZHAO Zhen， ZHANG Yan（Department of Pathogenic Biology，School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071，China）

[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigate theregulatory efectof Epstein-Barr virus （EBV）onthe expresionof sterilealpha andTollinterleukinreceptormotif-containingprotein1（SARM）anditsefectsontheproliferationandmigrationofgastriccan cercells.MethodsFromtheGSE51575datasetoftheGeneExpresionOmnibus，weobtainedtherelative mRNAexpression levelsof theSARM1geneof12casesofEBV-negativegastriccancerand12casesofEBV-positive gastriccancer.Theexpresion data of the SARM1 gene were analyzed using the online GEO2R tool. AGS cels were divided into AGS group and AGS +12 -O-tetradecanoylphorbol-13-acetate（TPA） group，and AGS-EBV cels were divided into AGS-EBV group and AGS-EBV + TPA group. The AGS + TPA group and AGS-EBV + TPA group were treated with TPA at 20μg/L for 24h ，while the AGS group and AGSEBV group were treated with the same volume of dimethyl sulfoxide for 24h ，The culture medium supernatant of the AGS + TPA group and AGS-EBV+TPA group was colected;and AGScells were divided into AGS supernatant groupand AGS-EBV supernatant group to be cultured with the AGS + TPA cell culture medium supernatant and the AGS-EBV + TPA cell culture medium supernatantfor5d，respectively. Si-NC group，si-SARM1-1 group，andsi-SARM1-2 group were set with AGS cels;AGS-EBV-NC group and AGS-EBV-SARM1 group were set with AGS-EBV cells; and YCCEL1-NC group and YCCEL1-SARMl group were set with YCCEL1 cells. The si-NC group， si-SARM1-1 group，and siSARM1-2 group were transfected with si-NC，si-SARM1-1，and si SARM1-2，respectively;the AGS-EBV-NC groupand YCCEL1-NC group were transfected with control plasmids；and the AGS EBV-SARM1 group andYCCEL1-SARM1 group were transfected with the SARM1recombinant expresson plasmid.The expression of SARM1 was measured by proteomic sequencing and Western blot.Cellabsorbance was measuredby using CellCounting Kit-8.Therelativecellmigrationrate wasdeterminedbyTranswellmigrationassay.ResultsComparedwiththoseinEBV-negativegastriccancertissuesandEBV-negativegastriccancercellines（HGC27，MGC803，ndAGS），therelativeexpresiole vels of SARMl mRNAand proteinin EBV-positive gastriccancer tissuesand EBV-positive gastriccancer cellines（YCCEL1， GT38，GT39，SNU719，and AGS-EBV） were significantly lower （ F=101.70，t=2.77-69.28，Plt;0.05） . Compared with the AGS-EBV group and AGS supernatant group，the AGS-EBV+TPA groupand AGS-EBV supernatant group showed significantly lower relative expression levels of SARMl protein （t=6.99，93.13，Plt;0.05） .There were significant differences in the absorbance value，re-lative cell migration，and the relative expression levels of SARM1， ZEBl，and β^- catenin between the si-NC group and the si-SARM1-1 groupandsi-SARM1-2 group，betwen the AGS-EBV-NC group and the AGS-EBV-SARM1 group，and between the YCCEL1-NC group and the YCCEL1-SARM1 group （F=22.70-2 191.00，q=3.85-22.39，t=5.34-26.49，Plt;0.05） .ConclusionTheexpressionofSARM1issignificantlydecreasedinEBV-positivegastriccancercells.EBVmayinhibittheproliferation and migration of gastric cancer cells by lowering the expression of SARM1.

[KEY WORDs]Herpesvirus 4，human；Stomach neoplasms；Sterile alpha and tollinterleukinreceptor motif-con-taining protein 1；Cell proliferation；Cell movement；Sequence analysis，protein；In vitro techniques

EB病毒（EBV）作為第一個被發(fā)現(xiàn)的人類皰疹病毒，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。EBV 陽性胃癌是一種特殊的胃癌亞型，約占所有胃癌病例的 10%^[2] 。研究表明，EBV感染在胃癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。EBV編碼的miR-BART6-5p能夠調(diào)節(jié)TGF- ?{β} /SMAD4信號通路，從而促進胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。除此之外，EBV陽性胃癌患者相較于EBV陰性患者，生存率較高且預(yù)后較好［5-6]無菌 α 和Toll白介素受體基序蛋白1（SARM1）屬于Toll/白細(xì)胞介素-1受體（TIR）家族的成員之_[7-8]，作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在調(diào)控神經(jīng)元死亡和免疫應(yīng)答當(dāng)中扮演重要角色[9-11]。有研究表明，SARM1的高表達能夠促進前列腺癌、肺癌以及乳腺癌等腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[12-13]。然而，SARM1在EBV陽性胃癌當(dāng)中的生物學(xué)作用目前尚不清楚。本研究旨在探討EBV對SARM1的調(diào)控關(guān)系及其在EBV陽性胃癌中的作用，為EBV陽性胃癌治療策略的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管、吸頭等實驗材料購自無錫耐思生命科技股份有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司。SARM1抗體購自英國Abcam公司。EB病毒立即早期基因（BZLF1）抗體購自美國Santa Cruz公司。Lipofectamine 2Ooo 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司。 β 連環(huán)蛋白（ β catenin）抗體購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司。鋅指E盒結(jié)合同源框蛋白1（ZEB1）抗體購自美國Protein-tech公司。 β -actin抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。siRNA（si-SARM1-1、si-SARM1-2以及si-NC）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。SARM1重組表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒購自武漢淼靈生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）兔二抗、小鼠二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2患者腫瘤組織中SARM1基因表達水平分析

從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）的GSE51575數(shù)據(jù)集中獲取12例EBV陰性胃癌患者以及12例EBV陽性胃癌患者腫瘤組織基因表達水平相關(guān)數(shù)據(jù)，使用在線工具GEO2R分析SARM1基因表達水平。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究所用的細(xì)胞包括了EBV陰性胃癌細(xì)胞系HGC27、MGC803、AGS和EBV陽性胃癌細(xì)胞系YCCEL1、GT38、GT39、SNU719、AGS-EBV。其中，YCCEL1、HGC27、MGC803、AGS細(xì)胞由北京大學(xué)腫瘤學(xué)系贈予，SNU719細(xì)胞由香港大學(xué)腫瘤學(xué)系贈予，GT38和GT39細(xì)胞由日本鳥取大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系贈予，AGS-EBV細(xì)胞為本實驗室凍存的被EBV感染的AGS細(xì)胞。所有的細(xì)胞均使用含有 10% 胎牛血清以及 1% 青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱 、含體積分?jǐn)?shù)0.05CO₂ ）中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.4 蛋白組學(xué)測序分析

取對數(shù)生長期AGS細(xì)胞和AGS-EBV細(xì)胞，通過串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽TMT標(biāo)記技術(shù)進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，使用R語言limma包篩選差異表達蛋白，每種細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞分組及處理

將AGS細(xì)胞和AGS-EBV細(xì)胞接種于含 10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的6孔板（每孔 1×10⁶ 個細(xì)胞）當(dāng)中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，至對數(shù)生長期時，分為AGS組、 AGS⁺TPA 組、AGS-EBV組和AGS-EBV+TPA 組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。其中，AGS + TPA組和 AGS-EBV+TPA 組細(xì)胞分別在培養(yǎng)基中加人TPA （20μg/L） ，AGS 組和 AGS-EBV組細(xì)胞分別在培養(yǎng)基中加入等體積DMSO。各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗，并收集 ΔAGS+TPA 組和AGS-EBV + TPA組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，經(jīng) 0.22μm PES膜過濾器過濾用于后續(xù)實驗。

AGS細(xì)胞接種于含 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的6孔板（每孔 1×10⁶ 個細(xì)胞）中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達到 50%～60% 時，分為AGS上清組和AGS-EBV上清組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。棄去各組細(xì)胞原培養(yǎng)基，在AGS上清組加入AGS + TPA組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，AGS-EBV上清組加入AGS-EBV+TPA組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

AGS、AGS-EBV細(xì)胞和YCCEL1細(xì)胞接種于含 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的6孔板（每孔1×10⁶ 個細(xì)胞）、96孔板（每孔 3×10⁴ 個細(xì)胞）或24孔板Transwell小室（上室每孔 3×10⁴ 個細(xì)胞）中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約達 80% 時，將AGS細(xì)胞分為si-NC組、si-SARM1-1組和si-SARM1-2組，AGS-EBV細(xì)胞分為AGS-EBV-NC組和AGS-EBV-SARM1組，將YCCEL1細(xì)胞分為YCCEL1-NC組、YCCEL1-SARM1組，6孔板和24孔板中細(xì)胞每組設(shè)置3個復(fù)孔，96孔板中的細(xì)胞每組設(shè)置6個復(fù)孔。各組細(xì)胞均使用Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染，其中，si-NC組、si-SARM1-1組和si-SARM1-2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-SARM1-1、si-SARM1-2，轉(zhuǎn)染濃度均為 50μmol/L ; AGS-EBV-NC組和YCCEL1-NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，AGSEBV-SARM1組以及YCCEL1-SARM1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染SARM1重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染濃度均為 50μmol/ L。6孔板中各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ^48h 后，收集細(xì)胞用于蛋白免疫印跡（WB）實驗；96孔板中的各組細(xì)胞培養(yǎng) 0.24，48，72，96h 以后，用于CCK-8實驗；24孔板Transwell小室中的各組細(xì)胞培養(yǎng)^48h 以后，用于Transwell遷移實驗。

1.6 WB實驗檢測各組細(xì)胞中SARM1、BZLF1、ZEB1、 β catenin蛋白的表達

參照LIU等[14]的實驗方法，提取上述各組細(xì)胞中的總蛋白，進行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入 β? -actin（1：10 000）、SARM1 （1：1000） 、BZLF1（1：1000）、ZEB1（ Φ₁：1000 ）、 β catenin（ （1：1 000） 蛋白一抗， 4^°C 下過夜孵育，二抗室溫?fù)u床孵育 ^2h ，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光采集圖像用于后續(xù)分析。使用ImageJ軟件分析圖像中各蛋白條帶灰度值，以 β- actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達水平。目的蛋白相對表達水平 目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力

取96孔板中培養(yǎng)的各組細(xì)胞，按照CCK-8試劑盒說明書進行操作，于 450nm 波長下檢測各孔的吸光度值，以表示細(xì)胞增殖能力。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.8Transwell遷移實驗檢測各組細(xì)胞遷移情況

取24孔板Transwell小室中培養(yǎng)的各組細(xì)胞，加人甲醇固定 30min ，以 1% 結(jié)晶紫染色 30min ，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件進行計數(shù)，以計算各組細(xì)胞的相對遷移率。相對遷移率 實驗組穿過小室細(xì)胞數(shù)/對照組穿過小室細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPadPrism8.O軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以 x±s 表示，兩組間比較使用 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗，多組間比較使用單因素方法分析；多個時間點組間比較使用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較使用Tukey'sHSD檢驗。以 Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1EBV陰性和陽性胃癌患者的腫瘤組織當(dāng)中SARM1的相對表達水平比較

SARM1在EBV陰性以及EBV陽性胃癌患者腫瘤組織中的相對表達水平分別為 8.00±0.80 和7.10±0.90 ，EBV陽性的胃癌患者的腫瘤組織當(dāng)中SARM1的相對表達水平顯著低于EBV陰性胃癌患者腫瘤組織 （t=2.77，Plt;0.05） L°

2.2各胃癌細(xì)胞系中SARM1表達水平比較

WB實驗的結(jié)果顯示，HGC27、MGC803、YC-CEL1、GT38、GT39、SNU719細(xì)胞中SARM1蛋白的相對表達水平分別為 13.90±1.70.9.50±1.20 11.00±0.00，1.40±0.70，1.50±0.60，1.40±0.40， 各組間比較差異具有顯著性 （F=101.70，Plt;0.05） 。YCCEL1、GT38、GT39、SNU719細(xì)胞中SARM1蛋白相對表達水平顯著低于HGC27、MGC803細(xì)胞0 。見圖1A。

蛋白組學(xué)測序分析結(jié)果顯示，相比于AGS細(xì)胞，AGS-EBV細(xì)胞中有554個差異表達蛋白，包括231個上調(diào)蛋白和323個下調(diào)蛋白；其中，AGS-EBV細(xì)胞中SARM1蛋白表達水平顯著下調(diào)。WB實驗結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞和AGS-EBV細(xì)胞當(dāng)中的SARM1蛋白相對表達水平分別為 1.00±0.00 和0.20±0.02 ，AGS-EBV細(xì)胞中SARM1蛋白相對表達水平顯著低于AGS細(xì)胞 Δ^′t=69.28，Plt;0.05） 。見圖1B。

A： a～f 分別代表YCCEL1、GT38、GT39、SNU719、HGC27、MGC803細(xì)胞；B：a、b分別代表AGS、AGS-EBV細(xì)胞

2.3各組細(xì)胞中SARM1表達水平比較

WB實驗結(jié)果顯示，AGS-EBV組、AGS-EBV + TPA組細(xì)胞中SARM1蛋白的相對表達水平分別為 1.00±0.00 和 0.60±0.10，BZLF1 蛋白相對表達水平分別為 1.00±0.00 和 3.60±0.30 。與AGS-EBV組相比， AGS-EBV+TPA 組中SARM1蛋白相對表達水平顯著下調(diào) （t=6.99，Plt;0.05） ，BZLF1相對表達水平顯著上調(diào) （t=15.09，Plt;0.05） 。AGS組和 AGS⁺TPA 組細(xì)胞中SARM1蛋白相對表達水平分別為 1.00±0.00 和 0.99±0.04，AGS+TPA 組與AGS組細(xì)胞中SARM1蛋白相對表達水平無顯著差異 （Pgt;0.05） 。AGS上清組和 AGS-EBV上清組細(xì)胞中SARM1相對表達水平分別為 1.00± 0.00和 0.50±0.00 ，與AGS上清組相比，AGS-EBV上清組中SARM1蛋白相對表達水平顯著下調(diào)（ ?_t= 93.13，Plt;0.05） 。見圖2。

A：a、b分別代表AGS-EBV組和AGS-EBV + TPA組；B：a、b分別代表AGS組和AGS + TPA組；C：a、b分別代表AGS上清組和AGS-EBV上清組

2.4各組細(xì)胞增殖能力比較

重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，分組、時間、分組與時間的交互作用均對各組吸光度值有明顯影響 （F_3/5/1=19.77～123.80 ！ F_###=366.60～ 2191.00，F(xiàn)_?XU=2.97～26.84，Plt;0.05） ，各時間點各組的吸光度值相比較均具有顯著性差異（ F= 366.60～2191.00，Plt;0.05） 。培養(yǎng)至第72、96小時時，與si-NC組相比，si-SARMl-1組和si-SARM1-2組的吸光度值均有顯著性差異 （q=3.85～7.53，Plt; 0.05）;AGS-EBV-NC組與 AGS-EBV-SARM1組的吸光度值相比均具有顯著性差異 Ω（t=5.34～12.21 .Plt;0.05） ;YCCEL1-NC組與YCCEL1-SARM1組的吸光度值相比均有顯著性差異， （t=8.97～11.55） .Plt;0.05） 。見表 1～3 。

2.5 各組細(xì)胞遷移能力比較

Transwell遷移實驗的結(jié)果顯示，si-NC組、si-SARM1-1組、si-SARM1-2組細(xì)胞的相對遷移率分別為 1.00±0.01，0.47±0.09，0.49±0.05 ，各組間比較差異有顯著性 （F=85.08，Plt;0.05） 。其中，與si-NC組相比，si-SARM1-1組和si-SARM1-2組細(xì)胞的相對遷移率顯著降低（ q=11.57，11.01 ， Plt; 0.05）。AGS-EBV-NC 組和 AGS-EBV-SARM1 組細(xì)胞的相對遷移率分別為 1.00±0.01 和 2.92± 0.19。其中，與AGS-EBV-NC組相比，AGS-EBV-SARM1組細(xì)胞的相對遷移率顯著升高（ Δt=17.09 ，Plt;0.05） 。AGS-EBV-NC組和AGS-EBV-SARM1組的細(xì)胞相對遷移率分別為 1.00±0.01 和 1.47± 0.03。其中，與YCCEL1-NC組相比較，YCCEL1-SARM1組細(xì)胞的相對遷移率顯著升高 Ω_t=25.39 ，Plt;0.05） 。見圖 3～5 。

A、B分別代表AGS-EBV + NC組和AGS-EBV + SARM1組；結(jié)晶紫染色，200倍

A、B分別代表YCCEL1 + NC組和YCCEL1-SARM1組；結(jié)晶紫染色，200倍

WB實驗結(jié)果顯示，si-NC組、si-SARM1-1組和si-SARM1-2 組間 SARM1、ZEB1、 β catenin的相對表達水平均有顯著性差異 F=22.70～295.90 Plt;0.05） 。其中，與si-NC組相比，si-SARMl-1組和si-SARM1-2組細(xì)胞中SARM1、ZEB1、 β -catenin的相對表達水平均顯著降低 （q=5.21～22.39，Plt; 0.05）。詳見表4、圖6。AGS-EBV-NC組和AGS-EBV-SARM1組細(xì)胞中SARM1的相對表達水平分別為 1.00±0.01 和 2.47±0.16，2EB1 的相對表達水平分別為 1.00±0.01 和 1.85±0.06，β -catenin的相對表達水平分別為 1.00±0.01 和 1.76±0.05 。與AGS-EBV-NC組相比，AGS-EBV-SARM1組細(xì)胞中 SARM1、ZEB1、 β -catenin的相對表達水平均顯著升高 （t=15.82～26.49，Plt;0.05） 。YCCEL1-NC組和YCCEL1-SARM1組細(xì)胞中SARM1的相對表達水平分別為 1.00±0.01 和 2.00±0.25，ZEB1 的蛋白相對表達水平分別為 1.00±0.01 和 1.44±0.11 ，β -catenin的蛋白相對表達水平分別為 1.00±0.01 和 1.41±0.13 。與YCCEL1-NC組相比，YCCEL1-SARM1組細(xì)胞中 SARM1、ZEB1、 β -catenin的相對表達水平均顯著升高（ t=5.63～7.19. Plt;0.05） 。見圖7。

3討論

EBV是人類最早發(fā)現(xiàn)的致瘤病毒，也是少數(shù)能在體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞的病原體之一[15]。EBV與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EBV陽性胃癌約占所有胃癌病例的 10%^[2，16] 。EBV 陽性胃癌起源于EBV感染細(xì)胞的單克隆性增生，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞均可檢測到 EBV基因組[17-18]。相比于EBV 陰性胃癌患者，EBV 陽性胃癌患者的預(yù)后較好[3，19-20]。EBV在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍有待闡明[21]。SARM1是一種在神經(jīng)元細(xì)胞中高度表達的蛋白質(zhì)，主要參與調(diào)控軸突退化和神經(jīng)損傷后的細(xì)胞程序性死亡過程[22-23]。研究表明，SARM1在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。SARM1可與前列腺癌細(xì)胞中的lncRNAOGFRP1相互作用，調(diào)控miR-124-3p 的表達，進而促進腫瘤細(xì)胞增殖[12]；SARM1的表達水平與宮頸癌細(xì)胞系HeLa的遷移能力呈正相關(guān)[24]；此外，SARM1還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，調(diào)控宮頸癌細(xì)胞系HeLa的遷移和侵襲過程[25]。本研究中，對GEO數(shù)據(jù)庫中GSE51575數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果顯示，與EBV陰性胃癌患者的腫瘤組織相比較，EBV陽性的胃癌患者的腫瘤組織中SARM1的表達顯著降低；WB實驗以及蛋白組學(xué)測序結(jié)果顯示，SARM1在EBV陽性胃癌細(xì)胞系（YCCEL1、GT38、GT39、SNU719、AGS-EBV）當(dāng)中的表達顯著低于EBV陰性胃癌細(xì)胞系（HGC27、MGC803、AGS）。這些結(jié)果提示EBV可能調(diào)控胃癌細(xì)胞中SARM1的表達。

TPA處理EBV陽性胃癌細(xì)胞可誘導(dǎo)其細(xì)胞內(nèi)的EBV進入裂解期，EBV編碼的BZLF1等立即早期基因表達增加，EBV 復(fù)制增多[26-27]。本研究中，與AGS-EBV組相比，AGS-EBV + TPA組細(xì)胞中BZLF1的表達顯著升高，SARM1的表達顯著降低；而與AGS組相比， ΔAGS+TPA 組細(xì)胞中SARM1的表達則無明顯變化。TPA處理導(dǎo)致EBV進人裂解期，會導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中EBV數(shù)量增加，因此本研究使用AGS-EBV + TPA組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液培養(yǎng)AGS細(xì)胞，通過觀察上清液中EBV對SARM1表達水平的影響，從而進一步證實EBV對SARM1的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，與AGS上清組相比，AGS-EBV上清組中SARM1的表達顯著降低。上述結(jié)果提示，EBV感染能夠下調(diào)胃癌細(xì)胞當(dāng)中SARM1的表達水平，當(dāng)EBV進入裂解期時，其對SARM1的調(diào)控作用更為明顯。

本研究通過在EBV陰性或者陽性胃癌細(xì)胞系中敲低或者過表達SARM1的方式，從而進一步明確SARM1在EBV陽性胃癌中的具體生物學(xué)功能。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-SARM1-1組和si-SARM1-2組細(xì)胞在培養(yǎng)第72小時和第96小時時的吸光度值顯著降低，即細(xì)胞增殖能力顯著降低；分別與AGS-EBV-NC組、YCCEL1-NC組相比，AGS-EBV-SARM1組、YCCEL1-SARM1組細(xì)胞在培養(yǎng)第72小時和第96小時時的吸光度值顯著升高，即細(xì)胞增殖能力顯著增強。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-SARM1-1組和si-SARM1-2組細(xì)胞遷移能力均顯著性降低；分別與AGS-EBV-NC組、YCCEL1-NC組進行比較，AGS-EBV-SARM1組、YCCEL1-SARM1組的細(xì)胞遷移能力均顯著性增強。以上的結(jié)果提示，干擾SARM1表達可使EBV陰性胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力減弱，過表達SARM1可促進EBV陽性胃癌細(xì)胞增殖和遷移。

ZEB1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指蛋白家族，主要通過結(jié)合E-box序列調(diào)控靶基因的表達。ZEB1參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，其可通過抑制E -cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的表達，促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[28]。研究表明，ZEB1可通過調(diào)控下游Vimentin基因的表達，促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[29]。 β -catenin是一種多功能蛋白，主要參與上皮細(xì)胞黏附過程。 ΔWnt 信號通路的激活能夠促進 β -catenin細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子與T細(xì)胞因子/淋巴增強子結(jié)合因子結(jié)合，調(diào)控多種基因的表達，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移[30-31]ZEB1 和 β -catenin在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移時具有協(xié)同作用。研究表明，ZEB1的上調(diào)與 β -catenin的激活可形成正反饋回路，進而促進乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[32]。上述研究表明，ZEB1 和 β catenin及兩者之間的相互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-SARM1-1組和si-SARM1-2組細(xì)胞中ZEB1和 β -catenin的表達顯著降低；然而分別與AGS-EBV-NC組、YCCEL1-NC組進行比較，AGS-EBV-SARM1組、YCCEL1-SARM1組細(xì)胞中ZEB1和 β -catenin的表達顯著升高。這些結(jié)果提示，SARM1與胃癌細(xì)胞中ZEB1和β -catenin的表達呈正相關(guān)。

本研究的主要局限性在于沒有明確EBV調(diào)控SARM1的具體機制。EBV對SARM1表達的調(diào)控可能涉及到多個信號通路和分子機制。研究表明，EBV感染可通過上調(diào)脂肪酸合成酶等關(guān)鍵代謝酶，增強腫瘤細(xì)胞內(nèi)的脂代謝[33]，而這一過程可能為EBV病毒復(fù)制和腫瘤細(xì)胞增殖提供有利條件；此外，EBV感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1O等多種細(xì)胞因子，從而參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[34]；EBV感染還可通過影響宿主細(xì)胞DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控基因的表達[35]。EBV 感染抑制SARM1表達的具體調(diào)控機制有待進一步研究證實。

綜上所述，EBV陽性胃癌細(xì)胞中SARM1的表達顯著降低，EBV可能通過抑制SARM1的表達進而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，靶向抑制SARM1的表達可能是EBV陽性胃癌患者臨床治療的潛在策略和新思路。

作者聲明：所有作者均參與了研究設(shè)計及論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 李京蔓 厲建強）